專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒的生產(chǎn)方法，具體地，涉及一種豬傳染性胃腸炎病毒的生產(chǎn) 方法，更具體地，涉及一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒的方法。
背景技術(shù)：
豬傳染性胃腸炎(PorcineTransmissible Gastroenteritis, TGE)是由冠狀 病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)的豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV)引起的以豬嘔吐、腹灣、脫水為特征的傳染 病，對(duì)新生仔豬具有高度致死率，通常為100%。雖然不同年齡的豬對(duì)這種病毒均易感，但5 周齡以上的豬感染后，死亡率很低。Doyle于1945年報(bào)道美國(guó)首次發(fā)生該病后，世界上許多 國(guó)家都相繼報(bào)道了豬傳染性胃腸炎，1956年我國(guó)廣東首次發(fā)生該病后，全國(guó)大多省份也有 發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重危害。目前，國(guó)內(nèi)豬傳染性胃腸炎疫苗生產(chǎn)唯一依靠細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法實(shí)現(xiàn)。該傳統(tǒng)工藝 勞動(dòng)強(qiáng)度大，耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，生產(chǎn)成本高；容易被環(huán)境污染；不同生產(chǎn)批次間或同一生產(chǎn) 批次不同瓶間的差異大；難以擴(kuò)大生產(chǎn)；容易出現(xiàn)被細(xì)菌或其它病毒污染而致的疫苗質(zhì)量 隱患，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒的 方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)制備單層傳代細(xì)胞；2)制備豬傳染性胃腸炎病毒生產(chǎn)用種毒；3)將步驟1)制備的單層傳代細(xì)胞消化后，用細(xì)胞生長(zhǎng)液進(jìn)行懸浮，制備成細(xì)胞密 度為1-3 X 105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種到生物反應(yīng)器內(nèi)，使傳代細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微 載體上吸附培養(yǎng)；4)當(dāng)傳代細(xì)胞長(zhǎng)至微載體的80% -90%，空球率低于5%，滿(mǎn)球率大于80%，細(xì)胞 計(jì)數(shù)達(dá)到3-5X 106個(gè)/mL以上時(shí)，以2-5%的接種量接種步驟2)制備的種毒，進(jìn)行病毒的 吸附培養(yǎng)；4)當(dāng)微載體上的傳代細(xì)胞80%以上病變時(shí)，收獲病毒液。其中，所述方法還包括在步驟3)中的細(xì)胞懸液接種到生物反應(yīng)器之前，按生物反 應(yīng)器總體積的50-70%加入無(wú)菌細(xì)胞生長(zhǎng)液，且每升無(wú)菌細(xì)胞生長(zhǎng)液中按4-10g/L濃度加 入微載體，啟動(dòng)生物反應(yīng)器，低轉(zhuǎn)速攪拌20-50分鐘。其中，所述的方法還包括將微載體加入到細(xì)胞生長(zhǎng)液之前將微載體進(jìn)行清洗和滅 菌的步驟，依次為用PBS浸泡微載體3小時(shí)以上；用PBS清洗微載體3-5遍；用PBS浸泡微 載體，121°C蒸汽滅菌20-50min。
其中，步驟2)豬傳染性胃腸炎病毒生產(chǎn)用種毒的制備具體包括如下步驟用病毒培養(yǎng)液將豬傳染性胃腸炎病毒種毒按2-5%比例接種到單層傳代細(xì)胞中進(jìn) 行培養(yǎng)，至細(xì)胞80%以上病變時(shí)收獲病毒液；再將此病毒液作為種毒，在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞 適應(yīng)性連續(xù)傳代復(fù)壯，每次傳代產(chǎn)物進(jìn)行病毒TCID5(i和無(wú)菌檢測(cè)，傳至病毒TCID5(i穩(wěn)定且達(dá) 到107TCID5(l/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，作為生產(chǎn)用種毒。其中，所述的病毒培養(yǎng)液可為本領(lǐng)域常 規(guī)的病毒培養(yǎng)液，優(yōu)選的配方為質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是98% -99% MEM液、1 % -2%牛血清、終濃 度為100-200IU/mL的抗菌素，pH值為6. 8-7. 5。其中，步驟3)中的單層傳代細(xì)胞用EDTA-胰酶消化液進(jìn)行消化，所述的EDTA-胰 酶消化液為含有質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0. 05% -0. 25%的胰酶和0. 02%的EDTA的Hank’ S液。其中，步驟3)中所述的細(xì)胞懸液中傳代細(xì)胞的密度為1-3X105個(gè)/mL。其中，步驟3)中所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液的配方為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%-98% MEM液、 2% -5%牛血清、終濃度為100-200IU/mL的抗菌素，pH值為6. 