專利名稱：一種檢測轉(zhuǎn)基因玉米的方法及其專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測轉(zhuǎn)基因玉米的方法及其專用試劑盒。
背景技術(shù)：
基因工程技術(shù)的誕生使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品逐漸走上人們的餐桌，豐富了人們的物質(zhì)生活。為確保轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及相關(guān)產(chǎn)品的生物安全性，盡量減少其潛在的生物損害性，急需建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)簽制度。核酸具有更高的穩(wěn)定性，同時基于核酸的檢測方法與技術(shù)具有更高的靈敏度等優(yōu)點，所以基于核酸的檢測方法已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及相關(guān)產(chǎn)品的主要檢測方法?，F(xiàn)有的基于核酸的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及相關(guān)產(chǎn)品檢測方法主要為針對外源目的基因的核酸檢測技術(shù)，大致分三類一是分子雜交技術(shù)(Southern blot) ;二是基于PCR擴增的方法；三是基因芯片技術(shù)。由于分子雜交技術(shù)沒有使用序列擴增與放大過程，相對于基于PCR擴增的檢測技術(shù)，其靈敏度較低。基因芯片技術(shù)因受制于昂貴的檢測設(shè)備以及大規(guī)模的信息處理與分析能力，目前的應(yīng)用并不廣泛，只有少量的應(yīng)用實例見諸報道。基于PCR擴增的檢測技術(shù)是目前最主要的，也是最準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及相關(guān)產(chǎn)品檢測技術(shù)。該類技術(shù)主要是依據(jù)擴增特異性的外源目的基因片段，常見的轉(zhuǎn)基因PCR檢測技術(shù)主要有定性PCR檢測方法、巢式PCR檢測、復(fù)合定性PCR檢測方法、競爭性定量PCR檢測、PCR-ELISA檢測以及熒光定量PCR檢測方法。品系特異性PCR檢測技術(shù)檢測的是外源載體與宿主基因的連接區(qū)基因片段，該片段具有單拷貝特性，所以該技術(shù)具有非常高的特異性和準(zhǔn)確性，是目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及相關(guān)產(chǎn)品檢測研究的重點?，F(xiàn)在需要檢測的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及相關(guān)產(chǎn)品越來越多，對當(dāng)前的檢測技術(shù)提出了更高的要求，不但要便捷、準(zhǔn)確、靈敏，還要有一定量的檢測通量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測η種轉(zhuǎn)外源DNA植物的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括檢測探針組和通用引物對；所述轉(zhuǎn)外源DNA植物為將外源DNA分子轉(zhuǎn)入目的植物得到的轉(zhuǎn)基因植物；所述通用引物對由引物I和引物2組成；所述引物I和所述引物2為均不與η種所述轉(zhuǎn)外源DNA植物的基因組和所述目的植物的基因組特異結(jié)合的單鏈DNA分子；所述檢測探針組包括η組檢測探針對組成，每一組所述檢測探針對均由I條檢測探針L和其對應(yīng)的I條檢測探針R組成；每一條所述探針L自5’端到3’端依次由所述引物2、長度編碼區(qū)、限制性內(nèi)切酶識別位點和與一條檢測靶序列特異結(jié)合的識別序列組成；每一條所述探針R自5’端到3’端依次由所述引物I和與所述檢測靶序列特異結(jié)合的識別序列組成；每條所述檢測靶序列為每種所述轉(zhuǎn)外源DNA植物的基因組中所述外源DNA與所述目的植物基因組的連接序列。上述引物對也不與所述目的植物的基因組結(jié)合。所述引物2的5’末端標(biāo)記熒光基團；
所述每一組檢測探針對特異結(jié)合一條所述檢測靶序列；所述長度編碼區(qū)為不與所述轉(zhuǎn)外源DNA植物的基因組特異結(jié)合的單鏈DNA分子；每一條所述檢測探針L的長度編碼區(qū)的大小均不相同；不同的所述外源DNA對應(yīng)不同的所述檢測靶序列；所述限制性內(nèi)切酶識別位點為StuI識別位點；所述η不小于I; 所述檢測探針組和通用引物對均為獨立包裝。所述試劑盒還包括對照探針對，所述對照探針對由I條對照探針L和I條對照探針R組成；所述對照探針L自5’端到3’端依次由所述引物2、對照長度編碼區(qū)、限制性內(nèi)切酶識別位點和與對照靶序列特異結(jié)合的識別序列組成；所述對照探針R自5’端到3’端依次由所述引物I和與所述對照靶序列特異結(jié)合的識別序列組成；所述對照靶序列為所述目的植物的基因組中保守基因與所述目的植物基因組其他區(qū)域連接的序列；所述對照長度編碼區(qū)為不與所述目的植物的基因組特異結(jié)合的單鏈DNA分子；所述對照探針L的長度編碼區(qū)與每一條所述檢測探針L的大小均不相同。所述長度編碼區(qū)的大小具體為0_30nt ；所述靶序列和所述對照靶序列均為20_80nt的寡核苷酸；所述對照探針對、檢測探針組和通用引物對均為獨立包裝。