專利名稱：產(chǎn)中性植酸酶菌株的制備和發(fā)酵條件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬微生物發(fā)酵研究開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及產(chǎn)植酸酶菌株的制備和發(fā)酵條件的研究，適合發(fā)酵エ業(yè)研究或エ業(yè)化生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
植酸是1872年由prefer首先發(fā)現(xiàn)的，又名肌醇六磷酸酷，屬于有機(jī)磷酸酯化合 物。為淡黃色或淡褐色漿狀液體，幾乎不以游離狀態(tài)存在，在生物體內(nèi)常以植酸鹽的形式存在。它廣泛地存在于植物種子中，尤以米糠中含量最高。植酸是從植物中或植物加工后剩余物中提取的，對(duì)人類健康不會(huì)產(chǎn)生不良影響，研究發(fā)現(xiàn)它具有廣泛的用途，如在食品中有以下幾方面的用途具有抗氧化作用，可與三價(jià)Fe鰲合防止豆油氧化、水解，抑制含油脂食品的酸敗，所以可用其保存食油；植酸可以吸收微量金屬，用于豆油的精煉，使之純度增加；植酸作為蛋白質(zhì)凝固劑，用于制作豆腐，加入O. 20-0. 10%，使之具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和風(fēng)味，提高成品率、質(zhì)量、保存性.在蛋及蛋制品加熱過程中，可以消除因發(fā)生硫化氫而造成的變黑現(xiàn)象；植酸在腌咸白菜、羅卜時(shí)，加入O. 1%，使之色澤明亮，質(zhì)量改善；植酸用于青豆、玉米豆等水煮罐頭，具有很強(qiáng)保鮮作用，同時(shí)植酸可以防止罐頭食品在加熱殺菌過程中產(chǎn)生的硫化氫與食物本身存在鐵、銅元素及從罐頭表面溶解下來的錫等金屬結(jié)合生成硫化物可導(dǎo)致食品變色；植酸鈣可作為葡萄酒發(fā)酵期，發(fā)泡期的發(fā)酵助長劑，善色、香味；植酸在速溶咖啡中能抗浮渣，抗泡沫，還可以增進(jìn)醬油、豆?jié){及腌制品風(fēng)味，防止變色等。雖然植酸在食品エ業(yè)中具有較多作用，但由于人和動(dòng)物的消化道不能產(chǎn)植酸酶，大量未被利用的植酸磷排入環(huán)境，造成水域的富營養(yǎng)化；同吋，植酸是一種廣譜性的抗?fàn)I養(yǎng)因子，可與鈣、鎂、鋅、鉀等礦物質(zhì)元素結(jié)合成不溶性鹽類，而降低了植物的營養(yǎng)和價(jià)值，它還可以絡(luò)合蛋白質(zhì)，抑制多種消化酶的活性。植酸酶(phytase)也稱肌醇六憐酸酶(myo-inositolhexaphoshatephosphohydrotase),它是催化植酸及其植酸鹽水解產(chǎn)生肌醇和磷酸(或者磷酸鹽)ー類酶的總稱。它分兩類，ー是3-植酸酶(EC 3. I. 3. 8)，ニ是6-植酸酶(EC 3. I. 2. 6)。它是ー種新型、綠色環(huán)保的飼料用酶。植酸酶可釋放植酸中磷份，提高了人和動(dòng)物對(duì)磷的吸收利用率，減少排泄物中有機(jī)磷的含量。目前，對(duì)酸性植酸酶研究較多，酸性植酸酶有效作用范圍在2. 5 5. 5之間，所以它僅適用于單胃動(dòng)物畜禽及少數(shù)魚類如虹鱒等，但不適于消化道為中性的鯉科魚類。對(duì)中性植酸酶目前還缺乏較深入的研究，故我們從土壤篩選出產(chǎn)中性植酸酶的高產(chǎn)菌株，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其產(chǎn)酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
I.本發(fā)明涉及產(chǎn)中性植酸酶菌株的制備和產(chǎn)中性植酸酶的發(fā)酵方法，其特征在產(chǎn)中性植酸酶菌株的制備和產(chǎn)中性植酸酶的發(fā)酵方法，包括以下過程步驟(一)土壤樣品稀釋到10_4或10_5并均勻涂布到篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 4d，挑選帶透明圈的菌株接種于細(xì)菌營養(yǎng)肉汁平板培養(yǎng)基，劃線分離；步驟(ニ)將步驟(一)單菌落點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 4d，選擇直徑比大的單菌落，編號(hào)后接入斜面種子培養(yǎng)基，以備復(fù)篩和鑒定；步驟(三)挑取步驟(ニ)編號(hào)為phy7的初篩菌株接種于細(xì)菌營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，30°C搖振培養(yǎng)3-5d，提取菌株的總DNA作為模板，利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，純化；步驟(四)將步驟(三)純化后的PCR產(chǎn)物送上海生エ生物技術(shù)公司測(cè)序。將測(cè)得的核苷酸序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Blast比對(duì)，獲取與試驗(yàn)菌16S rDNA基因序列相似度高的菌種。采用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)，通過Mega4. O. 2軟件計(jì)算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；