8-7. 5。其中，所述的傳代細(xì)胞可為本領(lǐng)域中常規(guī)用于病毒培養(yǎng)的細(xì)胞，優(yōu)選為ST細(xì)胞或 veix)細(xì)胞，最優(yōu)選為ST細(xì)胞。本發(fā)明中，生物反應(yīng)器設(shè)定的參數(shù)優(yōu)選為培養(yǎng)溫度35-381411值6.8-7.5、溶氧 50% -70%、攪拌速度 50-80rpm。其中，所述的豬傳染性胃腸炎病毒可為任何常規(guī)的豬傳染性胃腸炎病毒毒株，優(yōu) 選為浮羽疫苗株、h-5疫苗株或華毒株。其中，所述的微載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的任何微載體，常見(jiàn)的有大孔明膠微載體、聚 苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體、磁性 微載體、Cytodexl、Cytodex 2、Cytodex 3、Cytopore 和 / 或 Cytoline,優(yōu)選為 Cytodexl、 Cytodex 2、Cytodex 3、Cytopore 和 / 或 Cytoline。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)用生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)代替轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制造豬傳染性胃腸 炎病毒疫苗，可解決生產(chǎn)效率低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、病毒效價(jià)低的問(wèn)題，通過(guò)生產(chǎn)技術(shù)和生 產(chǎn)工藝的改變，提高病毒單位培養(yǎng)效價(jià)5-10倍，全面提升疫苗質(zhì)量和產(chǎn)量，提高疫苗的安 全性。以vero細(xì)胞為例，國(guó)內(nèi)先進(jìn)水平的生物反應(yīng)器生產(chǎn)可達(dá)10VmL，而轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)一般106/ mL已經(jīng)為極限。(2)本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本，而且生產(chǎn)周期短，每個(gè)生產(chǎn)周期僅需5-6天， 相比現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)法的6-7天以上明顯縮短。(3)低污染1罐=100 2000個(gè)轉(zhuǎn)瓶，概率來(lái)講操作環(huán)節(jié)越少污染幾率越低。(4)生產(chǎn)工藝可控高精密培養(yǎng)、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶氧、產(chǎn)氣、PH、細(xì)胞狀態(tài)等等，綜合參 數(shù)設(shè)定培養(yǎng)曲線(xiàn)、直接保證載體細(xì)胞的狀態(tài)；批量大、批間差?。还?jié)省空間、人員(最高可達(dá) 1 : 75);一旦成型工藝將按部就班十分穩(wěn)定。


圖1為本發(fā)明利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒的方法流程圖。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1(1)選擇生物反應(yīng)器作為培養(yǎng)的手段7L瑞士 Lambda生物反應(yīng)器。(2)選擇微載體作為細(xì)胞貼附生長(zhǎng)的載體微載體Cytodex 2。(3)微載體的清洗、滅菌方法1)稱(chēng)量Cytodex 2微載體lOg/し使用2L PBS液浸 泡3小時(shí)。2~)每次用2し？85液清洗3遍?；眉尤?し？85液浸泡微載體，121で蒸汽滅菌 30mino(4)選擇ST細(xì)胞作為制苗用細(xì)胞。(5)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)上述細(xì)胞經(jīng)601ム_胰酶(*0.25^^*_、0.02% EDTA的Hank，S液)消化傳代，以含95% MEM液、5%小牛血清、200貝/^し的青霉素鈉和硫 酸鏈霉素…??！值調(diào)整為7. 2的細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C。形成良好單層時(shí)，用 于接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)。(6)細(xì)胞毒種的繁殖用病毒培養(yǎng)液(含小牛血清2%的1^1液、終濃度為200貝/ mL的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，將豬傳染性胃腸炎病毒華毒株的種毒按體積比2%比例接種 生長(zhǎng)良好的上述細(xì)胞單層，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C。至細(xì)胞80%以上病變時(shí)收獲病毒 液；測(cè)定病毒的幾105(|，待病毒效價(jià)穩(wěn)定且達(dá)到107TCID5(l/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，將該病毒作 為生產(chǎn)用種毒。(7) ST在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng)取方瓶上生長(zhǎng)良好的ST細(xì)胞，用pH值 為7. 2的？