上述的試劑盒中，所述對照探針Rl和所述對照探針LI的核苷酸序列分別為序列表中的序列I和序列2 ；所述檢測探針組由如下I) -3)的3組探針對組成I)探針L2和探針R2，所述探針R2和所述探針L2的核苷酸序列分別為序列表中的序列3和序列4 ；2)探針L3和探針R3，所述探針R3和所述探針L3的核苷酸序列分別為序列表中的序列5和序列6 ；3)探針L4和探針R4，所述探針R4和所述探針L4的核苷酸序列分別為序列表中的序列7和序列8 ；所述通用引物對中的引物I的核苷酸序列為序列表中的序列9，所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列10 ;所述熒光基團為FAM。所述各引物和各探針之間均不互補。上述的試劑盒中，每條所述檢測靶序列可以包括13_28bp的外源DNA和ll_28bp目的植物基因組；所述對照靶序列具體可以包括13_28b的所述保守基因和ll_28b所述目的植物基因組其他區(qū)域；上述的試劑盒中，所述η個轉(zhuǎn)外源DNA植物為轉(zhuǎn)基因玉米ΝΚ603、轉(zhuǎn)基因玉米Μ0Ν863、轉(zhuǎn)基因玉米Μ0Ν810 ;所述目的植物為玉米，所述保守基因為zein基因；所述zein基因的核苷酸序列為序列表中的序列15 ；所述轉(zhuǎn)基因玉米NK603的檢測靶序列為序列表中的序列12或序列16 ;與所述序列12所示的檢測靶序列特異結(jié)合的探針對為2)所示的探針對；所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N863檢測靶序列為序列表中的序列13或序列17 ;與所述序列13所示的檢測靶序列特異結(jié)合的探針對為3)所示的探針對；所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N810檢測靶序列為序列表中的序列14或序列18 ;與所述序列14所示的檢測祀序列特異結(jié)合的探針對為4)所示的探針對；所述對照靶序列為序列表中的序列11 ;與所述序列11所示的對照靶序列特異結(jié)合的對照探針對為I)所示的探針對。序列12為序列16中的一部分,且為連接外源基因和基因組DNA的部分；序列13為序列17中的一部分，且為連接外源基因和基因組DNA的部分；序列14為序列18中的一部分,且為連接外源基因和基因組DNA的部分。上述對照靶序列為玉米特異基因zein的部分片段。上述的試劑盒在檢測轉(zhuǎn)外源DNA植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；在上述應(yīng)用中，所述轉(zhuǎn)外源DNA植物具體為所述轉(zhuǎn)基因玉米NK603、所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N863和/或所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N810。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測或輔助待測樣本是否為轉(zhuǎn)外源DNA植物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)先確定轉(zhuǎn)外源DNA植物中的檢測靶序列和目的植物中的對照靶序列，再根據(jù)所述檢測靶序列和所述對照靶序列設(shè)計權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑盒中的所述檢測探針組和所述通用引物對；所述轉(zhuǎn)外源DNA植物為將外源DNA分子轉(zhuǎn)入所述目的植物得到的轉(zhuǎn)基因植物；所述檢測靶序列為所述轉(zhuǎn)外源DNA植物的基因組中所述外源DNA與所述目的植物基因組連接的序列；所述對照靶序列為所述目的植物的基因組中保守基因與目的植物基因組其他區(qū)域連接的序列；2)以所述待測樣本的基因組DNA為模板，用所述檢測探針組進行擴增，得到擴增產(chǎn)物；3)以所述擴增產(chǎn)物為模板，用所述通用引物對進行再次擴增，得到熒光標(biāo)記擴增產(chǎn)物；4)用限制性內(nèi)切酶酶切所述熒光標(biāo)記擴增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物；5)HPLC檢測所述酶切產(chǎn)物，根據(jù)酶切產(chǎn)物是否含有對應(yīng)的所述檢測靶序列和所述對照靶序列，鑒定待測樣本是否為目的轉(zhuǎn)外源DNA植物。上述方法中，步驟I)中，所述η不小于I ;步驟2)中，所述擴增的退火溫度為58°C ；步驟3)中，所述再次擴增的退火溫度為68°C ；步驟4)中，所述限制性內(nèi)切酶為StuI ；步驟5)中，鑒定待測樣本是否為所述轉(zhuǎn)外源DNA植物為若所述酶切產(chǎn)物中含有所述檢測靶序列和所述對照靶序列，則所述待測樣本為或候選為所述轉(zhuǎn)外源DNA植物；若所述酶切產(chǎn)物中不含有所述檢測靶序列和所述對照靶序列，則所述待測樣本不為或候選不為 所述轉(zhuǎn)外源DNA植物。上述方法中，步驟5)中，所述待測植物為η種，所述η不小于I ;所述目的轉(zhuǎn)外源DNA植物為轉(zhuǎn)基因玉米ΝΚ603、轉(zhuǎn)基因玉米Μ0Ν863、轉(zhuǎn)基因玉米M0N810 ;所述目的植物為玉米，所述保守基因為zein基因；所述zein基因的核苷酸序列為序列表中的序列15 ；所述轉(zhuǎn)基因玉米NK603的檢測靶序列為序列表中的序列12或序列16 ;與所述序列12所示的檢測靶序列特異結(jié)合的探針對為2)所示的探針對； 所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N863檢測靶序列為序列表中的序列13或序列17 ;與所述序列13所示的檢測靶序列特異結(jié)合的探針對為3)所示的探針對；所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N810檢測靶序列為序列表中的序列14或序列18 ;與所述序列14所示的檢測祀序列特異結(jié)合的探針對為4)所示的探針對；所述對照靶序列為序列表中的序列11 ;與所述序列11所示的對照靶序列特異結(jié)合的對照探針對為I)所示的探針對。