專利名稱：貼壁型細胞培養(yǎng)裝置及貼壁型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及一種用于大規(guī)模體外培養(yǎng)哺乳類動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞及人類細胞的貼壁型細胞培養(yǎng)裝置及貼壁型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
采用大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細胞是生產(chǎn)生物制品的有效方法。20世界60-70年代，用于大規(guī)模培養(yǎng)細胞的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)和中空纖維細胞培養(yǎng)技術(shù)就已創(chuàng)立。近數(shù)十年來，由于人類對生長激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細胞介素等生物制品的需求猛增，采用傳統(tǒng)的生物化學(xué)技術(shù)從動物組織中獲取生物制品的量已遠遠不能滿足需求。隨著細胞培養(yǎng)的原理與方法日臻完善，細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)逐漸趨于成熟。所謂細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)(large-scale culture technology)是指在人工條件下(設(shè)定ph、溫度、溶氧等)，在細胞生物反應(yīng)器(bioreactor)中高密度大量培養(yǎng)用于生產(chǎn)生物制品的動物細胞的技術(shù)。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的細胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細胞及人二倍體細胞、cho (中華倉鼠卵巢)細胞、BHK-21(倉鼠腎細胞)、Veix)細胞(非洲綠猴腎傳代細胞，它是貼壁依賴的成纖維細胞)等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。第一代細胞培養(yǎng)技術(shù)使用轉(zhuǎn)瓶(roller bottle)進行貼壁細胞的培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)具有勞動強度大、占地空間大、單位體積提供細胞生長的表面積小、細胞生長密度低、產(chǎn)品質(zhì)量不均一、培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受限的缺點。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，迫切需要大規(guī)模的細胞培養(yǎng)，特別是培養(yǎng)表達特異性蛋白的哺乳動物細胞，以便獲得大量有用的細胞表達產(chǎn)物。采用玻璃瓶靜置或旋轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)方法，已不能滿足細胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物的需求。自70年代以來，采用微載體技術(shù)培養(yǎng)細胞及其生物反應(yīng)器(Bioreactor)得到了較快的發(fā)展，生物反應(yīng)器的種類越來越多，規(guī)模越來越大，較常見的細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器有空氣提升反應(yīng)器、中空纖維管反應(yīng)器、無泡攪拌反應(yīng)器及籃式生物反應(yīng)器等。八十年代以來，人們逐漸開始采用微載體技術(shù)以生物反應(yīng)器培養(yǎng)代替鼠腹水的方法獲得單克隆抗體。動物細胞是一種無細胞壁的真核細胞，生長緩慢,對培養(yǎng)環(huán)境十分敏感。采用傳統(tǒng)的生物化工技術(shù)進行動物細胞大量培養(yǎng)，除了要滿足培養(yǎng)過程必需的營養(yǎng)要求外，有必需建立合理的控制模型，進行PH和溶氧(DO)的最佳控制。