專(zhuān)利名稱(chēng)：同時(shí)檢測(cè)乙醛脫氫酶2和乙醇脫氫酶2基因突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)乙醛脫氫酶2(ALDH2)和乙醇脫氫酶2 (ADH2)基因突變的方法，以及用于該檢測(cè)方法的核酸探針和試劑盒。
背景技術(shù)：
關(guān)于乙醇代謝的具有代表性的酶有ADH(Alcohol ehydrogenase,乙醇脫氫酶)和ALDH(Aldehyde dehydrogenase,乙醛脫氫酶)。其中，ADH將乙醇代謝為乙醛，ALDH將乙醛代謝為乙酸。ADH存在ADH1、ADH2、ADH3三種，與ADH2基因表現(xiàn)型相關(guān)的基因多態(tài)性中存在ADH2*1(WT)、ADH2*2、ADH2*3(非專(zhuān)利文獻(xiàn) I)。日本人中的頻率為 *1/*1 8. 4%, *1/*2 34. 9%，*2/*2 56. 7%，幾乎不存在*3 (非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。 與ALDH2基因表現(xiàn)型相關(guān)的基因多態(tài)性中的*1(WT)、*2(非專(zhuān)利文獻(xiàn)I)在日本人中的頻率為 *1/*1 52. 8%，*1/*2 40. 9%, *2/*2 6. 3% (非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2)。已經(jīng)報(bào)告了這些基因多態(tài)性中，ADH2*2和ALDH2與酒精依賴(lài)癥、肝病、胰腺癌等相關(guān)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)I，3)。而且，關(guān)于CYP2E1，也有報(bào)告了其具有和ADH2以及ALDH2相同的功能(非專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。專(zhuān)利文獻(xiàn)I記載了用于通過(guò)雜交法檢測(cè)與乙醇代謝能力以及耐受性相關(guān)的基因(ALDH2、ADH2和CYP2E1基因)突變的引物組和探針組。但是，存在以下問(wèn)題(I)對(duì)于與乙醇代謝等相關(guān)的突變的每I突變都需要一個(gè)反應(yīng)體系(I試管)，需要人力、費(fèi)用和時(shí)間；
(2)必須使用從唾液、全血精制的DNA，需要人力、費(fèi)用和時(shí)間，不能簡(jiǎn)易地進(jìn)行測(cè)定；(3)由于進(jìn)行微陣列(microarray)時(shí)需要處理擴(kuò)增產(chǎn)物，因此存在擴(kuò)增產(chǎn)物混入其他樣品的危險(xiǎn);等等。另一方面，已知如下方法對(duì)含有突變的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，使用熒光染料標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，根據(jù)熔解曲線(xiàn)分析的結(jié)果來(lái)分析突變的方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)2、3)。但是，這些文獻(xiàn)中，關(guān)于探針的設(shè)計(jì)，僅給出了這樣的啟示將探針設(shè)計(jì)為當(dāng)末端部用熒光染料標(biāo)記了的淬滅探針與目標(biāo)核酸發(fā)生了雜交時(shí)，末端部分中探針-核酸雜交體的多個(gè)堿基對(duì)形成至少一個(gè)為G和C對(duì)。另外，這些方法存在實(shí)施時(shí)無(wú)法對(duì)于全部的任意序列實(shí)施的問(wèn)題?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)I :日本專(zhuān)利特開(kāi)2008-79604號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :日本專(zhuān)利特開(kāi)2001-286300號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3 :日本專(zhuān)利特開(kāi)2002-119291號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)I :Hepatrogy Volume 23, Issue 2, pages 234-239, February 1996,F Tanaka 等.非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :第15屆血壓管理研究會(huì)演講題目3工夕7 — >代謝酵素^飲酒七血壓i ^関連&修飾+ 3力、？(乙醇代謝酶是否修飾飲酒和血壓的關(guān)系？)齋藤京子等(http://www. healthcare, omron. co. jp/medical/study/pdf/pastl5_03. pdf)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 :上原紀(jì)念生命科學(xué)財(cái)團(tuán)研究報(bào)告書(shū)，23 (2009)，脾臟力5 k摧患V ^ 関+ 3遺伝的背景i飲酒習(xí)慣Q影響f評(píng)価+石分子疫學(xué)研究(評(píng)價(jià)與罹患胰腺癌
風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的遺傳背景和飲酒習(xí)慣的影響的分子免疫學(xué)研究)，松尾惠太郎等(http://ueharazaidan.yoshidap.net/houkokushu/Vol. 23/pdf/046_report.pdf)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題在于，確定一種對(duì)于檢測(cè)乙醛脫氫酶2(ALDH2)的基因多態(tài)性rs671和乙醇脫氫酶2 (ADH2)的基因多態(tài)性rs 1229984有效的探針，提供一種同時(shí)檢測(cè)這些基因多態(tài)性的方法、以及用于此目的的試劑盒。解決問(wèn)題的手段本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)基于含有乙醛脫氫酶2 (ALDH2)的基因多態(tài)性rs671和乙醇脫氫酶2(ADH2)的基因多態(tài)性rsl229984的特定區(qū)域而設(shè)計(jì)探針，并通過(guò)使用該探針進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，能夠檢測(cè)出對(duì)應(yīng)突變，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明如下所述。