上述方法中，步驟5)中，所述HPLC的流動相為流動相A和流動相B，所述流動相A為pH為7. O、濃度為O. IM醋酸三乙胺水溶液；所述流動相B按照如下方法制備將乙腈溶于所述流動相A中，所述乙腈在所述流動相B中的濃度為25% (體積百分含量)；所述流速為lml/min ；所述序列11所示的檢測靶序列對應(yīng)的峰的保留時間為19. 2min ；所述序列12所示的檢測靶序列對應(yīng)的峰的保留時間為21. 4min ；所述序列13所示的檢測靶序列對應(yīng)的峰的保留時間為23. 3min ；所述序列14所示的檢測靶序列對應(yīng)的峰的保留時間為25. Omin。上述HPLC的洗脫為25min內(nèi)流動相B從50%增加到58%，IOmin內(nèi)流動相B從58%增加到60%。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提出了一種基于巢式PCR和生物編碼色譜的品系特異性轉(zhuǎn)基因玉米檢測方法，該方法依靠巢式PCR反應(yīng)進行目標(biāo)基因的特異性識別與擴增，從而產(chǎn)生大量的熒光標(biāo)記的擴增產(chǎn)物，然后通過限制性內(nèi)切酶將該擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成目標(biāo)基因特異的編碼長度熒光標(biāo)記核酸片段，最后利用HPLC進行分離檢測，該方法克服了常用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的多重PCR擴增技術(shù)中存在的條件優(yōu)化繁瑣、非特異性擴增難以控制、擴增效率差異大、探針設(shè)計難、探針合成費用較高以及方法檢測靈敏度不夠等缺點，實現(xiàn)了對不同目標(biāo)基因的特異性以及多目標(biāo)的同時檢測，從而實現(xiàn)對目標(biāo)基因的高靈敏、低成本、簡便、重現(xiàn)性好的多目標(biāo)同時檢測。


圖I為內(nèi)引物濃度的優(yōu)化結(jié)果2為針對Tl (ZEIN)玉米植物特異性基因的HPLC熒光峰面積響應(yīng)3為HPLC檢測結(jié)果圖4為不同目標(biāo)基因同時擴增情況以及限制性內(nèi)切酶酶切情況考察結(jié)果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、引物和探針的設(shè)計
—、樣品的制備品系特異性檢測是通過檢測外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列實現(xiàn)的，由于每一個轉(zhuǎn)基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，并且連接區(qū)序列是單拷貝，所以品系特異性檢測方法具有較高的特異性和準(zhǔn)確性。轉(zhuǎn)基因植物鑒定方法采用轉(zhuǎn)外源DNA植物的連接區(qū)，參考文獻許文濤、白衛(wèi)濱、羅云波、元延芳、黃昆侖，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2008，16 (4) :714-722。連接區(qū)是指包含連接點以及側(cè)翼序列的一個區(qū)域，下述連接區(qū)的核苷酸序列和取其部分的靶序列均包括連接點和側(cè)翼序列，只不過連接點兩側(cè)的側(cè)翼序列長度不同。轉(zhuǎn)外源DNA植物的連接區(qū)為外源DNA與植物基因組的連接區(qū)序列，根據(jù)該連接區(qū)上的部分序列作為靶序列進行設(shè)計引物和探針，具體如下
轉(zhuǎn)基因玉米NK603的連接區(qū)為外源插入片段NK603的5'端與玉米基因組的連接區(qū)序列，該連接區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序列16 (genbank號的AX342368. 1，EP167531A1， Detection of Genetically Modified Maize M0N810 and NK603 byMultiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods, J. Agric.FoodChem. 2004，52，3264-3268，公眾可從清華大學(xué)獲得轉(zhuǎn)基因玉米NK603。)，選取其中包含部分外源插入基因和部分玉米基因的序列作為靶序列Τ2，T2的核苷酸序列為序列表中的序列12 ；轉(zhuǎn)基因玉米M0N863的連接區(qū)為外源插入片段M0N863的5'端與玉米基因組的連接區(qū)序列，該連接區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序列17 (Event Specific Qualitativeand Quantitative Polymerase Chain Reaction Detection of Genetically ModifiedM0N863Maize Based on the 5' -Transgene Integration Sequence,LITAO YANG,SONGCIXU, AIHU PAN, CHANGS0NG YIN, KEffEI ZHANG, ZHENYING WANG, ZHIGANG ZHOU, AND DABINGZHANG, J. Agric.Food Chem. 2005，53，9312-9318,公眾可從清華大學(xué)獲得轉(zhuǎn)基因玉米M0N863。)