細胞生物反應(yīng)器可通過微機有序地定量地控制加入動物細胞培養(yǎng)罐內(nèi)的空氣、氧氣、氮氣和二氧化碳四種氣體的流量，使其保持最佳的比例來控制細胞培養(yǎng)液中的PH值和溶氧水平，使系統(tǒng)始終處于最佳狀態(tài)，以滿足動物細胞的生長對PH值和溶解氧的需要。如為提高或達到一定的溶氧水平可改變通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中氧氣和氮氣的比例來實現(xiàn)控制DO值的目的。細胞生物反應(yīng)器采用二氧化碳/碳酸氫鈉(C02/NaHC03)緩沖液系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液的pH值。目前微載體培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)多種類型細胞，如293細胞、成肌細胞、Vero細胞、CHO細胞，但由于微載體對細胞有一定要求，仍有多種細胞無法采用微載體技術(shù)進行培養(yǎng)。
現(xiàn)在，細胞培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都有不斷的發(fā)展，并且從中得到的蛋白質(zhì)也被證明是安全有效的，人們對細胞培養(yǎng)的態(tài)度也已經(jīng)發(fā)生了改變。許多人用和獸用的重要蛋白質(zhì)藥物和疫苗，尤其是那些相對較大、較復(fù)雜或糖基化(glycosylated)的蛋白質(zhì)來說，細胞培養(yǎng)是首選的生產(chǎn)方式。60年代初，英國AVRI研究所在貼壁細胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養(yǎng)成功后，從最初的200ml和800ml玻璃容器開始，很快就放大到30L和100L不銹鋼罐的培養(yǎng)規(guī)模。使用的是基于Eagle’s配方的培養(yǎng)基,補充5%成年牛血清和蛋白胨。1967年以后,WelIcome (現(xiàn)為Cooper動物保健)集團分布于歐洲、非洲和南美洲8個國家的生產(chǎn)廠商，應(yīng)用此項技術(shù)工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)口蹄疫疫苗和獸用狂犬疫苗，已掌握了 5000L的細胞罐大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。目前，國內(nèi)很多企業(yè)仍然采用轉(zhuǎn)瓶技術(shù)進行生產(chǎn)，然而由于轉(zhuǎn)瓶技術(shù)具有不能大規(guī)模制備產(chǎn)品、生產(chǎn)批次間質(zhì)量差異大、產(chǎn)品無法監(jiān)控的缺點，新的生產(chǎn)線已經(jīng)不允許采用轉(zhuǎn)瓶技術(shù)。 由于微載體技術(shù)工藝操作復(fù)雜，對細胞生物反應(yīng)器的要求高，設(shè)備完全依賴進口。目前國內(nèi)企業(yè)對微載體技術(shù)的工藝不能完全掌握，只有少數(shù)企業(yè)可以做到300L的培養(yǎng)規(guī)模，國際上也僅有少數(shù)企業(yè)掌握了 1000L以上的培養(yǎng)技術(shù)，無法超過5000L的培養(yǎng)規(guī)模，嚴(yán)重制約了疫苗及生物工程藥物的研究及生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種結(jié)構(gòu)簡單、工藝操作簡單、生產(chǎn)出的產(chǎn)品質(zhì)量均一、培養(yǎng)過程容易監(jiān)控、能滿足大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的貼壁型細胞培養(yǎng)裝置。本發(fā)明的第一目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種貼壁型細胞培養(yǎng)裝置，包括中部具有空腔的殼體，該殼體的空腔內(nèi)水平設(shè)置有細胞生長層、過濾層和支撐層，細胞生長層位于過濾層的上方，支撐層位于過濾層的下方，細胞生長層、過濾層、支撐層三者將殼體的內(nèi)部空腔分割為位于細胞生長層的上方的上部空腔和位于支撐層下方的下部空腔，上部空腔內(nèi)設(shè)置有一個狹長的流道，殼體的上部設(shè)置有與該上部空腔連通的至少一個進液口和至少一個出液口，下部空腔為透過液流道，所述殼體的下部設(shè)置有與該下部空腔連通的至少一個透過液口。