步驟(五)挑取步驟(ニ)編號(hào)為phy7的初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，改變碳源、氮源、磷源、金屬離子的種類，在30-40°C、150r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)20-24h，分別測(cè)定其發(fā)酵液酶活，再以對(duì)產(chǎn)酶影響最大的4個(gè)因子的3個(gè)水平，采用L9 (34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析；步驟(六)挑取步驟(ニ)編號(hào)為phy7的初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，改變發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、培養(yǎng)基初始pH、三角瓶裝液量，在30-40°C、150r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)20-24h分別測(cè)定其發(fā)酵液酶活，再以對(duì)產(chǎn)酶影響最大的3個(gè)因子的3個(gè)水平，采用L9 (33)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。2.根據(jù)本發(fā)明所述，phy7菌株的16S rDNA序列長度為1489bp，GenBank登陸號(hào)為JN408760,屬于綠膿假單胞菌(pseudomonas aeruginosa)屬。該菌株分泌中性植酸酶,其最適反應(yīng)pH為7. O、最適反應(yīng)溫度為40°C，在40°C、以植酸鈉為底物的Km值為0. 26mmol/L, Vmax為0. 0506nmol/min。金屬離子Zn2+、Al3+、Cu2+、Mn2+等對(duì)該酶有抑制作用，而Fe2+等則有一定的激活作用。3.根據(jù)本發(fā)明所述，phy7菌株的優(yōu)化培養(yǎng)基為(g/L):可溶性淀粉40、胰蛋白胨10、NaN02 8 . 6, NH4NO3 5. (KK2HPO4 0. 10, KCl 0. 10、MgCl2O. 10、MnCl2 0·09，ρΗ6·0。在發(fā)酵溫度30°C，150r/min,裝液量IOOmL (250ml三角瓶)，接種量7 %，發(fā)酵24h后酶活最高，為230. 2U/mL,比未優(yōu)化前提高了 2. 13倍。


圖I是菌phy7 16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果的圖；圖2是鄰接法構(gòu)建的菌株phy7 16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；圖3是不同pH對(duì)酶活的影響圖；圖4是pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響圖；圖5是溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；圖6是溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響；圖7是植酸酶的Km和Vmax ;圖8是金屬離子對(duì)植酸酶活性的影響圖；圖9是不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；圖10是不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；圖11是不同磷源對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；圖12是不同金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；圖13是起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；圖14是發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；圖15是接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響圖；圖16是裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的涉及產(chǎn)植酸酶菌株的制備和發(fā)酵條件包括以下實(shí)施例，下面的實(shí)施例可進(jìn)ー步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例I :步驟(一)土壤樣品稀釋到10_4并均勻涂布到篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)3d，挑選帶透明圈的菌株接種于細(xì)菌營養(yǎng)肉汁平板培養(yǎng)基，劃線分離；步驟(ニ)將步驟(一)單菌落點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)3d，選擇直徑比大的單菌落，編號(hào)后接入斜面種子培養(yǎng)基，以備復(fù)篩和鑒定；步驟(三)挑取步驟(ニ)編號(hào)為phy7的初篩菌株接種于細(xì)菌營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，30°C搖振培養(yǎng)3d，提取菌株的總DNA作為模板，利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，純化；步驟(四)將步驟(三)純化后的PCR產(chǎn)物送上海生エ生物技術(shù)公司測(cè)序。將測(cè)得的核苷酸序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Blast比對(duì)，獲取與試驗(yàn)菌16S rDNA基因序列相似度高的菌種。采用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)，通過Mega4. O. 2軟件計(jì)算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹； 步驟(五)挑取步驟(ニ)編號(hào)為phy7的初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，改變碳源、氮源、磷源、金屬離子的種類，在30°C、150r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)20h，分別測(cè)定其發(fā)酵液酶活，再以對(duì)產(chǎn)酶影響最大的4個(gè)因子的3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析；步驟(六)挑取步驟(ニ)編號(hào)為phy7的初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，改變發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、培養(yǎng)基初始pH、三角瓶裝液量，在30°C、150r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)20h，分別測(cè)定其發(fā)酵液酶活，再以對(duì)產(chǎn)酶影響最大的3個(gè)因子的3個(gè)水平，采用L9 (33)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)施例2 步驟(一)土壤樣品稀釋到10_6并均勻涂布到篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)4d，挑選帶透明圈的菌株接種于細(xì)菌營養(yǎng)肉汁平板培養(yǎng)基，劃線分離；步驟(ニ)將步驟(一)單菌落點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)4d，選擇直徑比大的單菌落，編號(hào)后接入斜面種子培養(yǎng)基，以備復(fù)篩和鑒定；步驟(三)挑取步驟(ニ)編號(hào)為phy7的初篩菌株接種于細(xì)菌營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，30°C搖振培養(yǎng)5d，提取菌株的總DNA作為模板，利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，純化；步驟(四)將步驟(三)純化后的PCR產(chǎn)物送上海生エ生物技術(shù)公司測(cè)序。將測(cè)得的核苷酸序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Blast比對(duì)，獲取與試驗(yàn)菌16S rDNA基因序列相似度高的菌種。采用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)，通過Mega4. O. 2軟件計(jì)算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；步驟(五)挑取步驟(ニ)編號(hào)為phy7的初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，改變碳源、氮源、磷源、金屬離子的種類，在40°C、150r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24h，分別測(cè)定其發(fā)酵液酶活，再以對(duì)產(chǎn)酶影響最大的4個(gè)因子的3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析；步驟(六)挑取步驟(ニ)編號(hào)為phy7的初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，改變發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、培養(yǎng)基初始pH、三角瓶裝液量，在40°C、150r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24h分別測(cè)定其發(fā)酵液酶活，再以對(duì)產(chǎn)酶影響最大的3個(gè)因子的3個(gè)水平，采用L9(33)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。附實(shí)驗(yàn)例證I中性植酸酶菌株的篩選及鑒定I材料與方法