(I) 一種多態(tài)性檢測(cè)用探針，其為用于檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組中的至少一種基因多態(tài)性的探針，其特征在于，所述探針由選自下述(Pl)至(P3’ )中至少一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸構(gòu)成(Pl)寡核苷酸具有與序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第241 251位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，并且與第241位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P1’)寡核苷酸具有與序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第241 251位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的序列，并且與第241位對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P2)寡核苷酸具有序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第251 261位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列或與其同源的序列，并且與第261位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P2’)寡核苷酸具有與序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第251 261位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的序列，并且與第261位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P3)寡核苷酸具有序列編號(hào)13所示的堿基序列中的、含有第201 212位的堿基的12 50喊基長(zhǎng)的喊基序列或者與其同源的序列，并且與第212位的喊基對(duì)應(yīng)的喊基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P3’ )寡核苷酸具有與序列編號(hào)13所示的堿基序列中的、含有第201 212位的堿基的12 50堿基長(zhǎng)的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的序列，并且與第212位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。(2)如⑴所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，(Pl)和(P1’)寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I 3位的位置具有用熒光染料標(biāo)記的與第241位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基；(P2)和(P2’)寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I 3位的位置具有用熒光染料標(biāo)記的與第261位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基；(P3)和(P3’)寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I 3位的位置具有用熒光染料標(biāo)記的與第212位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基。(3)如⑴所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，(Pl)和(P1’)寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的與第241位的堿基對(duì)應(yīng) 的喊基；(P2)和(P2’)寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的與第261位的堿基對(duì)應(yīng)的喊基；(P3)和(P3’)寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的與第212位的堿基對(duì)應(yīng)的喊基。(4)如(I) (3)中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述寡核苷酸在未與目標(biāo)序列雜交時(shí)發(fā)出熒光，且在與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度減少或增加。(5)如(4)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述寡核苷酸在與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度減少。(6)如⑴ (5)中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，(Pl)至(P3’ )寡核苷酸的堿基長(zhǎng)度為12 30。(7)如⑴ (5)中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，(Pl)至(P3’ )寡核苷酸的堿基長(zhǎng)度為15 30。(8)如⑴ (5)中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，(Pl)至(P3’ )寡核苷酸的堿基長(zhǎng)度為18 30。(9)如⑴ ⑶中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述探針為用于熔解曲線(xiàn)分析的探針。(10)用于檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組的至少一種多態(tài)性的方法，其特征在于，使用(I) (9)中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針中的至少一種。(11)如(10)所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，包括(I)使(I) (9)任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針與試樣中的單鏈核酸接觸，使所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與所述單鏈核酸雜交，來(lái)獲得雜交體形成體；(II)通過(guò)改變含有所述雜交體形成體的試樣的溫度，將所述雜交體形成體解離，測(cè)定基于所述雜交體形成體的解離的熒光信號(hào)的變動(dòng)；(III)基于所述信號(hào)的變動(dòng)來(lái)確定雜交體形成體的解離溫度、即Tm值；以及(IV)基于所述Tm值，確定選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組的一種以上的多態(tài)性的存在或具有多態(tài)性的核酸的豐度比。
(12)如(11)所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，還包括在所述步驟⑴之前或與步驟⑴同時(shí)擴(kuò)增核酸。(13) —種方法，包括通過(guò)(10) (12)中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，來(lái)檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組的一種以上的多態(tài)性的步驟；以及基于多態(tài)性的有無(wú)，來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)乙醇的代謝能力和/或判定耐受性的步驟。(14) 一種多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒，其用于檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組中的一種以上的多態(tài)性，所述試劑盒包含權(quán)利要求I 9中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針。 (15)如(14)所述的多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒，還包含能夠以序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中含有與所述(Pl)、(PI’)、(P2)或(P2’)寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增的引物，以及能夠以序列編號(hào)13所示的堿基序列中含有與所述(P3)或(P3’)寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增的引物。(16) 一種方法，其特征在于，使用多態(tài)性檢測(cè)用引物和⑴ (9)中任意一項(xiàng)所述的探針，其中，所述多態(tài)性檢測(cè)用引物為用于檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組中的一種以上的多態(tài)性的引物，所述引物的特征在于包括(P4)、(P5)和/或(P6)、(P7)寡核苷酸，(P4)寡核苷酸具有序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第89 109位的喊基的喊基長(zhǎng)度為21 60喊基長(zhǎng)的喊基序列；(P5)寡核苷酸具有與序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第388 407位的堿基的堿基長(zhǎng)度為20 60堿基長(zhǎng)的堿基序列互補(bǔ)的序列；(P6)寡核苷酸具有序列編號(hào)13所示的堿基序列中的、含有第93 138位的堿基的喊基長(zhǎng)度為46 60喊基長(zhǎng)的喊基序列；(P7)寡核苷酸具有與序列編號(hào)13所示的堿基序列中的、含有第214 238位的堿基的堿基長(zhǎng)度為25 60堿基長(zhǎng)的堿基序列互補(bǔ)的序列。(17)評(píng)價(jià)針對(duì)乙醇的代謝能力和/或判定耐受性的方法，包括通過(guò)(16)所述的方法，檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組中的一種以上的多態(tài)性的步驟，以及基于多態(tài)性的有無(wú)，評(píng)價(jià)針對(duì)乙醇的代謝能力和/或判定耐受性的步驟。(18) 一種試劑盒，其用于檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組中的一種以上的多態(tài)性，其特征在于，所述試劑盒包含(I) (9)中任意一項(xiàng)所述的探針、以及含有(16)所述的(P4)和(P5)以及/或者(P6)和(P7)寡核苷酸的引物。發(fā)明效果通過(guò)本發(fā)明的探針能夠同時(shí)并且明確地檢測(cè)出乙醛脫氫酶2(ALDH2)的基因多態(tài)性rs671和乙醇脫氫酶2(ADH2)的基因多態(tài)性rsl229984。由于臨床上也需要確認(rèn)ALDH2和ADH2的基因突變，因此能夠同時(shí)檢測(cè)兩種突變大有意義。通過(guò)添加本發(fā)明的探針來(lái)進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析(Tm分析)，就能夠同時(shí)檢測(cè)ALDH2和ADH2的基因多態(tài)性。通過(guò)使用本發(fā)明的方法，即使在進(jìn)行PCR擴(kuò)增的情況下，也由于無(wú)需提取擴(kuò)增產(chǎn)物，因此幾乎沒(méi)有污染的危險(xiǎn)性。此外，本發(fā)明的方法，操作簡(jiǎn)單，容易自動(dòng)化操作。在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，可以將未精制的唾液、全血中原本含有的核酸作為模板使用。


圖I :示出實(shí)施例I中的Tm分析中每單位時(shí)間的TAMRA熒光強(qiáng)度的變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)和溫度CC )關(guān)系。其中，探針使用3T-ALDH2*2-wt-Rl-21，模板使用了ALDH2*1F50 (野生型)和ALDH2*2F50 (突變型)，熒光染料使用了 TAMRA?？v軸為每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度的變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)，橫軸為溫度(°C)。下面各圖中，示出以不同的模板和熒光染料的組合進(jìn)行相同試驗(yàn)的結(jié)果。圖2 :實(shí)施例I中的探針使用了 3T-ALDH2*2-mt-Fl-21，模板使用了 ALDH2*1R50 (野生型)和ALDH2*2R50 (突變型)，熒光染料使用了 TAMRA。圖3 :實(shí)施例I中的探針使用了 3T-ALDH2*2_wt-R3-20，模板使用了ALDH2*1F50 (野生型)和ALDH2*2F50 (突變型)，熒光染料使用了 TAMRA。圖4 :比較例I中的探針使用了 5T-ALDH2*2-wt-R2_19，模板使用了ALDH2*1F50 (野生型)和ALDH2*2F50 (突變型)，熒光染料使用了 TAMRA。圖5A :實(shí)施例2中的探針使用了 3FL-ADH2-WT-F3，模板使用了 ADH2*1_R50 (野生型)和ALDH2*2-R50 (突變型)，熒光染料使用了 BODIPY FL0圖5B :為放大了圖5A的熒光強(qiáng)度的變化量的比例的圖。圖6A 比較例2中的探針使用了 3FL-ADH2-mt-Fl，模板使用了 ADH2*1_R50 (野生型)和ADH2*2-R50 (突變型)，熒光染料使用BODIPY FL0圖6B :為放大了圖6A的熒光強(qiáng)度的變化量的比例的圖。圖7A 比較例2中的探針使用了 3FL-ADH2-mt-F2，模板使用了 ADH2*1_R51 (野生型)和ADH2*2-R51 (突變型)，熒光染料使用了 BODIPY FL0圖7B :為放大了圖7A的熒光強(qiáng)度的變化量的比例的圖。圖8A :實(shí)施例3中的探針使用了 3T-ALDH2*2-mt-Fl-21，模板使用了口腔拭子，熒光染料使用了 TAMRA圖8B 實(shí)施例3中的探針使用了 3FL-ADH2-WT-F3，模板使用了口腔拭子，熒光染料使用了 BODIPY FL0圖9A :實(shí)施例3中的探針使用了 3T-ALDH2*2-mt-Fl-21，試樣使用了全血，熒光染料使用TAMRA。圖9B :實(shí)施例3中的探針使用了 3T-ADH2-WT-F3，試樣使用了全血，熒光染料使用了 BODIPY FL0圖IOA :實(shí)施例3中的探針使用了 3T-ALDH2*2-mt-Fl-21，試樣使用了精制DNA，熒光染料使用了 TAMRA。圖IOB :實(shí)施例3中的探針使用3T-ADH2-WT-F3，試樣使用了精制DNA，熒光染料使用了 BODIPY FL0
具體實(shí)施例方式〈1>本發(fā)明探針和本發(fā)明檢測(cè)方法本發(fā)明探針為多態(tài)性檢測(cè)用探針，其為用于檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組中的至少一種基因多態(tài)性的探針，其特征在于，所述探針包括選自下述(Pl)至(P3’ )的至少一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸(Pl)寡核苷酸具有與序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第241 251位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，并且與第241位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P1’)寡核苷酸具有與序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第241 251位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的序列，并且與第241位對(duì)應(yīng)的 堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P2)寡核苷酸具有序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第251 261位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列或與其同源的序列，并且與第261位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P2’)寡核苷酸具有與序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第251 261位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的序列，并且與第261位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P3)寡核苷酸具有序列編號(hào)13所示的堿基序列中的、含有第201 212位的堿基的12 50喊基長(zhǎng)的喊基序列或者與其同源的序列，并且與第212位的喊基對(duì)應(yīng)的喊基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P3’ )寡核苷酸具有與序列編號(hào)13所示的堿基序列中的、含有第201 212位的堿基的12 50堿基長(zhǎng)的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的序列，并且與第212位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。其中，ALDH2的基因多態(tài)性rs671為序列編號(hào)1、2的第251位的堿基。此外，ADH2的基因多態(tài)性rsl229984為序列編號(hào)13、14的第201位的堿基，它們的rs號(hào)是國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)的 dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(//www. ncbi. nlm. nih. gov/pro jects/SNP/)的登錄號(hào)石馬。本發(fā)明的探針除了具有序列編號(hào)I所示的堿基序列(含有ALDH2基因野生型堿基的序列)或序列編號(hào)2所示的堿基序列(含有ALDH2基因突變型(多態(tài)性)堿基的序列)中由上述確定的序列、具有序列編號(hào)13所不的喊基序列(含有ADH2基因野生型喊基的序列)中由上述所確定的序列以外，可以采取與專(zhuān)利文獻(xiàn)2、3記載的同樣的方法制作。本發(fā)明中的“同源的序列”是指在特定的堿基序列中，具有與堿基序列的互補(bǔ)鏈具有例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性的序列的堿基序列。在本申請(qǐng)中，也可以具有100%的同一性。本申請(qǐng)中的雜交可以根據(jù)公知的方法或者以其為標(biāo)準(zhǔn)的方法，例如MolecularCloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中記載的方法等進(jìn)行。該文獻(xiàn)經(jīng)此引用并入本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)。本申請(qǐng)所謂“嚴(yán)謹(jǐn)條件”意指形成特異的雜交體，而不形成非特異的雜交體的條件。典型的“嚴(yán)謹(jǐn)條件”例如可以舉出，鉀離子濃度為約25mM 約50mM以及鎂離子的濃度為約I. OmM 約5. OmM中進(jìn)行雜交的條件。本發(fā)明的條件的一個(gè)示例可以舉出Tris-HCl (pH8. 6)、25mM KCl以及I. 5mM MgCl2中進(jìn)行雜交的條件。但是，本發(fā)明不限于此。此外，嚴(yán)謹(jǐn)條件記載在Molecular Cloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring HarborLab. Press, 2001)中。此文獻(xiàn)經(jīng)此引用并入本申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)改變雜交反應(yīng)、雜交反應(yīng)液的鹽濃度等，容易對(duì)于這些條件做出選擇。作為上述熒光標(biāo)記寡核苷酸中的熒光標(biāo)記寡核苷酸，除了寡核苷酸之外，也包含經(jīng)修飾的寡核苷酸。所述寡核苷酸的構(gòu)成單位例如可以舉出核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、人工核酸等。所述人工核酸例如可以舉出DNA、RNA、作為RNA類(lèi)似物的LNA(鎖核酸)；作為肽核酸的PNA(Peptide Nucleic Acid);作為交聯(lián)核酸的BNA(橋聯(lián)核酸)等。所述寡核苷酸可以由所述構(gòu)成單位中的一種構(gòu)成，也可以由多種構(gòu)成。
本發(fā)明的(Pl)和(P1’)探針表示如下序列與含有第241 251位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列互補(bǔ)的序列，與序列編號(hào)I或2互補(bǔ)的序列具有同源性的序列。即，本發(fā)明的(Pl)和(Pr )探針與含有第241 251位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列互補(bǔ)，但是，可以不完全互補(bǔ)。另外，與第241位對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并被熒光標(biāo)記。本發(fā)明的(P2)和(P2’)探針表示如下序列含有第251 261位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列，相對(duì)于序列編號(hào)I或2具有同源性的序列。S卩，本發(fā)明的(P2)和(P2’)探針與第251 261位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列同源，但是，可以不完全相同。另外，與第261位對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并被熒光標(biāo)記。本發(fā)明的(P3)和(P3’)探針表示如下序列含有第201 212位的堿基的12 50堿基長(zhǎng)的堿基序列，相對(duì)于序列編號(hào)13具有同源性的序列。S卩，本發(fā)明的(P3)和(P3’)探針與含有第201 212位的堿基的12 50堿基長(zhǎng)的堿基序列同源，但是，可以不完全相同。另外，與第212位對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并被熒光標(biāo)記。本發(fā)明的探針長(zhǎng)度，(Pl)至(P3’)都可以為11 50堿基長(zhǎng)、12 30堿基長(zhǎng)、15 30喊基長(zhǎng)、18 30喊基長(zhǎng)。本發(fā)明中所用的用于檢測(cè)ALDH2的基因多態(tài)性rs671的探針的堿基序列可以為5，-gttttcacttCagtgtatgcc-3’ (序列編號(hào) 3)，5，-ggcatacactAaagtgaaaac-3，(序列編號(hào)
