專(zhuān)利名稱：一種耐高糖高酸的乳酸桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種新型的乳酸桿菌，及其在發(fā)酵エ藝中的應(yīng)用，屬于微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳酸是自然界中最小的手性分子，其結(jié)構(gòu)中含有I個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此具有旋光性，按構(gòu)型可分為D-乳酸和L-乳酸。L-乳酸為哺乳動(dòng)物代謝的中間產(chǎn)物，由于人體只能代謝L-乳酸，因此在用于食品及醫(yī)藥エ業(yè)時(shí)必然要用L-乳酸代替D，L-乳酸。而L-乳酸最具應(yīng)用潛カ的是生產(chǎn)聚乳酸(PLA)，制造生物可降解塑料。近年來(lái)，人們對(duì)D-乳酸、L-乳酸及其衍生物的理化性能和生理活性有了深入的了解，在手性藥物、手性溶剤、生物農(nóng)藥及功能性材料等領(lǐng)域拓寬了乳酸對(duì)映體的應(yīng)用范圍，市場(chǎng)對(duì)高光學(xué)純度的乳酸需求也不斷増加。微生物發(fā)酵法是目前乳酸生產(chǎn)的主要方法。雖然發(fā)酵法乳酸生產(chǎn)技術(shù)在日益進(jìn)歩，但是仍存在乳酸發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化率低，發(fā)酵周期長(zhǎng)，生成乳酸濃度低，光學(xué)純度不夠等，這與乳酸發(fā)酵菌在高糖高酸條件下發(fā)酵效能低有夫。“高產(chǎn)L-乳酸干酪乳桿菌的選育及發(fā)酵條件研究”(秦浩、張偉國(guó)、葛向陽(yáng)、康傳利《食品エ業(yè)科技》2011年07 Si)記載以ー株產(chǎn)L-乳酸的干酪乳桿菌G-02為出發(fā)菌，采用硫酸ニこ酯(DES)和亞硝基胍(NTG)進(jìn)行誘變，選育出一株L-乳酸發(fā)酵活力較強(qiáng)的菌株G-04。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件下，該菌株可積累L-乳酸濃度達(dá)到188g/L，糖轉(zhuǎn)化率大于90%，發(fā)酵周期小于44h。但是該菌種糖轉(zhuǎn)化率仍然偏低，影響產(chǎn)品的質(zhì)量，發(fā)酵周期偏長(zhǎng)，設(shè)備的利用率不高。CN02145142 發(fā)明公開(kāi)了一 種嗜熱乳酸桿菌(Lactobacillusthermophilus)(SNGBL100),保藏號(hào)為CGMCC No. 0784和采用該菌種發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，此發(fā)明的菌種(SNGBL100)，L-乳酸的轉(zhuǎn)化率在93_95%，L-乳酸的純度在97_99%。該發(fā)明中L-乳酸的轉(zhuǎn)化率偏低，光學(xué)純度偏低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種耐高糖高酸的乳酸桿菌，能有效地提高乳酸的光學(xué)純度及糖轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)酸率，并縮短發(fā)酵周期。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下措施實(shí)現(xiàn)的
ー種乳酸桿菌，其分類(lèi)命名為L(zhǎng)actobacillus sp.，保藏登記號(hào)為CCTCC NO: M2012090。形態(tài)特點(diǎn)細(xì)胞桿狀，(2. 0-9. O) umX (O. 5-0. 8)um,單個(gè)或者短鏈，瓊脂平板上菌