I. I材料與試劑I. I. I產(chǎn)植酸酶菌株分離樣品威海郊區(qū)玉米地肥沃土壌、麩皮、發(fā)芽小麥混勻并放置20余天后的混合物。I. I. 2試劑植酸鈉p-0109 (sigma公司)，植酸鈣(湖北三鑫生物工程有限公司)，DNA分子標(biāo)準(zhǔn)及試劑盒、Taq DNA聚合酶和DNase I (TaKaRa公司)，其他試劑均為分析純。1.1.3 培養(yǎng)基細(xì)菌營養(yǎng)肉汁平板(g/L):蛋白胨10、牛肉膏3、NaCl 5、瓊脂15 20，ρΗ7· O植酸鈣篩選平板(g/L):葡萄糖20、CaCl2 2、NH4N03 5,KCl O. 5、MgS04 · 7H20 0.5、FeSO4 · 7H20 0. Olg、MnSO4 · H2O 0. Olg、植酸鈣 I、瓊脂 15、ρΗ7· 0 產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉40、胰蛋白胨 10、NaNO2 8. 6、NH4NO3 5. O、K2HPO4O. 10、KCl O. 10、MgCl2 O. 10、MnCl2 O. 09，ρΗ7· OI. 2 方法I. 2. I產(chǎn)中性植酸酶菌株的初篩將士壤樣品稀釋到10_4或10_5并均勻涂布到篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 4d后將產(chǎn)生透明圈的菌株接種于細(xì)菌營養(yǎng)肉汁平板培養(yǎng)基，劃線分離。然后將單菌落點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 4d后測(cè)量直徑比(直徑比=透明圈直徑/菌落直徑)。選擇直徑比大的單菌落，編號(hào)后接入斜面種子培養(yǎng)基，以備復(fù)篩和鑒定。I. 2. 2菌株的復(fù)篩挑取初篩菌株接種于細(xì)菌營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，30°C搖振培養(yǎng)24h后，按10%接種量接種于IOOml的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，300C、150r/min搖振培養(yǎng)5d，每24h取5mL培養(yǎng)液，3000r/min離心去菌體，上清液利用截留分子量為10000U的透析袋在去離子水中透析3 4h，將得到的去除無機(jī)磷m的酶液用于酶活性測(cè)定。I. 2. 3菌種鑒定提取菌株的總DNA作為模板[8_9]，利用細(xì)菌通用引物上游引物Bac. 27-F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和下游引物為Bac. 1492-R(5’_GGTTACCTTACGACTT-3，)[10]擴(kuò)增菌株 16S rDNA 片段。PCR 的反應(yīng)體系為 25 μ L 12. 5μ L ddH20, 2. 5 μ L10XPCR反應(yīng)緩沖液，2μ L dNTP混合物，I μ L上游引物，I μ L下游引物，5μ L總DNA，I μ L TaqTMDNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55. 4°C退火30s，72°C延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。純化后PCR產(chǎn)物送上海生エ生物技術(shù)公司測(cè)序。將測(cè)得的核苷酸序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Blast比對(duì)，獲取與試驗(yàn)菌16S rDNA基因序列相似度高的菌種。采用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)，通過Mega4. O. 2軟件計(jì)算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，Neighbor -Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。I. 2. 4酶活測(cè)定方法采用硫酸亞鐵-鑰藍(lán)法測(cè)定酶活m。酶活性単位(U)定義為在一定條件下，毎分鐘釋放出Inmol無機(jī)磷所需的酶量為ー個(gè)酶活性単位，用U表示，單1AA為 nmol/min。I. 2. 5植酸酶的部分性質(zhì)I. 2. 5. I最適pH和pH穩(wěn)定性酶作用的最適pH值和pH值穩(wěn)定性將植酸鈉用緩沖液配制成不同pH(3. 0-9.0)值的底物溶液進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定粗酶液的酶活。最高酶活カ時(shí)的pH值即為最適pH值。采用不同pH值(3.0-10.0)的緩沖液在37°C條件下處理酶溶液30min，在常規(guī)條件下測(cè)定酶活力，并計(jì)算相對(duì)酶活力，考察酶在37 °C條件下的pH值穩(wěn)定性。