4),5’ -ttttcacttTagtgtatgcc-3’(序列編號(hào)5)。其中，大寫(xiě)字母所示堿基為突變位點(diǎn)。作為本發(fā)明所用的用于檢測(cè)ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的探針的堿基序列的示例，可以舉出5’ -TCTGTCNCACGGATGACC-3’ (序列編號(hào)15)。序列中，“N”代表a、t、g或Co 更優(yōu)選為 5’ -TCTGTCGCACGGATGACC-3’(序列編號(hào) 16)。作為熒光染料，可以使用專(zhuān)利文獻(xiàn)2、3記載的熒光染料。具體示例可以為PacificBlue (商標(biāo))、FAM(商標(biāo))、TAMRA(商標(biāo))、B0DIPY FL(商標(biāo))等?？梢园凑粘Ｓ玫姆椒?例如專(zhuān)利文獻(xiàn)2、3記載的方法)將熒光染料結(jié)合至寡核苷酸。本發(fā)明的探針例如為未與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光染料發(fā)出熒光，與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光染料的熒光減少或增加的探針。例如為未雜交時(shí)熒光染料發(fā)出熒光，雜交時(shí)，熒光染料的熒光淬滅的淬滅探針。此外，本發(fā)明的探針例如為從3 ’末端起數(shù)第I 3位的堿基用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，或者3’末端用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。而且，本發(fā)明的探針中用熒光染料標(biāo)記的堿基，為序列編號(hào)I或2中的第241位的堿基或第261位的堿基。此外，在序列編號(hào)13或14中被標(biāo)記的堿基為第212位的堿基。本發(fā)明的檢測(cè)方法的特征在于，使用本發(fā)明的探針，并包括以下步驟(I)使本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針與試樣中的單鏈核酸接觸，使所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與所述單鏈核酸發(fā)生雜交，獲得雜交體形成體；(II)通過(guò)改變含有上述雜交體試樣的溫度，使上述雜交體解離，測(cè)定基于上述雜交體形成體的解離的熒光信號(hào)的變動(dòng)；(III)根據(jù)上述信號(hào)的變化，確定雜交體形成體的解離溫度、即Tm值；以及(IV)根據(jù)上述Tm值，確定選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多 態(tài)性rsl229984的組中至少一種以上的多態(tài)性的存在或具有多態(tài)性的核酸的豐度比。本發(fā)明的檢測(cè)方法，除使用本發(fā)明的探針外，可以采用常用的核酸擴(kuò)增以及熔解曲線(xiàn)分析(Tm分析)的方法進(jìn)行。而且，本發(fā)明的檢測(cè)方法也可以包括在進(jìn)行上述步驟(I)之前或進(jìn)行步驟(I)的同時(shí)，擴(kuò)增核酸。作為核酸的擴(kuò)增方法，優(yōu)選為使用聚合酶的方法，例如PCR、ICAN、LAMP等。通過(guò)使用聚合酶的方法進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，優(yōu)選在本發(fā)明探針存在下進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)所用探針，對(duì)擴(kuò)增的反應(yīng)條件進(jìn)行調(diào)整，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是容易的。由此，由于通過(guò)在核酸擴(kuò)增后對(duì)探針的Tm值進(jìn)行分析，因此反應(yīng)結(jié)束后無(wú)須精制擴(kuò)增產(chǎn)物。這樣就不必?fù)?dān)心擴(kuò)增產(chǎn)物帶來(lái)的污染。而且，在與擴(kuò)增所需的儀器相同的容器內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)須移動(dòng)容器。這樣，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。本發(fā)明中，試樣中的DNA可以是單鏈DNA，也可以是雙鏈DNA。上述DNA為雙鏈時(shí)，例如優(yōu)選包括在進(jìn)行雜交步驟之前，通過(guò)加熱使上述試樣中的雙鏈DNA解離的步驟。通過(guò)將雙鏈DNA解離為單鏈DNA，在接下來(lái)的雜交步驟中，能夠與檢測(cè)用探針發(fā)生雜交。本發(fā)明中，本發(fā)明所用探針相對(duì)于上述試樣DNA的添加比例(摩爾比)無(wú)特別限制，但是從充分確保檢測(cè)信號(hào)的觀點(diǎn)來(lái)說(shuō)，例如相對(duì)于試樣中DNA的I倍以下或者為0. I倍以下。此時(shí)，試樣中的DNA，可以為產(chǎn)生了檢測(cè)目標(biāo)多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)象DNA和未產(chǎn)生上述多態(tài)性的非檢測(cè)對(duì)象DNA的合計(jì)，也可以為含有產(chǎn)生了檢測(cè)目標(biāo)多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物和含有未產(chǎn)生上述多態(tài)性的非檢測(cè)對(duì)象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的合計(jì)。此外，試樣DNA中上述檢測(cè)對(duì)象DNA的比例，一般是未知的。但是，在結(jié)果上，上述探針相對(duì)于檢測(cè)對(duì)象DNA(含有檢測(cè)對(duì)象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物)的添加比例(摩爾比)，例如為10倍以下，或者為5倍以下，或者為3倍以下。另外，對(duì)于其下限無(wú)特別限制，可以為0. 001倍以上、0. 01倍以上或者0. I倍以上。本發(fā)明的探針相對(duì)于上述DNA的添加比例，可以為相對(duì)于雙鏈DNA的摩爾比，也可以為相對(duì)于單鏈DNA的摩爾比。對(duì)Tm值進(jìn)行說(shuō)明。當(dāng)對(duì)含有雙鏈核酸的溶液進(jìn)行加熱時(shí)，260nm處的吸光度會(huì)升高。這是由于，加熱使雙鏈DNA的兩鏈之間的氫鍵發(fā)生斷裂，解離為單鏈DNA(DNA的熔解)的緣故。并且當(dāng)全部的雙鏈DNA解離為單鏈DNA時(shí)，其吸光度值顯示加熱開(kāi)始時(shí)的吸光度值(僅有雙鏈DNA的吸光度)的大約I. 5倍，基于此判斷熔解完全。根據(jù)這一現(xiàn)象，通常將熔解溫度Tm值一般定義為吸光度達(dá)到吸光度上升總量的50%時(shí)的溫度。在本發(fā)明中，可以基于前面所述的原理測(cè)定260nm的吸光度來(lái)進(jìn)行伴隨溫度變化信號(hào)的變化的測(cè)定，以確定Tm值。優(yōu)選測(cè)定如下信號(hào)所述信號(hào)是基于添加于本發(fā)明的探針的標(biāo)記的信號(hào)的信號(hào)、并且根據(jù)DNA與探針的雜交體形成的狀態(tài)而變動(dòng)。因此，作為本發(fā)明的探針優(yōu)選使用前述的標(biāo)記探針。上述標(biāo)記探針例如可以為未與目標(biāo)序列發(fā)生雜交時(shí)發(fā)出熒光，且與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度減弱(淬滅)的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針；或未與目標(biāo)序列雜交時(shí)發(fā)出熒光，而與目標(biāo)序列雜交時(shí)，熒光強(qiáng)度增加的熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針；前者那樣的探針與檢測(cè)對(duì)象序列形成雜交體(雙鏈DNA)時(shí)，不顯示信號(hào)或信號(hào)弱，通過(guò)加熱探針游離時(shí)即出現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)或信號(hào)增加。