專利名稱：一種提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌培養(yǎng)基，具體地，涉及一種提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
黃芪多糖是中藥黃芪有效成分，由α -糖甙鍵連接而成的分子量為37500左右的植物多糖，水解后可檢出葡萄糖、豐乳糖和阿拉伯糖，三種糖克分子比為1:0. 95:0. 70。黃芪多糖是一種有效免疫增強劑，并能誘導(dǎo)機體益生菌增殖，促進機體微生態(tài)平衡。研究報道表明黃芪多糖還具有增強細胞新陳代謝、促進血液循環(huán)、抗病毒、抗腫瘤、抗應(yīng)激等保健功效，已被廣泛應(yīng)用作功能性配料或直接服用。目前，國內(nèi)外市場上的黃芪多糖均靠提取而來，據(jù)資料查新可知的黃芪多糖提取方法有8種，包括傳統(tǒng)的水提醇沉法、超微粉碎法、超聲細胞粉碎法、超濾法、微波提取法、纖維素酶法、堿水提取法、醇堿提取法。傳統(tǒng)水提醇沉法是目前最常用的提取方法，黃芪多 糖的提取率平均為5. 34%左右；超微粉碎法，超微粉中黃芪多糖的提取率為4. 69%左右，而粗粉中黃芪多糖的提取率僅為2. 16%左右；超聲細胞粉碎法黃芪多糖的提取率為7. 6%左右；微波提取法黃芪多糖的提取率為6. 55%左右；超濾法提黃芪多糖得率低于水提醇沉法，但產(chǎn)物中多糖含量高；堿水提取法得黃芪多糖的提取率在4. 7-19. 2%之間，穩(wěn)定性較差；醇喊提取法得黃苗多糖的提取率最聞可達19. 15% ;纖維素酶法的黃苗多糖提取率聞于水提醇沉法，提取物多糖含量高，但因提取不穩(wěn)定而沒有科學(xué)的提取率參考數(shù)據(jù)。通常，制備黃芪多糖時消耗原藥材量比較大，中藥材的利用率不高。發(fā)酵法提取黃芪多糖，不僅可增加產(chǎn)物中黃芪多糖的含量，而且還能改善提取物在機體內(nèi)的生物利用度。發(fā)酵法制備黃芪多糖是利用特定的發(fā)酵菌種對黃芪進行發(fā)酵處理，在這一處理過程中需要使用特定培養(yǎng)基進行發(fā)酵。一般來講普通的發(fā)酵培養(yǎng)基可以勝任這一工作，如MRS培養(yǎng)基、GAM培養(yǎng)基、BBL培養(yǎng)基、M17肉湯培養(yǎng)基等，發(fā)酵產(chǎn)物中均可提取出黃芪多糖，但提取率和提取產(chǎn)物中黃芪多糖含量均比較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供了一種提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，它可使黃芪多糖的提取率明顯增高且非常穩(wěn)定、在提取產(chǎn)物中的含量顯著增加。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案
一種提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，由以下重量份數(shù)的成分制備完成乳清粉
3.908-6. 408 ;蛋白胨:0. 445-0. 467 ;葡萄糖0. 04-0. 2 ;酵母粉0. 102-0. 522 ;無機鹽:O. 142-0. 246 ;黃芪粉12. 54-19. 46 ;水200 ;所述無機鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。優(yōu)選地，由以下重量份數(shù)的成分制備完成
乳清粉5. 158 ;蛋白胨0. 456 ;葡萄糖0. 12 ;酵母粉0. 312 ;無機鹽0. 194 ;黃芪粉16 ;水200。在發(fā)酵中，所使用的發(fā)酵菌種是非解乳糖鏈球菌{Streptococcusalactolyticus) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227，該菌為雞腸道內(nèi)容物的益生菌株非解乳糖鏈球菌經(jīng)誘變和馴化得到的，該菌株已于2010年10月19日保藏于中國微生物菌保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4227。發(fā)酵的條件為
發(fā)酵時間58-62小時；
發(fā)酵環(huán)境厭氧發(fā)酵；發(fā)酵溫度:36. 5-37. 50C ；
轉(zhuǎn)數(shù)118-122轉(zhuǎn)/分鐘；