，選取其中部分序列作為靶序列T3，T3的核苷酸序列為序列表中的序列13 ；轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的連接區(qū)為外源插入片段M0N810的5 '端與玉米基因組的連接區(qū)序列，該連接區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序列18 (5'-Nuclease PCRfor quantitative event-specific detection of the genetically modifiedMon8IOMaisGard maize, Askild Hoick、Marc Na、Luc Didierjean、Knut Rudi, Eur FoodRes Technol (2002) 214:449 - 453，公眾可從清華大學(xué)獲得轉(zhuǎn)基因玉米M0N810。)，選取其中部分序列作為靶序列T4，T4的核苷酸序列為序列表中的序列14 ；以未轉(zhuǎn)入任何外源基因的玉米(鄭單14)作為對照，zein基因為玉米中特異性zein基因，其核苷酸序列為序列表中的序列15，選取該基因與玉米基因組其他區(qū)域的連接區(qū)的部分片段作為靶序列Tl，Tl的核苷酸序列為序列表中的序列11。分別提取上述玉米、轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因玉米M0N863、轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的基因組DNA，得到DNAl、DNA2、DNA3、DNA4,將4種DNA混合(等體積混合，終濃度均為lfM)，得到混合DNA樣品。二、引物和探針的設(shè)計I、引物的設(shè)計引物對的設(shè)計遵循通用引物設(shè)計原則，引物I和引物2均不能結(jié)合玉米、轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因玉米M0N863、轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的基因組DNA，且引物I和引物2 二者不互補，具體序列如下引物I :5’ -TCCAAACTCATCAATGTATC-3’(序列 9)；引物2 :5’ -FAM-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT-3’(序列 10);引物2的5’末端標(biāo)記熒光基團FAM。2、探針的設(shè)計根據(jù)玉米、轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因玉米M0N863、轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的靶序列設(shè)計4種探針對如下，每一種探針對均由一個探針L和一個探針R組成每一個探針L的5’端到3’端依次為引物2序列，長度編碼區(qū)序列(粉紅色加粗堿 基)、限制性內(nèi)切酶識別序列(半個，斜體堿基)和與靶序列特異結(jié)合的識別序列I (綠色下劃線堿基);下面的探針LI、探針L2、探針L3、探針L4分別能特異結(jié)合玉米、轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因玉米M0N863、轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的靶序列；探針LI長度編碼區(qū)序列長度為Ont，探針L2長度編碼區(qū)序列長度為10nt，探針L3長度編碼區(qū)序列長度為20nt，探針L4長度編碼區(qū)序列長度為30nt。每一個探針R的5’端到3’端依次為引物I序列和與所述靶序列特異結(jié)合的識別序列2 (紅色下劃線堿基);下面的探針LI、探針L2、探針L3、探針L4分別能特異結(jié)合玉米、轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因玉米M0N863、轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的靶序列。探針Rl :5，-TCCAAACTCATCAATGTATCGTTGCATCATGCAGTACTGCA-3’(序列I);探針LI : 5，-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT 'AGGCCT TGGGTACCATGAACCCATGCA-3，(序列 2)；探針R2 :5 ’ -TCCAAACTCATCAATGTATCGGGATATCAAGCTTGGTACCACG-3，(序列3)；探針L2 :5，-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT 'GTGTCTGTCT/ GGCiTi CTTGTAGCGGCCCACG-3，(序列 4);探針R3 :5’ -TCCAAACTCATCAATGTATCCGGAAAGTTTGGTACACTTTGG-3>(序列7)；探針L3:
TCTAAAAGCTGCGGAATTGT ’GTGTGTGTCrrGTCTGTGTGTdGQ—'( GTTCGGATGGGTGTTCACC-3，(序列 8)；探針R4 :5’ -TCCAAACTCATCAATGTATCAATAAAGTGACAGATAGCTGGGCAA-3> (序列 9)；探針L4:
5’ -TCTAAAAGCTGCGGAATTGT ’GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTJGGCCL ACTCTAACGTTTAACATCCTTTGCCA-3 (序列 10)；Tl (ZEIN)的特異探針為探針LI和探針R1、T2(NK603)的特異探針為探針L2和探針R2、T3(M0N863)的特異探針為探針L3和探針R3、T4 (M0N810)的特異探針為探針L4和探針R4。AGGCCT為StuI限制性內(nèi)切酶。
實施例2、鑒定轉(zhuǎn)基因玉米鑒定的反應(yīng)原理在對目標(biāo)鏈基因檢測的過程中，目標(biāo)特異性區(qū)分探針Probe R和Probe L分別與目標(biāo)基因的正負(fù)鏈退火雜交。在第二圈PCR退火雜交的過程中，ProbeR可以與Probe L的第一圈PCR擴增產(chǎn)物退火雜交，在聚合延伸的過程中，跨越探針L中的半個限制性內(nèi)切酶識別序列產(chǎn)生完整的內(nèi)切酶識別序列。經(jīng)過幾圈的第一階段PCR擴增產(chǎn)生一定數(shù)量的帶有通用引物序列的擴增產(chǎn)物，以此擴增產(chǎn)物為模板，通用PCR引物I與熒光標(biāo)記的通用PCR引物2，在Vent exo-聚合酶和dNTPs存在的情況下進行第二階段的PCR擴增，從而產(chǎn)生大量的帶有熒光標(biāo)記和內(nèi)切酶識別序列的擴增產(chǎn)物。在限制性內(nèi)切酶的作用下，熒光標(biāo)記的PCR擴增產(chǎn)物從限制性內(nèi)切酶酶切位點處被水解成兩段，其中帶有熒光標(biāo)記的
一段的長度是預(yù)先編碼的、特定的，通過帶有熒光檢測器的HPLC分離檢測從而實現(xiàn)對目標(biāo)基因的特異性檢測。一、引物和探針濃度的摸索I、低溫PCR反應(yīng)PCR 體系為 50 μ L，其中 50 μ L IXThermopol buffer (IOmM KCl,20mM Tris-HCl,IOmM(NH4)2SO4,和O. I % Trion-X-100, pH8. 8),5 μ L探針對混合溶液(該混合溶液包含探針L1-L4和R1-R4) ；0. 5 μ L Taq DNA聚合酶(購白大連寶生物)，10 μ L IOOfM的DNA(在PCR反應(yīng)體系的終濃度為IOfM)、I μ L IOmM的dNTPs (A、T、G、C四種堿基在PCR反應(yīng)體系的終濃度均為200 μ Μ)。對各探針組中的各條探針在PCR反應(yīng)體系的不同終濃度進行考察探針LI和Rl在PCR反應(yīng)體系的終濃度均為10ρΜ、20ρΜ、30ρΜ ；探針L2和R2在PCR反應(yīng)體系的終濃度均為10ρΜ、20ρΜ、30ρΜ ；探針L3和R3在PCR反應(yīng)體系的終濃度均為ΙΟρΜ、20pM、30pM ；探針L4和R4在PCR反應(yīng)體系的終濃度均為10pM、20pM、30pM ；上述DNA 分別為 DNAl、DNA2、DNA3、DNA4 ；低溫PCR反應(yīng)程序為95°C變性3min，10個循環(huán)95°C變性IOs ;58°C退火30s ；72°C延伸反應(yīng)15s ;最后72°C延伸4min。得到PCR產(chǎn)物。2、高溫擴增分別向由I得到的PCR產(chǎn)物中加入2μ L通用引物I和引物2的混合溶液(在反應(yīng)體系中的終濃度均為ΙμΜ)，進行第二階段的高溫通用PCR擴增，反應(yīng)程序為95°C變性3min，30個循環(huán)95°C變性IOs ;68°C退火30s ;72°C延伸反應(yīng)15s，最后72°C延伸7min,4°C避光保存?zhèn)溆?，得到熒光?biāo)記擴增產(chǎn)物。將熒光標(biāo)記擴增產(chǎn)物進行檢測，結(jié)果如圖1A)所示，其中A、B、C、D分別代表針對 Tl(88bp)、T2(95bp)、T3 (107bp)、T4 (127bp)的擴增產(chǎn)物，1、2、3 分別代表 10pM、20pM、30pM的探針濃度，可以看出，Tl (ZEIN)的特異探針LI和探針Rl的最佳終濃度均為30pM ；T2 (NK603)的特異探針L2和探針R2的最佳終濃度均為IOpM ；T3 (Μ0Ν863)的特異探針L3和探針R3的最佳終濃度均為30ρΜ ；Τ4(Μ0Ν810)的特異探針L4和探針R4的最佳終濃度均為20ρΜο采用上述方法和體系，以DNA1、DNA2、DNA3、DNA4為模板，用上述優(yōu)化的探針濃度對不同 Tl (ZEIN)、T2(NK603)、T3(M0N863)、T4(M0N810)進行擴增T1 (ZEIN)的特異探針 LI和探針Rl的最佳終濃度均為30pM ；T2 (ΝΚ603)的特異探針L2和探針R2的最佳終濃度均為IOpM ；Τ3 (ΜΟΝ863)的特異探針L3和探針R3的最佳終濃度均為30ρΜ ；Τ4 (Μ0Ν810)的特異探針L4和探針R4的最佳終濃度均為20ρΜ。結(jié)果如圖IB 所示，Α、B、C、D 分別代表針對 Tl (ZEIN)、Τ2 (ΝΚ603)、Τ3 (Μ0Ν863)、Τ4 (Μ0Ν810)四個目標(biāo)基因的實時PCR擴增結(jié)果，Α、B、C、D所對應(yīng)的特異性區(qū)分探針對每條探針的終濃度分別均為30ρΜ、10ρΜ、30ρΜ、20ρΜ，可以看出，在以上所選特異性區(qū)分探針濃度下，相同濃度的不同的目標(biāo)基因能夠獲得數(shù)量相當(dāng)?shù)淖罱KPCR擴增產(chǎn)物，由此確證針對不同目標(biāo)基因所選的特異性區(qū)分探針的濃度是合適的。二、靈敏度檢測