另外，后者所述的探針與檢測(cè)對(duì)象序列形成雜交體(雙鏈DNA)時(shí)顯示信號(hào)，而通過(guò)加熱探針游離時(shí)信號(hào)減少(消失)。因此，通過(guò)在信號(hào)特有的條件(吸光度等)下檢測(cè)基于這種標(biāo)記的信號(hào)變化，能夠與前述進(jìn)行260nm的吸光度測(cè)定一樣，進(jìn)行熔解和測(cè)定Tm值。用于標(biāo)記探針的標(biāo)記物質(zhì)，可以為如前所述，優(yōu)選熒光染料標(biāo)記探針。核酸擴(kuò)增時(shí)的模板核酸，含有核酸即可，無(wú)特別限制，其可以為血液、口腔粘膜混懸液、指甲或毛發(fā)等體細(xì)胞、生殖細(xì)胞、乳汁、腹水液，石蠟包埋組織、胃液、胃洗液、腹膜液、羊水、細(xì)胞培養(yǎng)等任意來(lái)源或可來(lái)源于生物的試樣?？梢詫?lái)自上述來(lái)源的模板核酸直接，或?yàn)榱烁淖冊(cè)撛嚇犹匦远陬A(yù)處理后進(jìn)行使用。 下面以應(yīng)用PCR的情況為例，進(jìn)一步進(jìn)行說(shuō)明。PCR所用的引物對(duì)，能夠擴(kuò)增與本發(fā)明探針發(fā)生雜交的區(qū)域，而且可以與常用PCR引物對(duì)的設(shè)計(jì)方法對(duì)引物對(duì)同樣地進(jìn)行設(shè)定。引物的長(zhǎng)度以及Tm值，一般為，12mer 40mer、40 70°C,或者為16mer 30mer、55 60°C。引物對(duì)中各引物的長(zhǎng)度可以不相同，但是優(yōu)選為，兩個(gè)引物的Tm值基本相同(一般相差在2°C內(nèi))。而且,Tm值可以是通過(guò)最鄰近堿基對(duì)法(Nearest Neighbor)計(jì)算得出的值。作為引物對(duì)的一個(gè)示例，可以舉出由含有序列編號(hào)7、8、19、20所示堿基序列的引物組成的引物。PCR可以在本發(fā)明所用的探針的存在下進(jìn)行。這樣，在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，無(wú)須精制擴(kuò)增產(chǎn)物，即可進(jìn)行Tm值分析。根據(jù)所用的探針，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易對(duì)引物的Tm值、PCR的反應(yīng)條件(試劑組成、循環(huán)數(shù))做出調(diào)整。除測(cè)定本發(fā)明探針的熒光染料的熒光以外，可以按照常用的方法進(jìn)行Tm分析。能夠應(yīng)用與熒光染料對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的激發(fā)光來(lái)測(cè)定發(fā)光波長(zhǎng)的光。Tm分析中的升溫速度，一般為0. I 1°C /秒。進(jìn)行Tm分析時(shí)的反應(yīng)液的組成只要能夠使探針和含有與探針堿基序列互補(bǔ)的序列的核酸發(fā)生雜交即可，無(wú)特別限制，一般為，一價(jià)陽(yáng)離子濃度為I. 5 5mM、pH為7 9。由于使用PCR等的DNA聚合酶的擴(kuò)增方法的反應(yīng)液一般情況下都滿(mǎn)足這一條件，所以，擴(kuò)增后的反應(yīng)液可以直接用于Tm分析。根據(jù)上述Tm分析的結(jié)果，對(duì)ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的檢測(cè)，可以按照常規(guī)方法進(jìn)行，本發(fā)明的檢測(cè)包括有無(wú)突變的檢測(cè)和確定含有多態(tài)性的核酸的豐度比。而且，通過(guò)本發(fā)明的探針和多態(tài)性檢測(cè)方法，能夠檢測(cè)出ALDH2基因和ADH2基因的多態(tài)性，根據(jù)檢測(cè)多態(tài)性的有無(wú)，能夠預(yù)測(cè)對(duì)乙醛和乙醇的分解能力。具體地，存在如下啟示，若ALDH2的基因多態(tài)性rs671的堿基為G/G即為野生型，判定為對(duì)乙醛的分解能力高，但是，若是雜合型G/A、突變型的堿基的純合型A/A，則對(duì)于乙醛的分解能力低；此外，若ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的堿基為G/G即為野生型，判定為對(duì)乙醇的分解能力低，但是，若是雜合型G/A、純合型的A/A，則對(duì)于乙醇的分解能力高。根據(jù)對(duì)乙醛和乙醇的分解能力的預(yù)測(cè)結(jié)果，能夠預(yù)測(cè)對(duì)乙醇的耐受性、酒精依賴(lài)癥、肝病、胰腺癌等與乙醇代謝的相關(guān)疾病。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠同時(shí)檢測(cè)出乙醛脫氫酶2 (ALDH2)的基因多態(tài)性rs671和乙醇脫氫酶2 (ADH2)的基因多態(tài)性rsl229984，例如，當(dāng)ALDH2基因和ADH2基因都存在突變時(shí)，給出了對(duì)乙醇的耐受性更低的啟示?！?>本發(fā)明的引物本發(fā)明的引物是在本發(fā) 明的檢測(cè)方法中與本發(fā)明的探針一起使用的引物。具體地，本發(fā)明的引物為用于檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組中至少一種基因多態(tài)性的引物，其特征在于含有下述(P4)和(P5)以及/或者(P6)和(P7)寡核苷酸。(P4)寡核苷酸，其為序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第89 109位的喊基的喊基長(zhǎng)度為21 60喊基長(zhǎng)的喊基序列。(P5)寡核苷酸，其為與序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第388 407位的堿基的堿基長(zhǎng)度為20 60堿基長(zhǎng)的堿基序列互補(bǔ)的序列。(P6)寡核苷酸，其為序列編號(hào)13或14所示的堿基序列中的、含有第93 138位的喊基的喊基長(zhǎng)度為46 60喊基長(zhǎng)的喊基序列。(P7)寡核苷酸，其為與序列編號(hào)13或14所示的堿基序列中的、含有第214 238位的堿基的堿基長(zhǎng)度為25 60堿基長(zhǎng)的堿基序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明的(P4) (P7)引物可以與上述序列不完全相同，也可以是僅有5個(gè)堿基、4個(gè)堿基、3個(gè)堿基、2個(gè)堿基或I個(gè)堿基不同。本發(fā)明中所用的引物為例如為序列編號(hào)7、8、19、20所示的引物。<3>本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明的試劑盒為用于本發(fā)明檢測(cè)方法的試劑盒。該試劑盒的特征在于其包含本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針。而且，本發(fā)明的試劑盒可以用于判斷針對(duì)乙醇的代謝能力和耐受性。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒，除包含探針外，還可以包含本發(fā)明檢測(cè)方法中進(jìn)行核酸擴(kuò)增所必需的試劑，特別是還可以含有用于使用DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增的上述引物。