初始 pH :6. 4-7.4。發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌常規(guī)高壓滅菌高壓鍋121°C 20min ;發(fā)酵罐121°C 15min。發(fā)酵培養(yǎng)基制備完成后，發(fā)酵菌種的接入量為2% (體積百分數(shù)V/V)。發(fā)酵產(chǎn)物中黃芪多糖的提取常規(guī)水提醇沉法。發(fā)酵產(chǎn)物中黃芪多糖的測定方法以葡萄糖作標(biāo)準曲線，采用苯酚一硫酸法，在紫外一可見分光光度計下測定。本發(fā)明涉及的發(fā)酵培養(yǎng)基組成成份中，黃芪粉占了其中總固體量的大部分，約71. 94%，因此認為是發(fā)酵法處理黃芪。本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為常用培養(yǎng)的組成成分，易于獲得；用作培養(yǎng)來源于雞腸道內(nèi)容的菌株非解乳糖鏈球菌(Streptococcus alactolyticus) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227，不僅有利于菌株的增殖，而且培養(yǎng)過程中的條件容易控制。采用本發(fā)明提出的發(fā)酵培養(yǎng)基比普通發(fā)酵培養(yǎng)基有更好的提取率與效果，發(fā)酵產(chǎn)物中黃芪多糖的提取率穩(wěn)定在19. 34±4. 56%，提取物中黃芪多糖含量為42. 5±10. 28%。本發(fā)明實用性強，操作簡便，對發(fā)酵設(shè)備及生產(chǎn)條件沒有特殊要求，利用一般發(fā)酵廠的設(shè)備和生產(chǎn)條件即可生產(chǎn)，投資少、見效快、效益高，不但適合于大規(guī)模的生產(chǎn)還適合于小批量的生產(chǎn)，具有廣闊的實際應(yīng)用前景。
具體實施例方式實施例I
(一)提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分制備完成
按照乳清粉5. 158 g ;蛋白胨0. 456 g ;葡萄糖0. 12 g ;酵母粉0. 312 g ;無機鹽(磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀):0. 194 g ;黃芪粉16 g ;水200 ml的重量配比稱量各組分，加入500ml的三角瓶，于高壓鍋中121 °C，20min滅菌，調(diào)整pH至6. 9備用。(二)發(fā)酵菌種的擴大培養(yǎng)
(I)將發(fā)酵菌種LZMYFGM9經(jīng)MRS培養(yǎng)基斜面，發(fā)酵條件為(接種量為103cfu)
發(fā)酵時間16-20小時；
發(fā)酵環(huán)境厭氧發(fā)酵；
發(fā)酵溫度:36. 5-37. 50C ；
初始 pH: 6. 0-6.4。(2)然后，接入一級或二級種子培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件為(接種量為IO3Cfu)發(fā)酵時間16-20小時；
發(fā)酵環(huán)境厭氧發(fā)酵；
發(fā)酵溫度:36. 5-37. 50C ；
初始 pH: 5. 5-5.9其中，MRS斜面培養(yǎng)基為市售商品，(生產(chǎn)廠家廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；批號200904172)其成份為1%蛋白胨，1%牛肉浸膏，O. 5%酵母粉，O. 2%枸櫞酸二銨，2%葡萄糖，O. 5% 乙酸鈉，O. 2% 磷酸氫二鉀，O. 058% 的 MgSO4 · 7H20,0. 025% 的 MnSO4 · 4H20,0. 1% (V/V)的吐溫80，ρΗ6· 5，3%瓊脂。種子培養(yǎng)基為市售商品(生產(chǎn)廠家廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；批號201106293)，其成份為1%蛋白胨，1%牛肉浸膏，O. 5%酵母粉，O. 2%枸櫞酸二銨，2%葡萄糖，O. 5% 乙酸鈉，O. 2% 磷酸氫二鉀，O. 058% 的 MgSO4 · 7Η20，0· 025% 的 MnSO4 · 4H20，0. 1% (V/V)的吐溫80，ρΗ6· 5。(三)發(fā)酵反應(yīng)
將擴大培養(yǎng)的生產(chǎn)菌種接入(一)制備的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入量為2% (V/V)，置于厭氧罐中，于37攝氏度、120轉(zhuǎn)/分條件下反應(yīng)60小時。(四)分離與測定
發(fā)酵完畢后，離心法將固液分離，分離后，上清部分用95%乙醇沉淀2次；沉淀部分用水煮后離心,取液體部分濃縮,再用95%乙醇沉淀2次；
兩部分沉淀提取物合并后冰凍干燥，稱得提取物的重量為2. 365克，提取率為14. 78%，黃芪多糖含量為31. 22%。實施例2
提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分制備完成