85清洗ー遍，加入前述的EDTA-胰酶消化液消化，待細(xì)胞層開(kāi)始出現(xiàn)整片脫落， 加入所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液，吹懸制成細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計(jì)數(shù)密度按2 X 10VmL接種反應(yīng)器中。 生物反應(yīng)器設(shè)定如下參數(shù)溫度37°C、pH值7. 2、攪拌速度60印!^、溶氧含量50%進(jìn)行反應(yīng)器 自動(dòng)控制培養(yǎng)。(8)制苗毒液的繁殖培養(yǎng)后第三日待觀察微載體上細(xì)胞基本長(zhǎng)滿(mǎn)(95%以上)， 且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)もズ川ツ！^以上后，按體積比為？^接種病毒。設(shè)定溫度34で、？11值6.8、 攪拌速度70印1^、溶氧含量30%等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)。接毒后每隔ー定時(shí) 間取反應(yīng)器中微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測(cè)樣品的TCID5tlt5待觀察微載體上 細(xì)胞基本全部脫落(約36h)，且00值明顯上升趨勢(shì)，停止反應(yīng)器攪拌，待微載體全部沉到反 應(yīng)器底部后，分別收獲上清液和微載體。收獲病毒液的處理收獲上清經(jīng)3次反復(fù)凍融后，過(guò)濾去除細(xì)胞碎片后_20で冷凍 保存?zhèn)溆?。?shí)施例2(1)選擇生物反應(yīng)器作為培養(yǎng)的手段7L瑞士 Lambda生物反應(yīng)器。(2)選擇微載體作為細(xì)胞貼附生長(zhǎng)的載體微載體Cytodex 3。(3)微載體的清洗、滅菌方法1)稱(chēng)量Cytodex 3微載體eg/し使用2L PBS液浸 泡3小時(shí)。2~)每次用2L PBS液清洗3遍。幻加入2LPBS液浸泡微載體，121で蒸汽滅菌 30mino(4)選擇vero細(xì)胞作為制苗用細(xì)胞。(5)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)上述細(xì)胞經(jīng)601ム_胰酶(*0.25^^*_、0.02% EDTA的Hank，S液)消化傳代，以含96% MEM液、4%小牛血清、200貝/^し的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，pH值調(diào)整為7. 2的細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C。形成良好單層時(shí)，用 于接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)。(6)細(xì)胞毒種的繁殖用病毒培養(yǎng)液(含小牛血清1%的MEM液、終濃度為100IU 的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，pH值調(diào)整為7. 3),將豬傳染性胃腸炎病毒華毒株的種毒按體積 比為5%比例接種生長(zhǎng)良好的上述細(xì)胞單層，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C。至細(xì)胞80%以上 病變時(shí)收獲病毒液；測(cè)定病毒的TCID5(I，待病毒效價(jià)穩(wěn)定且達(dá)到107TCID5(l/mL以上時(shí)停止復(fù) 壯，將該病毒作為生產(chǎn)用種毒。(7)vero細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng)取方瓶上生長(zhǎng)良好的vero細(xì) 胞，用pH值為7. 2的PBS清洗一遍，加入前述的EDTA-胰酶消化液消化，待細(xì)胞層開(kāi)始出現(xiàn) 整片脫落，加入所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液，吹懸制成細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計(jì)數(shù)密度按1 X 105/mL接種 反應(yīng)器中。生物反應(yīng)器設(shè)定如下參數(shù)溫度37°C、pH值7. 2、攪拌速度60rpm、溶氧含量50% 進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)。(8)制苗毒液的繁殖培養(yǎng)后第三日待觀察微載體上細(xì)胞基本長(zhǎng)滿(mǎn)(95%以上)， 且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)5X106/mL以上后，按體積比為2%進(jìn)行病毒接種。設(shè)定溫度38°C、pH值 7. 5、攪拌速度50rpm、溶氧含量50%等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)。兩天后收獲病 毒液。收獲病毒液的處理收獲上清經(jīng)3次反復(fù)凍融后，過(guò)濾去除細(xì)胞碎片后-20°C冷凍保 存?zhèn)溆?。?duì)比例1轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)豬傳染性胃腸炎病毒(1)選擇轉(zhuǎn)瓶作為培養(yǎng)的手段3L細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶，ZP-01-16轉(zhuǎn)瓶機(jī)。(2)選擇vero細(xì)胞作為制苗用細(xì)胞。