落小，扁平。生理理化特點(diǎn)革蘭氏陽(yáng)性，不運(yùn)動(dòng)，能利用葡萄糖等單糖生成L-乳酸，生長(zhǎng)溫度為 52-55 0C ο上述乳酸桿菌采用如下方法制備將德氏乳酸桿菌作為出發(fā)菌進(jìn)行誘變育種，高糖高酸條件下篩選馴化，得到所述乳酸桿菌。上述誘變育種是指采用6tlCtl r射線誘變德氏乳酸桿菌。上述的高糖高酸是指酸的濃度為17g/l -21g/l，糖的濃度為150g/l_220g/l。上述乳酸桿菌能利用單糖生產(chǎn)L-乳酸。上述乳酸桿菌，其特征在于所述單糖為葡萄糖。上述乳酸桿菌可應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。
本發(fā)明的乳酸桿菌Lactobacillus sp.的保藏日期是 2012年3月23日，保藏編號(hào)是CCTCC NO M 2012090，保藏單位是中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。有益效果
本發(fā)明提供的乳酸桿菌在特定的高酸，高糖的環(huán)境下經(jīng)過(guò)反復(fù)馴化篩選，對(duì)高酸高糖環(huán)境具備了良好的耐受性，體內(nèi)積累了能夠抵御高酸高糖環(huán)境的特殊物質(zhì)，用以調(diào)節(jié)體內(nèi)的滲透壓以維持菌體的完整，并對(duì)菌體自身的生理調(diào)節(jié)機(jī)制產(chǎn)生特定的影響，避免乳酸根離子對(duì)菌種本身生長(zhǎng)的抑制，從而提高糖轉(zhuǎn)化率和乳酸生成率，并改善L-乳酸的光學(xué)純度，其中糖轉(zhuǎn)化率不低于95 %，L-乳酸的光學(xué)純度不低于99. 3 %，且縮短發(fā)酵周期，節(jié)約時(shí)間和成本。本發(fā)明的乳酸桿菌在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)仍能保持良好的生理生化功能和高發(fā)酵效，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例I本發(fā)明提供的乳酸桿菌的制備方法。一.材料與方法
1.菌種德氏乳酸桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)(實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，自命名F-AlO)
2.培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件
分離檢測(cè)培養(yǎng)基一GYP培養(yǎng)基葡萄糖I. 0g，酵母膏I. Og,蛋白胨O. 5 g,肉汁浸膏
O.2g, NaAc ·3Η20 O. 2g，MgS047H20 20mg，MnS044H20 lmg, FeS047H20 lmg，NaCl lmg，吐溫80分析純0. 5ml,瓊脂I. 2g，CaCO30 0. 5g,水100ml ;培養(yǎng)條件溫度121 °C，培養(yǎng)時(shí)間20min。種子培養(yǎng)基配方(單位g/l):葡萄糖50，酵母膏10，蛋白胨10，肉汁浸膏O. 2，NaAc · 3H20 O. 5，MgS047H20 O. 2，MnS044H20 O. 01，F(xiàn)eS047H20 0. 01 NaCl 0. 01 ;培養(yǎng)條件PH=4. 0-5. 0，溫度 121 °C，培養(yǎng)時(shí)間 20min。發(fā)酵培養(yǎng)基配方(單位g/l):葡萄糖200，硫酸銨I. 44，磷酸氫二鉀O. 08，磷酸二氫鉀O. 08，酵母膏O. 2 ;培養(yǎng)條件PH=4. 0-5. 0，溫度121°C，培養(yǎng)時(shí)間20min。耐高酸酸性培養(yǎng)基配方(單位g/l):在GYP培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加如下濃度的L-乳酸(g/1) 17,18,19,20,21,22o3. 葡萄糖濃度和L一乳酸的測(cè)定采用山東科學(xué)院生物研究所研制的BA — 40Ε生物傳感儀測(cè)量。體積是有電子液位計(jì)顯示。轉(zhuǎn)化率的計(jì)算體積X產(chǎn)酸+葡萄糖量X 100%。L-乳酸的光學(xué)純度采用ΧΤΥ-ΑΗ3000高效液相色譜檢測(cè)儀檢測(cè)。二.制備方法
