專利名稱：一株耐高溫石蠟降解菌及其在清防蠟中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于石油微生物領(lǐng)域，具體涉及ー株具有清防蠟功能的菌株及其在清防蠟中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對(duì)于溶有一定量石蠟的原油，在開(kāi)采過(guò)程中，隨著溫度、壓カ的降低和氣體的析出，溶解的石蠟便以結(jié)晶體析出、長(zhǎng)大聚集并沉積在管壁等固相表面上，即出現(xiàn)所謂的結(jié)蠟現(xiàn)象。結(jié)蠟會(huì)堵塞產(chǎn)油層，降低油井產(chǎn)量，同時(shí)也會(huì)増大油井負(fù)荷，造成生產(chǎn)事故。在含蠟原油的開(kāi)采過(guò)程中，雖然可采用各類防蠟方法，但油井仍不可避免地存在有蠟沉積的問(wèn)題。 蠟沉積嚴(yán)重地影響著油井正常生產(chǎn)，所以必須采取措施將其清除。目前，油井常用的清蠟方法有機(jī)械清蠟、熱カ清蠟、化學(xué)清蠟等。清防蠟技術(shù)就是根據(jù)原油物性及油井開(kāi)采狀況的復(fù)雜性，并根據(jù)不同區(qū)塊、不同油井、區(qū)塊開(kāi)采的不同時(shí)期以及油井結(jié)蠟狀況的不同，為清蠟、阻止蠟沉積而采取的一種有效的エ藝。微生物清防蠟技術(shù)則是針對(duì)原油含蠟的特點(diǎn)以及結(jié)蠟機(jī)理，篩選合適的細(xì)菌組合注入井筒，利用微生物細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物的作用，阻止石蠟結(jié)晶，防止或緩解井筒結(jié)蠟，達(dá)到代替或逐漸替代傳統(tǒng)清防蠟措施的目的。目前，雖然國(guó)內(nèi)外已經(jīng)分離篩選出大量的石油降解菌株，但是耐高溫高效的石蠟降解菌株卻不多見(jiàn)，這也是開(kāi)發(fā)利用微生物技術(shù)進(jìn)行清防蠟エ藝的最大障礙，在實(shí)際應(yīng)用中受到很大的限制，所以開(kāi)發(fā)高效清防蠟菌株具有重要的創(chuàng)新性和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決目前缺少耐高溫高效的石蠟降解菌株的問(wèn)題，而提供一株耐高溫石蠟降解菌及其在清防蠟中的應(yīng)用。本發(fā)明的耐高溫石臘降解菌為微桿菌(Microbacterium sp. ) JNS02,保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012022。本發(fā)明微桿菌JNS02是從大慶油田被原油污染的水樣中經(jīng)分離、純化獲得。該微桿菌JNS02在LB平板上生長(zhǎng)I天形成直徑約I 3mm的菌落，菌落圓形，凸起，表面濕潤(rùn)，邊緣整齊，半透明。單細(xì)胞，呈短桿狀，革蘭氏陽(yáng)性。呼吸代謝，產(chǎn)熒光、不產(chǎn)生H2S、吲哚、甲基紅；具有硝酸鹽還原性和反硝化能力，具有液化明膠能力，能利用葡萄糖、蔗糖。本發(fā)明的的耐高溫石臘降解菌,它為微桿菌sp. )JNS02,其16SrDNA 基因序列參照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology))VoI. VtO 內(nèi)容，根據(jù)其生理生化特征和16S rDNA基因序列，通過(guò)NCBI BLASTn程序比對(duì)，本發(fā)明微桿菌JNS02與Microbacterium sp. A95的16S rDNA基因序列同源為99%，因此鑒定本發(fā)明的菌株為微桿菌屬的ー個(gè)新菌種。本發(fā)明的耐高溫石臘降解菌,它為微桿菌iMi crobac teri um sp. ) JNS02,屬于微桿菌屬(#icrc^aci6 riw ),保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月16日，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012022。本發(fā)明微桿菌NS02能夠使凝固在管壁等固體上的石蠟溶解成網(wǎng)狀并剝離，并且剝離下的固體石蠟變軟或已經(jīng)溶解，經(jīng)測(cè)定，清蠟率可達(dá)59%。因此，該微桿菌JNS02可用于油田生產(chǎn)過(guò)程中的清蠟操作，也可用于防止結(jié)蠟情況的發(fā)生。本發(fā)明微桿菌JNS02能夠在3(T70°C條件下生長(zhǎng)，在70°C時(shí)菌液的OD62tl仍可達(dá)到O. 42，該菌株能夠適應(yīng)較高及較廣的溫度范圍，因此該菌株的耐高溫性能使其在油田的實(shí)際生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。