(3)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)上述細(xì)胞經(jīng)EDTA-胰酶(含0. 25 %胰酶、0. 02 % EDTA的Hank’ S液)消化傳代，以含95% MEM液、5%小牛血清、200IU/mL的青霉素鈉和硫 酸鏈霉素，pH值調(diào)整為7. 2的細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C。形成良好單層時(shí)，用 于接種于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。(4)細(xì)胞毒種的繁殖用病毒培養(yǎng)液(含血清1%的MEM液、終濃度為200IU的青 霉素鈉和硫酸鏈霉素，pH值調(diào)整為7. 3),將豬傳染性胃腸炎病毒華毒株的種毒按體積比為 5%比例接種生長(zhǎng)良好的上述細(xì)胞單層，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C。至細(xì)胞80%以上病變 時(shí)收獲病毒液；測(cè)定病毒的TCID5(I，待病毒效價(jià)穩(wěn)定且達(dá)到107TCID5(l/mL以上時(shí)停止復(fù)壯， 將該病毒作為生產(chǎn)用種毒。(5) vero細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中的培養(yǎng)取方瓶上生長(zhǎng)良好的vero細(xì)胞用pH值為7. 2的 PBS清洗一遍，加入所述的EDTA-胰酶消化液消化，待細(xì)胞層開(kāi)始出現(xiàn)整片脫落，加入所述 的細(xì)胞生長(zhǎng)液，吹懸制成細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計(jì)數(shù)密度按3 X 105/mL接種3000mL轉(zhuǎn)瓶，轉(zhuǎn)瓶培 養(yǎng)量為300mL，37°C，20rpm/h,培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層。(6)制苗毒液的繁殖培養(yǎng)后第三日待觀察，轉(zhuǎn)瓶壁上細(xì)胞基本長(zhǎng)滿(mǎn)(95%以上)， 且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)5X 106/mL以上后進(jìn)行病毒接種。按體積比為2%的接種量接種病毒，4 天后收獲病毒上清液。收獲病毒液的處理收獲上清經(jīng)3次反復(fù)凍融后，過(guò)濾去除細(xì)胞碎片 后-20°C冷凍保存?zhèn)溆?。試?yàn)例1半成品檢驗(yàn)1.收獲病毒液毒價(jià)的測(cè)定將以上收獲的細(xì)胞病毒液混合后取樣，測(cè)定毒價(jià)。
結(jié)果表明，實(shí)施例I和2用生物反應(yīng)器生產(chǎn)的病毒的病毒含量彡107TCID5(l/mL,而對(duì)比例I轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)的病毒含量< 106TCID5(l/mL。2.滅活后半成品檢驗(yàn)滅活按總量的O. 2%向?qū)嵤├齀 2和對(duì)比例I的病毒液中加入甲醛溶液，振搖2分鐘，置37°C條件滅活24小時(shí)，期間定時(shí)攪拌混勻。無(wú)菌檢驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》附錄301頁(yè)進(jìn)行，本發(fā)明實(shí)施例和對(duì)比例的病毒均無(wú)菌生長(zhǎng)。滅活檢驗(yàn)滅活后，以無(wú)菌操作從病毒滅活液中取樣，按I %比例接種健康ST細(xì)胞單層，37°C培養(yǎng)3天，按此方法，連續(xù)傳代3代，細(xì)胞不應(yīng)出現(xiàn)病變?yōu)楹细?，本發(fā)明實(shí)施例和對(duì)比例均無(wú)病變，故產(chǎn)品合格。3.生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)病毒免疫效果的比較各取200 μ L效價(jià)為I X 106/mL的病毒免疫無(wú)TGEV中和抗體的仔豬各二十頭，以200 μ L病毒培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，結(jié)果生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒免疫組的中和抗體效價(jià)比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的高4倍，結(jié)果如下表。表I生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)病毒免疫效果的比較
權(quán)利要求
1.一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟 1)制備單層傳代細(xì)胞； 2)制備豬傳染性胃腸炎病毒生產(chǎn)用種毒； 3)將步驟I)制備的單層傳代細(xì)胞消化后，用細(xì)胞生長(zhǎng)液進(jìn)行懸浮，制備成細(xì)胞密度為1-3 X IO5個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種到生物反應(yīng)器內(nèi)，使傳代細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體上吸附培養(yǎng)； 4)當(dāng)傳代細(xì)胞長(zhǎng)至微載體的80%-90%，空球率低于5%，滿(mǎn)球率大于80%，細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到3-5X106個(gè)/mL以上時(shí)，以2-5%的接種量接種步驟2)制備的種毒，進(jìn)行病毒的吸附培養(yǎng)； 