I. 2. 5. 2酶作用的最適溫度和酶的熱穩(wěn)定性在不同溫度條件下(25_60°C )進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定酶活力。最高酶活力時(shí)的溫度即為酶作用的最適溫度。在不同溫度條件下(30-550C )處理粗酶液60min，再在40°C下進(jìn)行反應(yīng)后測(cè)定剩余酶活，計(jì)算相對(duì)酶活，考察酶在不同溫度下處理60min后的穩(wěn)定性。I. 2. 5. 3在植酸鈉溶液中添加不同的無機(jī)金屬離子(Mn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Al3+)使其終濃度達(dá)到2mmol/L，以不加離子時(shí)所測(cè)得酶活作為對(duì)照，在40°C下反應(yīng)30min后測(cè)酶活，然后計(jì)算出相對(duì)酶活，研究金屬離子對(duì)酶活力的影響。2結(jié)果與分析2. I菌株篩選初篩土樣經(jīng)過篩選培養(yǎng)基涂布、富集培養(yǎng)、多次劃線分離和點(diǎn)種篩選，共初篩出21株植酸酶產(chǎn)生菌，其中透明圈與菌落直徑比值較大的有10株(以phy代表植酸酶菌株)。 然后對(duì)初篩菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，測(cè)其酶活。結(jié)果如表I。表I各菌株直徑比和酶活對(duì)照(酶活單位IU/ml)
菌株phy. I phy. 2Phy3Phy4Phy5
直徑比-1.92.52.02.12.3
酶活86.1 _97.4 _84.8 _ 91.4 _87.4 _
菌株 Phy 6 Phy 7 Phy8 Phy 9 PhylO直徑比 2.5 2.5 2.4 2.0 2.2_酶活ー 68.58 _100.9_91. 2 _72.3 _108.9由表I可以看出，所篩選出的10個(gè)菌株的透明圈與菌落直徑比均在I. 9 2. 5之間。得到酶活大于100IU/mL的菌株有2株，即菌株phy7和phy 10。2. 2菌株鑒定根據(jù)透明圈大小和酶活大小綜合考慮，我們選擇phy7為研究菌，并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。2. 2. IPCR 擴(kuò)增結(jié)果對(duì)phy7染色體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，在1500bp左右處有一明亮的特征條帶(細(xì)菌16S rDNA平均大小為1540bp)，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了該擴(kuò)增產(chǎn)物的存在和大小(圖I)，從圖I可以得出phy7的16S rDNA序列長度為1489bp。2. 2. 2測(cè)序結(jié)果及同源性分析測(cè)序結(jié)果表明，phy7的16S rDNA序列長度為1489bp，將其序列送交GenBank，其登陸號(hào)為JN408760。將該株細(xì)菌測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast，下載與phy7的16S rDNA相似性高的菌株的序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果見圖2。根據(jù)16S rDNA的序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建結(jié)果可以得出該菌屬于假單胞菌屬(pseudomonas),并且從系統(tǒng)發(fā)育樹看出phy7與綠膿假單胞菌位于同一分支上,相似度近100 %，所以該菌可能是綠膿假單胞菌的ー個(gè)相似種。2. 3植酸酶的部分性質(zhì)研究2. 3. I植酸酶的最適pH和pH穩(wěn)定性底物植酸鈉用不同pH的含lmmol/L CaCl2的0. 25mmol/L的緩沖液配制。ρΗ3· O、4. O、5. O、6. O、7. O為磷酸氫ニ鈉-檸檬酸緩沖液；ρΗ7. 5、8. 0、8. 5、9. O為Tris-HCl緩沖液；pH 9. 5、10. O、10. 5為碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。每組三個(gè)平行，于37°C下反應(yīng)30min后測(cè)定酶活性，結(jié)果見圖3。并在上述各種不同pH的緩沖液中，于37°C條件下處理30min后測(cè)定相對(duì)酶活性，以研究酶的PH穩(wěn)定性，結(jié)果見圖4。