圖I為微桿菌JNS02在不同溫度條件下的生長(zhǎng)情況。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的耐高溫石臘降解菌為微桿菌
sp. XJNS02，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012022。該微桿菌JNS02在LB平板上生長(zhǎng)I天形成直徑約I 3mm的菌落，菌落圓形，凸起，表面濕潤(rùn)，邊緣整齊，半透明。單細(xì)胞，呈短桿狀，革蘭氏陽(yáng)性。呼吸代謝，產(chǎn)熒光、不產(chǎn)生H2S、吲哚、甲基紅；具有硝酸鹽還原性和反硝化能力，具有液化明膠能力，能利用葡萄糖、蔗糖。該微桿菌JNS02是從大慶油田被原油污染的水樣中經(jīng)分離、純化獲得。具體步驟如下取被原油污染的水樣5ml加入50ml含有質(zhì)量體積比為1%的原油的液體無(wú)機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，在30°C、轉(zhuǎn)速200r/min條件下震蕩培養(yǎng)7天，然后以10%的體積比的接種量接種到新的含有質(zhì)量體積比為1%的原油的液體無(wú)機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，在30°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)7天，再繼續(xù)轉(zhuǎn)接，重復(fù)這ー過(guò)程3 5次。將培養(yǎng)的菌液稀釋1000000倍涂布到含有質(zhì)量體積比為I. 6%的瓊脂LB固體培養(yǎng)基上，30°C條件下靜止培養(yǎng)36小吋。選取長(zhǎng)出的單菌落繼續(xù)接50ml含有質(zhì)量體積比為1%的原油的液體無(wú)機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，在30°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)7天，篩選能夠利用原油作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的菌株，最終獲得ー株降解能力較好的菌株。經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，該菌株具有非常高的穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)后降解原油的能力沒(méi)有降低。所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的配方為=KH2PO4 O. 5g/L, K2HPO4 4 g/L，NH4Cl I g/L，質(zhì)量百分比為1%的CaCl2 2 ml/L，質(zhì)量百分比為10%的MgCl2 · 6H20 2 ml/L，質(zhì)量百分比為1%的FeCl3 200 μ 1/L，維生素混合液200 ml/L，離子混合液5 ml/L，配制好后在121で條件下滅菌20 mirio所述的離子混合液的配方為姆升蒸懼水含有=ZnCl2 O. 5g, FeCl2 0.5 g,MnCl2 · 4H20 O. 5g, Na2MoO4 · 2H20 0. lg, CuCl2 · 2H20 0. 05g, Na2WO4 · 2H20 0. 05g, HCl 120mmol/Lo所述的維生素混合液的配方為姆升蒸懼水含有400 mg泛酸 丐,200 mg肌醇，400 mg尼克酸/畑酸，400 mg VB6,200 mg對(duì)氨基苯甲酸，O. 5 mg VB12。所述的LB培養(yǎng)基配方為1升蒸懼水中含10g蛋白胨,5g酵母粉，IOg Nacl ;固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為I. 6%的瓊脂粉，在121で條件下滅菌20分鐘。將上述菌株進(jìn)行16S rDNA基因提取并測(cè)序，其基因序列長(zhǎng)度為1452 bp，核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。該菌株的16S rDNA基因序列參照《Bergey’ s Mannual ofSystematic Bacteriology)) Vol. VtO內(nèi)容,根據(jù)其生理生化特征和16S rDNA基因序列，通過(guò)NCBI BLASTn程序比對(duì),本實(shí)施方式的菌株與#icroAacteritt sp. A95的16S rDNA基因序列同源為99%，鑒定本發(fā)明的菌株為微桿菌屬的ー個(gè)新菌種，并將其命名為微桿菌{Mi crobac teri um sp.)JNS02o具體實(shí)施方式
ニ 本實(shí)施方式將具體實(shí)施方式
一的微桿菌