按照乳清粉38. 69 g;蛋白胨3.42 g ;葡萄糖0. 9 g ;酵母粉2. 34 g;無機鹽(磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀):1. 455 g;黃芪粉120 g;水1. 5 L的重量配比稱量各組分，加入IOL厭氧發(fā)酵罐，1211，201^11滅菌，調(diào)整？!1至6.9備用。其余步驟與實施例I相同。所得提取物的總重為28. 68g，黃芪多糖的提取率為23. 90%，黃芪多糖的含量為52. 78%ο實施例3
按照乳清粉128. 95 g;蛋白胨11. 4 g;葡萄糖3.0 g ;酵母粉7. 8 g;無機鹽(磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀):4. 85 g;黃芪粉400 g;水5 L的重量配比稱量各組分，加入IOL厭氧發(fā)酵罐，121°C，20min滅菌，調(diào)整pH至6· 9備用。其余步驟與實施例I相同。所得提取物的總重為78. 04g，黃芪多糖的提取率為19. 51%，黃芪多糖的含量為41. 20%ο實施例4
按照乳清粉154. 74 g;蛋白胨13.68 g ;葡萄糖3. 6 g ;酵母粉9. 36 g;無機鹽(磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀):29. 10 g;黃芪粉480 g;水6 L的重量配比稱量各組分，加入IOL厭氧發(fā)酵罐，121°C , 20min滅菌，調(diào)整pH至6. 9備用。
其余步驟與實施例I相同。所得提取物的總重為95. 42g，黃芪多糖的提取率為19. 88%，黃芪多糖的含量為43. 15%。實施例5
提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，由以下成分制備完成
乳清粉3. 908 8;蛋白胨0.4458;葡萄糖0.04 g ;酵母粉0. 102 g ;無機鹽0. 142g;黃芪粉12. 54 g;水200 ml，高壓鍋，121 °C，20min滅菌，調(diào)整pH至6. 9備用。其余步驟與實施例I相同。 所得提取物的總重為1.911g，黃芪多糖的提取率為15. 24%，黃芪多糖的含量為35. 21%。實施例6
提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，由以下成分制備完成
乳清粉6. 408g ;蛋白胨0. 467g ;葡萄糖0. 2g ;酵母粉0. 522g ;無機鹽0. 246g ;黃芪粉19. 46g ;水:200 ml，高壓鍋121。。，20min滅菌，調(diào)整pH至6. 9備用。其余步驟與實施例I相同。所得提取物的總重為4. 100g，黃芪多糖的提取率為21. 07%，黃芪多糖的含量為38. 12%。最后應(yīng)說明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，由以下重量份數(shù)的成分制備完成乳清粉3. 908-6. 408 ;蛋白胨0. 445-0. 467 ;葡萄糖0. 04-0. 2 ;酵母粉0. 102-0. 522 ;無機鹽0. 142-0. 246 ;黃芪粉12. 54-19. 46 ;水200 ;所述無機鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，由以下重量份數(shù)的成分制備完成乳清粉5. 158 ;蛋白胨0. 456 ;葡萄糖0. 12 ;酵母粉0. 312 ;無機鹽O. 194 ;黃芪粉16 ;水200。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，由以下重量份數(shù)的成分制備完成乳清粉3.908-6.408；蛋白胨0.445-0.467；葡萄糖0.04-0.2；酵母粉0.102-0.522；無機鹽0.142-0.246；黃芪粉12.54-19.46；水200；所述無機鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。本發(fā)明公開的提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基能夠使黃芪多糖的提取率明顯增高且非常穩(wěn)定、在提取產(chǎn)物中的含量顯著增加。
文檔編號C12R1/46GK102643771SQ20121014183
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月9日
發(fā)明者孟嘉仁, 張凱, 張景艷, 李建喜, 楊志強, 王學(xué)智 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所