由圖3可以看出，該酶作用的最適pH為7. 0，高于或低于7. O酶活都會(huì)降低，所以菌株phy7所產(chǎn)植酸酶為中性植酸酶。由圖4可以看出，該酶在pH5 8. O的范圍內(nèi)，剩余酶活性保持在80%以上，而pH低于5. O和高于8. 5時(shí)酶活性迅速下降，到pH3. O和9. 5時(shí)，酶活性已經(jīng)剩余不到15%,pH10時(shí)已基本無酶活。說明該酶pH耐受范圍為也近中性pH附近。2. 3. 2最適溫度及熱穩(wěn)定性在不同溫度(25°C 60°C )下進(jìn)行酶促反應(yīng)，每組三個(gè)平行，反應(yīng)30min后測(cè)其酶活性，結(jié)果見圖5。將中性植酸酶在不同溫度(30°C 55°C )下處理60min，再在37°C下進(jìn)行反應(yīng)后測(cè)定剩余酶活，計(jì)算相對(duì)酶活(三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值)，結(jié)果見圖6。由圖5可以看出，該酶作用的最適溫度為40°C，高于或低于此溫度酶活都會(huì)降低。由圖6可以看出40°C以下處理60min后，酶活基本不變，相對(duì)酶活仍近100% ;45°C處理60min仍保持約93%的相對(duì)酶活；而高于45°C時(shí)酶的剩余活性開始迅速下降；到55°C時(shí)剩余酶活性已經(jīng)很低了(約20%)。所以該酶不耐45°C以上的高溫。2. 3. 3 植酸酶的 Km 與 Vmax用不同濃度(O. 1-0. 5mmol/L)的植酸鈉為底物，在Tris-HCl (pH7. 5)緩沖液體系中，40°C下測(cè)定酶活性，利用雙倒數(shù)作圖法得圖7.由圖7可以得出該酶在本實(shí)驗(yàn)條件下，以植酸鈉為底物的Km為O. 26mmol/L,Vmax為 O. 0506nmol/min。2. 3. 4金屬離子對(duì)中性植酸酶活性的影響在酶促反應(yīng)體系中加入不同的無機(jī)金屬離子(Mn2+、Mg2+、Fe2+、CU2+、Zn2+、Al3+)使其終濃度達(dá)到2mmol/L，以不加離子時(shí)所測(cè)得酶活作為對(duì)照，在40°C下反應(yīng)30min后測(cè)酶活，然后計(jì)算出相對(duì)酶活，得到不同離子對(duì)酶活性的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可以看出，F(xiàn)e2+對(duì)該酶有促進(jìn)作用，它可能是該中性植酸酶的激活劑；Mg2+、Mn2+對(duì)酶活有抑制作用，但作用強(qiáng)度較弱；而Zn2+、Al3+、Cu2+對(duì)酶有很大的抑制作用，能夠使12-20%的酶活喪失，可能是由于這些離子能和植酸發(fā)生很強(qiáng)的絡(luò)合作用所制。3 結(jié)論從天然土壤中篩選出20余株產(chǎn)中性植酸酶活性的菌株，對(duì)其中一株(phy7)經(jīng)16S rDNA分子學(xué)鑒定,該菌屬于假單胞菌屬(pseudomonas),初步確定為該屬的綠膿假單胞菌(pseudomonas aeruginosa)的相似種；該菌所產(chǎn)植酸酶為中性,其反應(yīng)最適pH為7. O,最適溫度為40°C ;在40°C下以植酸鈉(p-0109)為底物的Km值為0. 26mmol/L、Vmax為0. 0506nmol/min ;金屬離子Zn2+、Al3+、Cu2+、Mg2+、Mn2+等對(duì)該酶有抑制作用，而Fe2+等則有一定的激活作用。實(shí)驗(yàn)例證2—株綠膿假單胞菌產(chǎn)中性植酸酶發(fā)酵條件研究I材料與方法I. I材料與試劑
I. I. I菌株從土壤分離出產(chǎn)中性植酸酶高產(chǎn)菌株，選用經(jīng)16S rDNA鑒定為假單胞桿菌屬的ー株(Phy7)為實(shí)驗(yàn)菌。I. I. 2主要試劑植酸鈉p-0109 (購自sigma公司)，植酸鈣(湖北三鑫生物工程有限公司)，其他試劑均為分析純。I. I. 3 培養(yǎng)基(g/L):麩皮 100，(NH4)2SO4 O. 4，MgSO4 · 7H20 O. 2，KH2PO4 O. 05，K2HPO4 O. 1，CaCl22，胰蛋白胨 10，ρΗ7· O.I. 2 方法
I. 2. I培養(yǎng)基成分對(duì)產(chǎn)酶的影響用不同的碳源、氮源、磷源、金屬離子作單因子實(shí)驗(yàn)，再以對(duì)產(chǎn)酶影響最大的4個(gè)因子的3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。I. 2. 2培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響用不同的發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、培養(yǎng)基初始pH、三角瓶裝液量做單因子實(shí)驗(yàn)，再以對(duì)產(chǎn)酶影響最大的3個(gè)因子的3個(gè)水平，采用L9(33)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。