在本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中，探針、引物以及其他試劑，可以分別容納，也可將它們的一部分制成混合物。下面，通過(guò)實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明。但是，這些實(shí)施例為本發(fā)明的示例，本發(fā)明不限于此。在本發(fā)明中，作為檢測(cè)對(duì)象的試樣中的試樣核酸、多態(tài)性檢測(cè)用探針或引物的各個(gè)序列，以它們相互互補(bǔ)的關(guān)系為基礎(chǔ)而描述的事項(xiàng)，只要不特別指出，可以適用于每一序列以及與各個(gè)序列互補(bǔ)的序列。在將本發(fā)明的事項(xiàng)適用于相對(duì)于各序列互補(bǔ)的對(duì)應(yīng)序列時(shí)，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識(shí)的范圍內(nèi)，由該互補(bǔ)的序列識(shí)別的序列視為將說(shuō)明書(shū)整體替換為與對(duì)應(yīng)的本說(shuō)明書(shū)中記載的序列互補(bǔ)的序列。實(shí)施例實(shí)施例I (以ALDH2的模板寡核苷酸為檢測(cè)對(duì)象，使用單一探針的情況)以含有ALDH2的基因多態(tài)性rs671位點(diǎn)的堿基序列(序列編號(hào)I (野生型))為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出如表I所示的3’末端部含有C的探針(與野生型(序列編號(hào)3、5)以及突變型(序列編號(hào)4)對(duì)應(yīng))以及5’末端部含有C的探針(與野生型(序列編號(hào)6)對(duì)應(yīng))。表I中，探針的位置對(duì)于野生型而言，表示序列編號(hào)I所示的堿基序列中的堿基編號(hào)，對(duì)于突變型而言，表示序列編號(hào)2的所示的堿基序列中的堿基編號(hào)。3’末端的P表示磷酸化。按照常用方法通過(guò)TAMRA進(jìn)行標(biāo)記。此外，作為檢測(cè)對(duì)象使用的模板寡核苷酸(野生型正義鏈(序列編號(hào)9)、野生型反義鏈(序列編號(hào)11)、突變型正義鏈(序列編號(hào)10)、野生型反義鏈(序列編號(hào)12))的序列不于表I。表I中，寡核苷酸的位置表不序列編號(hào)2所不的堿基序列中的堿基序號(hào)。表I
權(quán)利要求
1.一種多態(tài)性檢測(cè)用探針，其為用于檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組中的至少一種基因多態(tài)性的探針，其特征在于，所述探針由選自下述(Pl)至(P3’ )的至少一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸構(gòu)成 (PD寡核苷酸具有與序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第241 251位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，并且與第241位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (ΡΓ)寡核苷酸具有與序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第241 251位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的序列，并且與第241位對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (P2)寡核苷酸具有序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第251 261位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列或與其同源的序列，并且與第261位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (P2’)寡核苷酸具有與序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第251 261位的堿基的11 50堿基長(zhǎng)的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的序列，并且與第261位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (P3)寡核苷酸具有序列編號(hào)13所示的堿基序列中的、含有第201 212位的堿基的12 50堿基長(zhǎng)的堿基序列或者與其同源的序列，并且與第212位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (P3’ )寡核苷酸具有與序列編號(hào)13所示的堿基序列中的、含有第201 212位的堿基的12 50堿基長(zhǎng)的堿基序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的序列，并且與第212位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求I所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中， (PD和(ΡΓ )寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I 3位的位置具有用熒光染料標(biāo)記的與第241位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基； (P2)和(P2’)寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I 3位的位置具有用熒光染料標(biāo)記的與第261位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基； (P3)和(P3’)寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I 3位的位置具有用熒光染料標(biāo)記的與第212位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基。
3.如權(quán)利要求I所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中， (PD和(ΡΓ)寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的與第241位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基; (P2)和(P2’)寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的與第261位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基; (P3)和(P3’)寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的與第212位的堿基對(duì)應(yīng)的堿基。
4.如權(quán)利要求I 3中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述寡核苷酸在未與目標(biāo)序列雜交時(shí)發(fā)出熒光，且在與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度減少或增加。
5.如權(quán)利要求4所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述寡核苷酸在與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度減少。