4)當(dāng)微載體上的傳代細(xì)胞80%以上病變時(shí)，收獲病毒液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，還包括在步驟3)細(xì)胞懸液接種到生物反應(yīng)器之前，按生物反應(yīng)器總體積的50-70%加入無(wú)菌細(xì)胞生長(zhǎng)液，且每升無(wú)菌細(xì)胞生長(zhǎng)液中按4-10g/L濃度加入微載體，啟動(dòng)生物反應(yīng)器，低轉(zhuǎn)速攪拌20-50分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，還包括將微載體加入到細(xì)胞生長(zhǎng)液之前將微載體進(jìn)行清洗和滅菌的步驟，依次為用PBS浸泡微載體3小時(shí)以上；用PBS清洗微載體3-5遍；用PBS浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌20-50min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟2)豬傳染性胃腸炎病毒生產(chǎn)用種毒的制備具體包括如下步驟 用病毒培養(yǎng)液將豬傳染性胃腸炎病毒種毒按2-5%比例接種到單層傳代細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，至細(xì)胞80%以上病變時(shí)收獲病毒液；再將此病毒液作為種毒，在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性連續(xù)傳代復(fù)壯，每次傳代產(chǎn)物進(jìn)行病毒TCID5tl和無(wú)菌檢測(cè)，傳至病毒TCID5tl穩(wěn)定且達(dá)到107TCID50/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，作為生產(chǎn)用種毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)中的單層傳代細(xì)胞用EDTA-胰酶消化液進(jìn)行消化，所述的EDTA-胰酶消化液為含有質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.05% -0. 25%的胰酶和 0. 02%的 EDTA 的 Hank’ S 液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液的配方為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95% -98% MEM液、2% _5%牛血清、終濃度為100_200IU/mL的抗菌素，pH 值為 6. 8-7.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的傳代細(xì)胞為ST細(xì)胞或vero細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，生物反應(yīng)器設(shè)定的參數(shù)為培養(yǎng)溫度 35-38°C、pH 值 6. 8-7. 5、溶氧 50% -70%、攪拌速度 50_80rpm。
9.根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的豬傳染性胃腸炎病毒為浮羽疫苗株、h-5疫苗株或華毒株。
10.根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的微載體為大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體、磁性微載體、CytodexK Cytodex 2、Cytodex 3, Cytopore 和 / 或 Cytoline0
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒的方法，包括如下步驟1)制備單層傳代細(xì)胞；2)制備豬傳染性胃腸炎病毒生產(chǎn)用種毒；3)將步驟1)制備的單層傳代細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種到生物反應(yīng)器內(nèi)，使傳代細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體上吸附培養(yǎng)；4)當(dāng)傳代細(xì)胞長(zhǎng)至微載體的80％-90％，空球率低于5％，滿(mǎn)球率大于80％，細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到3-5×106個(gè)/mL以上時(shí)，以2-5％的接種量接種步驟2)制備的種毒，進(jìn)行病毒的吸附培養(yǎng)；4)當(dāng)微載體上的傳代細(xì)胞80％以上病變時(shí)，收獲病毒液。本發(fā)明方法可解決生產(chǎn)效率低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、病毒效價(jià)低的問(wèn)題，可提高病毒單位培養(yǎng)效價(jià)5-10倍，全面提升疫苗質(zhì)量和產(chǎn)量，提高疫苗的安全性。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102660510SQ20121014145
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者于萍萍, 侯艷紅, 王貴華 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司