I. 2. 3酶活測(cè)定方法采用硫酸亞鐵-鑰藍(lán)法測(cè)定酶活M，略加修改。酶活性単位(U)定義為在一定條件下，毎分鐘釋放出Inmol無機(jī)磷所需的酶量為ー個(gè)酶活性単位，用U表不，單位為nmol/min。2結(jié)果與分析2. I培養(yǎng)基組成對(duì)產(chǎn)酶的影響2. I. I不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的麥芽糖、殼聚糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麩皮分別代替產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源，在30°C、150r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24h，測(cè)定其發(fā)酵液酶活，結(jié)果見圖9。圖9表明可溶性淀粉作為碳源，酶活最高，可達(dá)183U/mL，其它幾種影響差異不大。2. I. 2不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響以酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸出粉、尿素、(NH4)2SO4 · 7H20、NH4NO3,NaNO2分別代替產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的氮源。以O(shè). 5 %的NH4NO3中的含氮量為標(biāo)準(zhǔn)來添加其他氮源。在30°C、150r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24h，測(cè)定其發(fā)酵液酶活，結(jié)果見圖10。由圖10可以看出，用NaNO2作為氮源，酶活最高，活力單位可達(dá)218. 6u/mL酶液。胰蛋白胨和NH4NO3效果也較好，其他氮源酶活略低。較好的幾個(gè)氮源順序?yàn)?NaNO2 >胰蛋白胨> NH4NO3 >牛肉膏。2. I. 3不同磷源對(duì)產(chǎn)酶的影響以Na3P04、KH2PO4、K2HPO4、ΚΗ2Ρ04+Κ2ΗΡ04及空白作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的磷源。以O(shè). 01 %的K2HPO4中的含磷量為標(biāo)準(zhǔn)來添加其他磷源。在30°C、150r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24h，測(cè)定其發(fā)酵液酶活，結(jié)果見圖11。由圖11看出只有K2HPO4對(duì)產(chǎn)中性植酸酶有促進(jìn)作用，其他組合都對(duì)酶活有抑制作用，因此選用K2HPO4作為添加的磷源。2. I. 4不同金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響分別添加O. 5mmol/L 的 Mn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、K+、Zn2+、Ba2+ 到產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在同一條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定其發(fā)酵液酶活。結(jié)果如圖12。由圖11看出K+、Mg2+、Mn2+、Ca2+對(duì)酶有激活作用，使酶的活性分別提高35. 8%、16.4%、13. 4%和 11.9% ;Cu2+、Fe2+、Zn2+、Ba2+對(duì)酶活性具有抑制作用。
2. I. 5四因素正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)酶活影響較大的可溶性淀粉(A)、胰蛋白胨(B)、K2HPO4(C)和K+(D)四因素的3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果見表I。表I可溶性淀粉、胰蛋白胨、KH2PO4, K+三因素正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及產(chǎn)中性植酸酶菌株的制備和產(chǎn)中性植酸酶的發(fā)酵方法，其特征在產(chǎn)中性植酸酶菌株的制備和產(chǎn)中性植酸酶的發(fā)酵方法，包括以下過程 步驟(一)土壤樣品稀釋到10_4或10_5并均勻涂布到篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 4d，挑選帶透明圈的菌株接種于細(xì)菌營養(yǎng)肉汁平板培養(yǎng)基，劃線分離； 步驟(二)將步驟(一)單菌落點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 4d，選擇直徑比大的單菌落，編號(hào)后接入斜面種子培養(yǎng)基，以備復(fù)篩和鑒定； 步驟(三)挑取步驟(二)編號(hào)為phy7的初篩菌株接種于細(xì)菌營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，30°C搖振培養(yǎng)3-5d，提取菌株的總DNA作為模板，利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，純化； 步驟(四)將步驟(三)純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司測(cè)序。