所述殼體的上部空腔內(nèi)設(shè)置有多塊縱向的擋板，這些擋板均勻的水平排開，相鄰的擋板交錯與殼體的左壁、右壁連接，相鄰擋板相互平行且相鄰擋板之間留有間隙，這些擋板與殼體的內(nèi)壁之間構(gòu)成了迂回的狹長的所述流道，所述進液口設(shè)置于該流道的起始處，所述出液口設(shè)置于該流道的終止處。所述細胞生長層為細胞親和性良好的一層或兩層以上的疏松多孔結(jié)構(gòu)或所述細胞生長層具有帶透液孔的光滑表面。所述過濾層為設(shè)置有過濾孔的細胞截留層，其中，過濾孔的孔徑小于40um。本發(fā)明的另一目的在于提供一種貼壁型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。本發(fā)明的另一目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種貼壁型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，包括透過液容器、權(quán)利要求1-4中所述的貼壁型細胞培養(yǎng)裝置以及通過補液調(diào)節(jié)該貼壁型細胞培養(yǎng)裝置的細胞培養(yǎng)條件的儲液裝置，貼壁型細胞培養(yǎng)裝置的透過液口通過管路與透過液容器連接，貼壁型細胞培養(yǎng)裝置的出液口通過管路與儲液裝置的進液口連接，貼壁型細胞培養(yǎng)裝置的進液口通過管路與儲液裝置的出液口連接，貼壁型細胞培養(yǎng)裝置與儲液裝置之間的管路設(shè)置有循環(huán)泵。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的貼壁型細胞培養(yǎng)裝置創(chuàng)造性地將切向流技術(shù)與固定床技術(shù)有機結(jié)合起來，其兼具結(jié)構(gòu)簡單、工藝操作簡單、生產(chǎn)出的產(chǎn)品質(zhì)量均一、培養(yǎng)過程容易監(jiān)控的優(yōu)點，它能穩(wěn)定地進行大規(guī)模細胞擴增培養(yǎng)。本發(fā)明的貼壁型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的儲液裝置能夠通過補液控制貼壁型細胞培養(yǎng)裝置的整個細胞培養(yǎng)過程的培養(yǎng)條件，與貼壁型細胞培養(yǎng)裝置配合完成整個細胞培養(yǎng)過程。


圖I是本發(fā)明的整體結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2是本發(fā)明的俯視圖；圖3是本發(fā)明的貼壁型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。在圖I、圖2中1_殼體；2_細胞生長層；3_過濾層；4_支撐層；5_上部空腔；6-流道；7-下部空腔；8-進液口 ；9-出液口 ；10_透過液口 ；11_擋板。在圖3中12_貼壁型細胞培養(yǎng)裝置；13-透過液容器；14-儲液裝置；15-循環(huán)泵。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作詳細描述。如圖I所示，一種貼壁型細胞培養(yǎng)裝置，包括中部具有空腔的殼體1，該殼體I的空腔內(nèi)水平設(shè)置有細胞生長層2、過濾層3和支撐層4，細胞生長層2位于過濾層3的上方，支撐層4位于過濾層3的下方，細胞生長層2、過濾層3、支撐層4三者將殼體I的內(nèi)部空腔分割為位于細胞生長層2的上方的上部空腔5和位于支撐層4下方的下部空腔7，上部空腔5內(nèi)設(shè)置有一個狹長的流道6，殼體I的上部設(shè)置有與該上部空腔5連通的至少一個進液口 8和至少一個出液口 9，下部空腔7為透過液流道，殼體I的下部設(shè)置有與該下部空腔7連通的至少一個透過液口 10。傳統(tǒng)死端過濾技術(shù)液體的流動方向垂直于過濾膜，隨著時間的推移，顆粒會逐漸在濾膜表面堆積，最終造成堵塞。由于細胞在培養(yǎng)過程中不可避免的會有部分細胞老化死亡，從而產(chǎn)生細胞碎片，造成濾膜的堵塞，本發(fā)明運用了切向流過濾技術(shù)，切向流技術(shù)將液體流動方向平行于過濾膜，因而液體在流動的同時會將大量的顆粒從濾膜表面帶走，避免了堵塞的情況。