按照上述一的方法體系，Tl (ZEIN)的特異探針LI和探針Rl的終濃度均為30ρΜ ；Τ2 (ΝΚ603)的特異探針L2和探針R2的終濃度均為IOpM ；Τ3 (Μ0Ν863)的特異探針L3和探針R3的終濃度均為30ρΜ ；Τ4(Μ0Ν810)的特異探針L4和探針R4的終濃度均為20ρΜ，以0,0. 01fM、0. lfM、lfM、10fM、100fM、lpM、2. 5pM、5pM、IOpM 不同終濃度的 DNAl 為模板進行Tl (ZEIN)擴增。結(jié)果如圖2所示，可以看到，隨著DNAl濃度的逐漸增加，所獲得的熒光峰面積逐漸增大。目標(biāo)鏈的濃度范圍跨越了大約5個數(shù)量級，從O. IfM到ΙΟρΜ，所獲得的熒光峰面積與目標(biāo)鏈濃度對數(shù)在O. IfM到IpM濃度范圍內(nèi)成準(zhǔn)線性關(guān)系，檢測下限為O. OlfM。三、鑒定轉(zhuǎn)基因玉米I、低溫PCR反應(yīng)PCR 體系為 50yL，其中 50 μ L IXThermopol buffer (IOmM KCl, 20mMTris-HCl, IOmM(NH4)2SO4,和 0. l%Trion-X-100, pH 8. 8)、含有 5 μ L 目標(biāo)特異性區(qū)分探針對混合溶液(探針LI到L4以及Rl到R4，其中LI和Rl的終濃度均為30pM，L2和R2的終濃度均為ΙΟρΜ，L3和R3的終濃度均為30pM，L4和R4的終濃度均為20pM) ;0. 5 μ L Taq DNA聚合酶(大連寶生物)，10 μ L模板、I μ L IOmM的dNTPs (A、T、G、C四種堿基的終濃度均為200 μ Μ),用水補足體積。低溫PCR反應(yīng)程序為95°C變性3min，10個循環(huán)95°C變性IOs ;58°C退火30s ；72°C延伸反應(yīng)15s ;最后72°C延伸4min。上述模板分別為由實施例I的一單獨的DNAl、DNA2、DNA3、DNA4和混合DNA樣本。得到PCR產(chǎn)物。2、高溫擴增向由I得到的PCR產(chǎn)物中加入2 μ L通用引物I和引物2的混合溶液(終濃度均為I μ Μ)，進行第二階段的高溫通用PCR擴增，反應(yīng)程序為95°C變性3min，30個循環(huán)95°C變性IOs ;68°C退火30s ;72°C延伸反應(yīng)15s，最后72°C延伸7min，4°C避光保存?zhèn)溆?，得到熒光?biāo)記擴增產(chǎn)物。3、限制性內(nèi)切酶反應(yīng)取26 μ L上述2的反應(yīng)液(熒光標(biāo)記擴增產(chǎn)物)，添加I μ L StuI限制性內(nèi)切酶，3μ L 10ΧΝΕΒ buffer 2 (500mM NaCl, IOOmM Tris-HCl, IOOmM MgCl2, and IOmM DTT, pH
7.9)，混勻，于37V反應(yīng)2h，然后65°C加熱20min進行StuI限制性內(nèi)切酶的滅活處理，然后4°C避光保存?zhèn)溆?，得到酶切產(chǎn)物，即為待測反應(yīng)混合溶液。3) HPLC 檢測取10 μ L的待測反應(yīng)混合溶液注入LC-20AT高效液相色譜儀(Shimadzu，Japan)中進行分析。色譜條件為分離色譜柱為Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m, 150 X 4. 6mm),保護柱為 Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m, I X 4. 6mm)，柱溫為 40°C，流速為 lml/min。流動相 A 為 0. IM醋酸三乙胺水溶液(TEAA)，pH 7. O ;流動相B為O. IM含25%乙腈的TEAA, pH 7. O。線性洗脫梯度為25min內(nèi)流動相B從50%增加到58%，IOmin內(nèi)流動相B從58%增加到60%。檢測器為RF-IOAxl突光檢測器(Shimadzu, Japan),最大激發(fā)光波長設(shè)定為492nm,最大發(fā)射光波長設(shè)定為520nm。結(jié)果如圖3所示，a、b、c、d分別為單獨的DNA1、DNA2、DNA3、DNA4的檢測結(jié)果；Mix為混合DNA (均為IfM)檢測結(jié)果；·可以看出，混合的和單獨的能找到對應(yīng)的峰DNAl的樣本的靶序列的對應(yīng)峰保留時間為19. 2min ；DNA2的樣本的靶序列的對應(yīng)峰保留時間為21. 4min ；DNA3的樣本的靶序列的對應(yīng)峰保留時間為23. 3min ；DNA4的樣本的靶序列的對應(yīng)峰保留時間為25. Omin ；說明該方法可以同時檢測多種轉(zhuǎn)基因玉米或者單獨檢測一種轉(zhuǎn)基因玉米。將上述保留時間對應(yīng)的峰送去測序，結(jié)果為DNAl的樣本靶序列的核苷酸序列為序列表中的序列11、DNA2的樣本靶序列的核苷酸序列為序列表中的序列12、DNA3的樣本靶序列的核苷酸序列為序列表中的序列13、DNA4的樣本靶序列的核苷酸序列為序列表中的序列14，進一步說明上述鑒定出3種轉(zhuǎn)基因玉米均轉(zhuǎn)入對應(yīng)的外源基因，其中DNAl的靶序列作為鑒定是否為玉米或者反應(yīng)體系是否正確的對照。將上述各種酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳顯色(依靠的是通用引物2自身標(biāo)記的FAM熒光基團，因FAM熒光基團的最大激發(fā)波長為492nm，凝膠成像系統(tǒng)的最大激發(fā)波長為300nm，所以所有條帶亮度顯得較暗)，結(jié)果如圖4所示，A、B、C、D分別代表Tl (ZEIN)、T2 (NK603)、T3 (M0N863), T4 (M0N810) DNA的擴增產(chǎn)物出代表四個DNA同時擴增產(chǎn)物；a、b、c、d、e分別代A、B、C、D、E五種擴增產(chǎn)物的酶切結(jié)果，可以看出A、B、C、D分別得到88bp、95bp、107bp、127bp的片段，E得到前面所有的目的片段;a、b、c、d得到23bp，33bp，43bp，53bp的片段，與預(yù)先編碼好的特定長度片段23bp，33bp，43bp，53bp大小符合，e得到前面所有的預(yù)先編碼好的特定長度片段。