將測(cè)得的核苷酸序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Blast比對(duì)，獲取與試驗(yàn)菌16S rDNA基因序列相似度高的菌種。采用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)，通過Mega4. 0. 2軟件計(jì)算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹； 步驟(五)挑取步驟(二)編號(hào)為Phy7的初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，改變碳源、氮源、磷源、金屬離子的種類，在30-40°C、150r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)20_24h，分別測(cè)定其發(fā)酵液酶活，再以對(duì)產(chǎn)酶影響最大的4個(gè)因子的3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析；步驟(六)挑取步驟(二)編號(hào)為Phy7的初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，改變發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、培養(yǎng)基初始pH、三角瓶裝液量，在30-40°C、150r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)20-24h分別測(cè)定其發(fā)酵液酶活，再以對(duì)產(chǎn)酶影響最大的3個(gè)因子的3個(gè)水平，采用L9 (33)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。
2.根據(jù)本發(fā)明所述，phy7菌株的16SrDNA序列長度為1489bp，GenBank登陸號(hào)為JN408760,屬于綠膿假單胞菌(pseudomonas aeruginosa)屬。該菌株分泌中性植酸酶,其最適反應(yīng)pH為7. O、最適反應(yīng)溫度為40°C，在40°C、以植酸鈉為底物的Km值為0. 26mmol/L, Vmax為0. 0506nmol/min。金屬離子Zn2+、Al3+、Cu2+、Mn2+等對(duì)該酶有抑制作用，而Fe2+等則有一定的激活作用。
3.根據(jù)本發(fā)明所述，phy7菌株的優(yōu)化培養(yǎng)基為(g/L):可溶性淀粉40、胰蛋白胨10、NaNO2 8. 6、NH4NO3 5. O、K2HPO4 0. 10、KCl 0. 10、MgCl2O. 10、MnCl2O. 09，pH6. O。在發(fā)酵溫度30°C，150r/min，裝液量IOOmL(250ml三角瓶)，接種量7 %，發(fā)酵24h后酶活最高，為.230. 2U/mL,比未優(yōu)化前提高了 2. 13倍。
全文摘要
本發(fā)明所屬微生物發(fā)酵研究開發(fā)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及產(chǎn)植酸酶菌株的制備和發(fā)酵條件土壤樣品稀釋到10-4或10-5并均勻涂布到篩選培養(yǎng)基，經(jīng)復(fù)篩得到菌株phy7；phy7經(jīng)16S rDNA鑒定，得到該菌株的16S rDNA序列長度為1489bp，GenBank登陸號(hào)為JN408760，屬于綠膿假單胞菌屬；該菌株分泌中性植酸酶，其最適反應(yīng)pH為7.0、最適反應(yīng)溫度為40℃，以植酸鈉為底物的Km值為0.26mmol/L，Vmax為0.0506nmol/min；菌株的優(yōu)化培養(yǎng)基為(g/L)可溶性淀粉40、胰蛋白胨10、NaNO28.6、NH4NO35.0、K2HPO40.10、KCl0.10、MgCl20.10、MnCl20.09，pH6.0。在發(fā)酵溫度30℃，150r/min，裝液量100mL(250ml三角瓶)，接種量7％，發(fā)酵24h后酶活最高，為230.2U/mL，比未優(yōu)化前提高了2.13倍。本發(fā)明制備方法簡單，操作方便，得到的菌株反應(yīng)條件溫和，酶活高，用途廣泛。
文檔編號(hào)C12N9/16GK102676428SQ20121014393
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月29日
發(fā)明者朱啟忠 申請(qǐng)人:山東大學(xué)威海分校