由于細胞生長的過程中需要消耗大量的營養(yǎng)，也會產(chǎn)生大量的代謝廢物，因此在細胞培養(yǎng)過程中不斷的換培養(yǎng)液才能保證細胞的正常生長。同時，蛋白或病毒也存在于培養(yǎng)液中，及時的收獲才能得到最大的設(shè)備利用率。因而，利用切向流技術(shù)進行換液非常適合細胞培養(yǎng)工藝。如圖2所示，殼體I的上部空腔5內(nèi)設(shè)置有多塊縱向的擋板11，這些擋板11均勻的水平排開，相鄰的擋板11交錯與殼體I的左壁、右壁連接，相鄰擋板11相互平行且相鄰擋板11之間留有間隙，這些擋板11與殼體I的內(nèi)壁之間構(gòu)成了迂回的狹長的流道6，進液口 8設(shè)置于該流道6的起始處，出液口 9設(shè)置于該流道6的終止處。培養(yǎng)基在狹長的流道6內(nèi)流動，將營養(yǎng)物帶給細胞，同時，將代謝廢物帶走。在本發(fā)明中，細胞生長層2為細胞親和性良好的一層或兩層以上的疏松多孔結(jié)構(gòu)或細胞生長層2具有帶透液孔的光滑表面，這可以在有限空間內(nèi)提供最大的細胞接觸表面，培養(yǎng)基可自由穿透該細胞生長層2到達過濾層3，該細胞生長層2可采用纖維素及其衍生物、聚酯纖維(尼龍)、殼聚糖及其衍生物、膠原蛋白、明膠、聚乳酸、聚乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚氨酯泡沫微載體、海藻酸鹽、葡聚糖、玻璃、陶瓷等材料或上述材料相結(jié)合制成。過濾層3為設(shè)置有過濾孔的細胞截留層，其中，過濾孔的孔徑小于40um，在保證培養(yǎng)基透過的同時，保證細胞不會穿過該過濾層3。支撐層4保證過濾層3不會在壓力下破損。如圖3所示，一種貼壁型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，包括透過液容器13、貼壁型細胞培養(yǎng)裝置12以及通過補液調(diào)節(jié)該貼壁型細胞培養(yǎng)裝置12的細胞培養(yǎng)條件的儲液裝置14，貼壁型細 胞培養(yǎng)裝置12的透過液口 10通過管路與透過液容器13連接，貼壁型細胞培養(yǎng)裝置12的出液口 9通過管路與儲液裝置14的進液口 8連接，貼壁型細胞培養(yǎng)裝置12的進液口 8通過管路與儲液裝置14的出液口 9連接，貼壁型細胞培養(yǎng)裝置12與儲液裝置14之間的管路設(shè)置有循環(huán)泵15。采用本發(fā)明進行細胞培養(yǎng)的方法如下。I、貼壁將貼壁型細胞培養(yǎng)裝置12與細胞接種瓶進行無菌連接，通過蠕動泵循環(huán)將細胞接種瓶內(nèi)的接種液送入貼壁型細胞培養(yǎng)裝置12內(nèi)，打開透過液口，以達到濃縮細胞的目的，待接種濃縮液將貼壁型細胞培養(yǎng)裝置12的上部空腔5的流道6剛好充滿時，將貼壁型細胞培養(yǎng)裝置12的出液口 9封閉，在進液口 8加壓或在透過液口 10抽液，使流道6的液體排空，這樣細胞即可與細胞生長層2緊密接觸，在恒溫環(huán)境中靜置一段時間，細胞即可粘附到細胞生長層2上，達到貼壁的目的。2、培養(yǎng)將貼壁型細胞培養(yǎng)裝置12與儲液裝置14按照附圖3連接，儲液裝置14可采用能控制溫度、溶氧、PH參數(shù)的發(fā)酵罐(或?qū)⒄w系統(tǒng)安裝于恒溫環(huán)境中)，保證細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定溫度條件，在培養(yǎng)過程中，通過蠕動泵將培養(yǎng)基注入貼壁型細胞培養(yǎng)裝置12的流道6中，在給細胞提供營養(yǎng)的同時，將細胞代謝產(chǎn)物帶走。3、消化培養(yǎng)結(jié)束后，將貼壁型細胞培養(yǎng)裝置12中的培養(yǎng)基快速排干，加入消化液，靜置一段時間后，通過透過液口 10排出消化液，通過進液口 8加入新鮮培養(yǎng)基，經(jīng)過一段時間循環(huán)后，通過出液口 9收集細胞。4、感染及收獲病毒對于疫苗生產(chǎn)，可在培養(yǎng)結(jié)束后加入病毒，待病毒達到收獲密度后，通過透過液口10收集病毒液或直接通過出液口 9收集病毒。