上述電泳結(jié)合酶切結(jié)果是由于該PCR擴增產(chǎn)物在特定位置包含有限制性內(nèi)切酶的酶切位點，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶的消化處理，該PCR產(chǎn)物被水解成兩段，其中一段是預(yù)先編碼設(shè)計好的，長度是特定的，且?guī)в袩晒鈽?biāo)記；剩余的另一段是隨意的，沒有熒光基團標(biāo)記，故在此實驗中看不到。因此，該圖再次證明本實驗的多重通用PCR擴增反應(yīng)的可行性。綜上所述，說明本專利所建立的品系特異性轉(zhuǎn)基因玉米多目標(biāo)同時檢測方法的是可行的。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測n種轉(zhuǎn)外源DNA植物的試劑盒，包括檢測探針組和通用引物對；所述轉(zhuǎn)外源DNA植物為將外源DNA分子轉(zhuǎn)入目的植物得到的轉(zhuǎn)基因植物； 所述通用引物對由引物I和引物2組成；所述引物I和所述引物2為均不與n種所述轉(zhuǎn)外源DNA植物的基因組和所述目的植物的基因組特異結(jié)合的單鏈DNA分子； 所述檢測探針組包括n組檢測探針對組成，每一組所述檢測探針對均由I條檢測探針L和其對應(yīng)的I條檢測探針R組成；每一條所述探針L自5’端到3’端依次由所述引物2、長度編碼區(qū)、限制性內(nèi)切酶識別位點和與一條檢測靶序列特異結(jié)合的識別序列組成；每一條所述探針R自5’端到3’端依次由所述引物I和與所述檢測靶序列特異結(jié)合的識別序列組成；每條所述檢測靶序列為每種所述轉(zhuǎn)外源DNA植物的基因組中所述外源DNA與所述目的植物基因組的連接序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于 所述引物2的5’末端標(biāo)記突光基團； 所述每一組檢測探針對特異結(jié)合一條所述檢測靶序列； 所述長度編碼區(qū)為不與所述轉(zhuǎn)外源DNA植物的基因組特異結(jié)合的單鏈DNA分子； 每一條所述檢測探針L的長度編碼區(qū)的大小均不相同； 不同的所述外源DNA對應(yīng)不同的所述檢測靶序列； 所述限制性內(nèi)切酶識別位點為StuI識別位點； 所述n不小于I ; 所述檢測探針組和通用弓I物對均為獨立包裝。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于 所述試劑盒還包括對照探針對，所述對照探針對由I條對照探針L和I條對照探針R組成；所述對照探針L自5’端到3’端依次由所述引物2、對照長度編碼區(qū)、限制性內(nèi)切酶識別位點和與對照靶序列特異結(jié)合的識別序列組成；所述對照探針R自5’端到3’端依次由所述引物I和與所述對照靶序列特異結(jié)合的識別序列組成；所述對照靶序列為所述目的植物的基因組中保守基因與所述目的植物基因組中的其他區(qū)域連接的序列； 所述對照長度編碼區(qū)為不與所述目的植物的基因組特異結(jié)合的單鏈DNA分子； 所述對照探針L的長度編碼區(qū)與每一條所述檢測探針L的大小均不相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑盒，其特征在于 所述對照探針Rl和所述對照探針LI的核苷酸序列分別為序列表中的序列I和序列2 ； 所述檢測探針組由如下I) -3)的3組探針對組成 1)探針L2和探針R2，所述探針R2和所述探針L2的核苷酸序列分別為序列表中的序列3和序列4 ； 2)探針L3和探針R3，所述探針R3和所述探針L3的核苷酸序列分別為序列表中的序列5和序列6 ； 3)探針L4和探針R4，所述探針R4和所述探針L4的核苷酸序列分別為序列表中的序列7和序列8 ； 所述通用弓I物對中的引物I的核苷酸序列為序列表中的序列9，所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列10 ;所述熒光基團為FAM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的試劑盒，其特征在于所述n個轉(zhuǎn)外源DNA植物為轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因玉米M0N863、轉(zhuǎn)基因玉米M0N810 ;所述目的植物為玉米，所述保守基因為zein基因；所述zein基因的核苷酸序列為序列表中的序列15 ； 所述轉(zhuǎn)基因玉米NK603的檢測靶序列為序列表中的序列12或序列16 ;與所述序列12所示的檢測祀序列特異結(jié)合的探針對為2)所示的探針對； 所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N863檢測靶序列為序列表中的序列13或序列17 ;與所述序列13所示的檢測靶序列特異結(jié)合的探針對為3)所示的探針對； 所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N810檢測靶序列為序列表中的序列14或序列18 ;與所述序列14所示的檢測祀序列特異結(jié)合的探針對為4)所示的探針對； 所述對照靶序列為序列表中的序列11 ;與所述序列11所示的對照靶序列特異結(jié)合的對照探針對為I)所示的探針對。