6.如權(quán)利要求I 5中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，(PD至(P3’)寡核苷酸的堿基長(zhǎng)度為12 30。
7.如權(quán)利要求I 5中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，(PD至(P3’)寡核苷酸的堿基長(zhǎng)度為15 30。
8.如權(quán)利要求I 5中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，(PD至(P3’)寡核苷酸的堿基長(zhǎng)度為18 30。
9.如權(quán)利要求I 8中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述探針為用于熔解曲線(xiàn)分析的探針。
10.用于檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組的至少一種多態(tài)性的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求I 9中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針中的至少一種。
11.如權(quán)利要求10所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，包括 (I)使權(quán)利要求I 9中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針與試樣中的單鏈核酸接觸，使所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與所述單鏈核酸雜交，來(lái)獲得雜交體形成體； (II)通過(guò)改變含有所述雜交體形成體的試樣的溫度，將所述雜交體形成體解離，測(cè)定基于所述雜交體形成體的解離的熒光信號(hào)的變動(dòng)； (III)基于所述信號(hào)的變動(dòng)來(lái)確定雜交體形成體的解離溫度、即Tm值；以及 (IV)基于所述Tm值，確定選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組的一種以上的多態(tài)性的存在或具有多態(tài)性的核酸的豐度比。
12.如權(quán)利要求11所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，還包括在所述步驟(I)之前或與步驟(I)同時(shí)擴(kuò)增核酸。
13.—種方法,包括 通過(guò)權(quán)利要求10 12中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，來(lái)檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組的一種以上的多態(tài)性的步驟；以及 基于多態(tài)性的有無(wú)，來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)乙醇的代謝能力和/或判定耐受性的步驟。
14.一種多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒，其用于檢測(cè)選自包括ALDH2基因多態(tài)性和ADH2的基因多態(tài)性的組中的一種以上的多態(tài)性,所述試劑盒包含權(quán)利要求I 9中任意一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針。
15.如權(quán)利要求14所述的多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒，還包含 能夠以序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中含有與所述(Pl)、(ΡΓ )、(P2)或(P2’ )寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增的引物，以及 能夠以序列編號(hào)13所示的堿基序列中含有與所述(P3)或(P3’)寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增的引物。
16.一種方法，其特征在于，使用多態(tài)性檢測(cè)用引物和權(quán)利要求I 9中任意一項(xiàng)所述的探針，其中，所述多態(tài)性檢測(cè)用引物為用于檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組中的一種以上的多態(tài)性的引物，所述引物的特征在于包括(P4)、(P5)和/或(P6)、(P7)寡核苷酸， (P4)寡核苷酸具有序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第89 109位的堿基的喊基長(zhǎng)度為21 60喊基長(zhǎng)的喊基序列；(P5)寡核苷酸具有與序列編號(hào)I或2所示的堿基序列中的、含有第388 407位的堿基的堿基長(zhǎng)度為20 60堿基長(zhǎng)的堿基序列互補(bǔ)的序列； (P6)寡核苷酸具有序列編號(hào)13所示的堿基序列中的、含有第93 138位的堿基的堿基長(zhǎng)度為46 60堿基長(zhǎng)的堿基序列； (P7)寡核苷酸具有與序列編號(hào)13所示的堿基序列中的、含有第214 238位的堿基的堿基長(zhǎng)度為25 60堿基長(zhǎng)的堿基序列互補(bǔ)的序列。
17.評(píng)價(jià)針對(duì)乙醇的代謝能力和/或判定耐受性的方法，包括 通過(guò)權(quán)利要求16所述的方法，檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組中的一種以上的多態(tài)性的步驟，以及 基于多態(tài)性的有無(wú)，評(píng)價(jià)針對(duì)乙醇的代謝能力和/或判定耐受性的步驟。
18.一種試劑盒，其用于檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rsl229984的組中的一種以上的多態(tài)性，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求I 9中任意一項(xiàng)所述的探針、以及含有權(quán)利要求16所述的(P4)和(P5)以及/或者(P6)和(P7)寡核苷酸的引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及同時(shí)檢測(cè)乙醛脫氫酶2和乙醇脫氫酶2基因突變的方法。具體地，本發(fā)明的課題在于，確定一種對(duì)于檢測(cè)乙醛脫氫酶2(ALDH2)的基因多態(tài)性rs671和乙醇脫氫酶2(ADH2)的基因多態(tài)性rs1229984有效的探針，提供一種同時(shí)檢測(cè)這些基因多態(tài)性的方法、以及用于此目的的試劑盒。為此，本發(fā)明提供了一種多態(tài)性檢測(cè)用探針，其為用于檢測(cè)選自包括ALDH2的基因多態(tài)性rs671和ADH2的基因多態(tài)性rs1229984的組中的至少一種基因多態(tài)性的探針，其特征在于，其由選自說(shuō)明書(shū)中定義的(P1)至(P3’)中至少一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸構(gòu)成。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102758008SQ20121013686
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者井口亞希, 平井光春 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社