sp. ) JNS02用于清蠟實(shí)驗(yàn)，具體步驟如下實(shí)驗(yàn)組將ー小段鋼管的表面包裹固體石蠟，然后放入裝有微桿菌JNS02發(fā)酵液的三角瓶中，靜置培養(yǎng)36小吋。對(duì)照組將ー小段鋼管的表面包裹固體石蠟，然后放入裝有蒸餾水的三角瓶中，靜置培養(yǎng)36小吋。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表I。通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果及表I中的數(shù)據(jù)可知，空白組的鋼管上的石蠟基本沒(méi)有變化，清蠟率僅 為2. 4%，基本可以忽略，而浸泡在微桿菌JNS02發(fā)酵液中的鋼管上包裹的固蠟已經(jīng)呈網(wǎng)狀，有的固體石蠟已經(jīng)剝離，并且剝離下的固體石蠟變軟或已經(jīng)溶解，經(jīng)測(cè)定，清蠟率可達(dá)59%。因此，該微桿菌JNS02可用于油田生產(chǎn)過(guò)程中的清蠟操作，也可用于防止結(jié)蠟情況的發(fā)生。表I清蠟實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
m試驗(yàn)次數(shù)1ig)聲用前后固體<g> 細(xì)率
桿菌 INS02 I 2J39IJMl59%
2umI·545%
33.m1J2849J%
—空 __I__2-7 __2703__2Λ%_具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式對(duì)具體實(shí)施方式
一的微桿菌sp.)JNS02在不同溫度下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了測(cè)定，實(shí)驗(yàn)具體步驟如下(I)斜面培養(yǎng)將微桿菌JNS02接種于含有質(zhì)量體積比為I. 5%的瓊脂的LB固體培養(yǎng)基中，在30°C條件下，靜止培養(yǎng)24h；(2)種子培養(yǎng)將步驟(I)中培養(yǎng)的菌株在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接I 2環(huán)于5ml液體培養(yǎng)基中，在30°C條件下，振蕩培養(yǎng)12h，將培養(yǎng)物用無(wú)菌的O. 85%生理鹽水洗滌三次，制得種子液；(3)將步驟(2)中制得得種子液按照5%接種量接種到IOml含有2% (w/v)柴油的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30°C、37 °C、40 V、45 °C、50 V、55 °C、60 V、65 V和70 V條件下，振蕩培養(yǎng)24h，測(cè)定620nm吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖I。所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基及LB固體培養(yǎng)基的配方同具體實(shí)施方式
一。由圖I中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，微桿菌JNS02能夠在3(T70°C條件下生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為45°C，在此溫度下OD62tl達(dá)到I. 5 ;隨著溫度的升高生長(zhǎng)變慢，但在70°C時(shí)OD62tl仍可達(dá)到O. 42，說(shuō)明微桿菌JNS02能夠適應(yīng)較高及較廣的溫度范圍，因此該菌株的耐高溫性能使其在油田的實(shí)際生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一株耐高溫石臘降解菌，該菌株為微桿菌sp. )JNS02,保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012022。
2.如權(quán)利要求I所述的耐高溫石蠟降解菌在清防蠟中的應(yīng)用。
全文摘要
一株耐高溫石蠟降解菌及其在清防蠟中的應(yīng)用。屬于石油微生物領(lǐng)域。它解決了目前缺少耐高溫高效的石蠟降解菌株的問(wèn)題。本發(fā)明耐高溫石蠟降解菌為微桿菌(Microbacteriumsp.)JNS02，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCCNOM2012022。本發(fā)明微桿菌NS02的清蠟率可達(dá)59%，并能夠在30~70℃條件下生長(zhǎng)，能夠適應(yīng)較高及較廣的溫度范圍，因此該菌株的耐高溫性能使其在油田的實(shí)際生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102660475SQ20121013727
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者蓋忠輝, 蔣立民 申請(qǐng)人:黑龍江吉納森生物工程股份有限公司