6.權(quán)利要求1-5中任一所述的試劑盒在檢測轉(zhuǎn)外源DNA植物中的應(yīng)用；所述轉(zhuǎn)外源DNA植物具體為所述轉(zhuǎn)基因玉米NK603、所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N863和/或所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N810。
7.—種檢測或輔助檢測待測樣本是否為轉(zhuǎn)外源DNA植物的方法，包括如下步驟 1)先確定轉(zhuǎn)外源DNA植物中的檢測靶序列和目的植物中的對照靶序列，再根據(jù)所述檢測靶序列和所述對照靶序列設(shè)計權(quán)利要求1-5中任一所述的試劑盒中的所述檢測探針組和所述通用引物對； 所述轉(zhuǎn)外源DNA植物為將外源DNA分子轉(zhuǎn)入所述目的植物得到的轉(zhuǎn)基因植物； 所述檢測靶序列為所述轉(zhuǎn)外源DNA植物的基因組中所述外源DNA與所述目的植物基因組連接的序列；所述對照靶序列為所述目的植物的基因組中保守基因與目的植物基因組其他區(qū)域連接的序列； 2)以所述待測樣本的基因組DNA為模板，用所述檢測探針組進行擴增，得到擴增產(chǎn)物； 3)以所述擴增產(chǎn)物為模板，用所述通用引物對進行再次擴增，得到熒光標(biāo)記擴增產(chǎn)物； 4)用限制性內(nèi)切酶酶切所述熒光標(biāo)記擴增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物； 5)HPLC檢測所述酶切產(chǎn)物，根據(jù)酶切產(chǎn)物是否含有對應(yīng)的所述檢測靶序列和所述對照靶序列，鑒定待測樣本是否為目的轉(zhuǎn)外源DNA植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述n不小于I; 步驟2)中，所述擴增的退火溫度為58°C ； 步驟3)中，所述再次擴增的退火溫度為68°C ； 步驟4)中，所述限制性內(nèi)切酶為StuI ； 步驟5)中，鑒定待測樣本是否為所述轉(zhuǎn)外源DNA植物為若所述酶切產(chǎn)物中含有所述檢測靶序列和所述對照靶序列，則所述待測樣本為或候選為所述轉(zhuǎn)外源DNA植物；若所述酶切產(chǎn)物中不含有所述檢測靶序列和所述對照靶序列，則所述待測樣本不為或候選不為所述轉(zhuǎn)外源DNA植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于 步驟5)中，所述待測植物為n種，所述n不小于I ;所述目的轉(zhuǎn)外源DNA植物為轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因玉米M0N863、轉(zhuǎn)基因玉米M0N810 ;所述目的植物為玉米，所述保守基因為zein基因；所述zein基因的核苷酸序列為序列表中的序列15 ； 所述轉(zhuǎn)基因玉米NK603的檢測靶序列為序列表中的序列12或序列16 ;與所述序列12所示的檢測祀序列特異結(jié)合的探針對為2)所示的探針對； 所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N863檢測靶序列為序列表中的序列13或序列17 ;與所述序列13所示的檢測靶序列特異結(jié)合的探針對為3)所示的探針對； 所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N810檢測靶序列為序列表中的序列14或序列18 ;與所述序列14所示的檢測祀序列特異結(jié)合的探針對為4)所示的探針對； 所述對照靶序列為序列表中的序列11 ;與所述序列11所示的對照靶序列特異結(jié)合的對照探針對為I)所示的探針對。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于 步驟5)中，所述HPLC的流動相為流動相A和流動相B，所述流動相A為pH為7. O、濃度為0. IM醋酸三乙胺水溶液；所述流動相B按照如下方法制備將乙腈溶于所述流動相A中，所述乙腈在所述流動相B中的濃度為25% (體積百分含量)； 所述流速為lml/min ； 所述序列11所示的檢測靶序列對應(yīng)的峰的保留時間為19. 2min ； 所述序列12所示的檢測靶序列對應(yīng)的峰的保留時間為21. 4min ； 所述序列13所示的檢測靶序列對應(yīng)的峰的保留時間為23. 3min ； 所述序列14所示的檢測靶序列對應(yīng)的峰的保留時間為25. Omin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測轉(zhuǎn)基因玉米的方法及其專用試劑盒，本發(fā)明提供的試劑盒，包括對照探針對、檢測探針組和通用引物對；所述轉(zhuǎn)外源DNA植物為將外源DNA分子轉(zhuǎn)入目的植物得到的轉(zhuǎn)基因植物；所述通用引物對由引物1和引物2組成；所述引物1和所述引物2為均不與n種所述轉(zhuǎn)外源DNA植物的基因組和所述目的植物的基因組特異結(jié)合的單鏈DNA分子。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明的方法靈敏度高、成本低廉、容易設(shè)計、操作便捷、重現(xiàn)性好、實現(xiàn)了多目標(biāo)轉(zhuǎn)基因樣品的同時檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102676671SQ20121014101
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者劉洋, 李景虹, 王紅旗 申請人:清華大學(xué)