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上內(nèi)容僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案進行的簡單修改或者等同替換，均不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種貼壁型細胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述貼壁型細胞培養(yǎng)裝置包括中部具有空腔的殼體，該殼體的空腔內(nèi)水平設(shè)置有細胞生長層、過濾層和支撐層，細胞生長層位于過濾層的上方，支撐層位于過濾層的下方，細胞生長層、過濾層、支撐層三者將殼體的內(nèi)部空腔分割為位于細胞生長層的上方的上部空腔和位于支撐層下方的下部空腔，上部空腔內(nèi)設(shè)置有一個狹長的流道，殼體的上部設(shè)置有與該上部空腔連通的至少一個進液口和至少一個出液口，下部空腔為透過液流道，所述殼體的下部設(shè)置有與該下部空腔連通的至少一個透過液口。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的貼壁型細胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述殼體的上部空腔內(nèi)設(shè)置有多塊縱向的擋板，這些擋板均勻的水平排開，相鄰的擋板交錯與殼體的左壁、右壁連接，相鄰擋板相互平行且相鄰擋板之間留有間隙，這些擋板與殼體的內(nèi)壁之間構(gòu)成了迂回的狹長的所述流道，所述進液口設(shè)置于該流道的起始處，所述出液口設(shè)置于該流道的終止處。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的貼壁型細胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述細胞生長層為細胞親和性良好的一層或兩層以上的疏松多孔結(jié)構(gòu)或所述細胞生長層具有帶透液孔的光滑表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的貼壁型細胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述過濾層為設(shè)置有過濾孔的細胞截留層，其中，過濾孔的孔徑小于40um。
5.—種貼壁型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于該貼壁型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)包括透過液容器、權(quán)利要求1-4中所述的貼壁型細胞培養(yǎng)裝置以及通過補液調(diào)節(jié)該貼壁型細胞培養(yǎng)裝置的細胞培養(yǎng)條件的儲液裝置，貼壁型細胞培養(yǎng)裝置的透過液口通過管路與透過液容器連接，貼壁型細胞培養(yǎng)裝置的出液口通過管路與儲液裝置的進液口連接，貼壁型細胞培養(yǎng)裝置的進液口通過管路與儲液裝置的出液口連接，貼壁型細胞培養(yǎng)裝置與儲液裝置之間的管路設(shè)置有循環(huán)泵。
全文摘要
一種貼壁型細胞培養(yǎng)裝置及貼壁型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。其中，裝置包括殼體，該殼體的空腔內(nèi)水平設(shè)置有細胞生長層、過濾層和支撐層，細胞生長層、過濾層、支撐層三者將殼體的內(nèi)部空腔分割為上部空腔和下部空腔，上部空腔內(nèi)設(shè)置有一個狹長的流道，殼體的上部設(shè)置有與該上部空腔連通的進液口和出液口，殼體的下部設(shè)置有與該下部空腔連通的透過液口。本發(fā)明的裝置創(chuàng)造性地將切向流技術(shù)與固定床技術(shù)有機結(jié)合起來，其兼具結(jié)構(gòu)簡單、工藝操作簡單、生產(chǎn)出的產(chǎn)品質(zhì)量均一、培養(yǎng)過程容易監(jiān)控的優(yōu)點，它能穩(wěn)定地進行大規(guī)模細胞擴增培養(yǎng)。本發(fā)明的系統(tǒng)的儲液裝置能夠通過補液控制細胞培養(yǎng)條件，與貼壁型細胞培養(yǎng)裝置配合完成整個細胞培養(yǎng)過程。
文檔編號C12M3/04GK102703319SQ20121014006
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者敦振毅 申請人:敦振毅