I.將德氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbrueckii)(實(shí)驗(yàn)室保藏菌種,自命名F-A10)，制成菌種懸浮液(菌種含量為IX IO6個(gè)/ ml)4. 5ml,加入硫酸二乙酯O. 5% (體積t匕)于45°C下震蕩處理5min，再加入75 %硫代硫酸鈉10 ml反應(yīng)lOmin，稀釋10倍后涂布于含有CaCO3的GYP平板，于54 °C恒溫培養(yǎng)20h ；
GYP平板培養(yǎng)基葡萄糖I.0g，酵母膏I.0g，蛋白胨0.5 g，肉汁浸膏0.2g，NaAc · 3H20 O. 2g, MgS047H20 20 mg，MnS044H20 I mg, FeS047H20 lmg, NaCl I mg,，吐溫80 分析純 0. 5ml,瓊脂 I. 2 g, CaCO30 0. 5g,水 100ml ；
2.挑選單個(gè)，菌落小而透明圈大的菌落接種于麥芽汁CaCO3試管斜面上54°C培養(yǎng)；
3.將培養(yǎng)好的試管菌種制成懸浮液(含量為10個(gè)/ml) 20ml,置于25ml比色管中于6tlCtl r射線下照射，劑量為800-1200Gy，照射后的懸浮液稀釋成10_4，取O. Iml涂平板，于54°C溫度下培養(yǎng)12-16h，該平板為不同乳酸濃度的CaCO3的GYP培養(yǎng)基平板；
4.4-1.耐高酸菌種的選育
將經(jīng)過(guò)誘變后的菌株F-AlO用種子培養(yǎng)基活化18h后，于無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行梯度稀釋并涂布于不同乳酸濃度的GYP培養(yǎng)基上，54°C培養(yǎng)20h。結(jié)果如表I。由表I可知，出發(fā)菌株經(jīng)過(guò)誘變后，在不同乳酸濃度的酸性培養(yǎng)基中表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)情況，隨著乳酸濃度的遞增，培養(yǎng)基上的菌落逐漸減少，21%的乳酸濃度是誘變后菌株的臨界乳酸耐受濃度，在21%的酸性平板上挑選優(yōu)勢(shì)菌落作為目的菌落。表I
權(quán)利要求
1.一種乳酸桿菌，其分類(lèi)命名為L(zhǎng)actobacillus sp.，保藏登記號(hào)為CCTCC NO: M2012090。
2.如權(quán)利要求I所述乳酸桿菌，其特征在于采用如下方法制備將德氏乳酸桿菌作為出發(fā)菌進(jìn)行誘變育種，高糖高酸條件下篩選馴化，得到所述乳酸桿菌。
3.如權(quán)利要求2所述乳酸桿菌，所述誘變育種是指采用6tlCtlr射線誘變德氏乳酸桿菌。
4.如權(quán)利要求2所述乳酸桿菌，所述篩選馴化的高糖高酸條件下是指酸的濃度為17g/I_21g/l，糖的濃度為 150g/l-220g/l。
5.如權(quán)利要求I所述乳酸桿菌，其特征在于能利用單糖生產(chǎn)L-乳酸。
6.如權(quán)利要求5所述乳酸桿菌，其特征在于所述單糖為葡萄糖。
7.如權(quán)利要求I所述乳酸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種耐高糖高酸的乳酸桿菌，其在高糖高酸環(huán)境下仍能保持高發(fā)酵效能，進(jìn)而提高糖轉(zhuǎn)化率和乳酸生成率，并改善L-乳酸的光學(xué)純度，且縮短發(fā)酵周期，節(jié)約時(shí)間和成本。當(dāng)應(yīng)用于工業(yè)化進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，本發(fā)明的乳酸桿菌仍能保持良好的生理生化功能和高發(fā)酵效，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102676429SQ201210144510
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者劉海濤, 劉鋒, 張亞巍, 李進(jìn), 程小龍 申請(qǐng)人:劉海濤, 劉鋒, 張亞巍, 李進(jìn), 程小龍