專利名稱：一種酶活性及熱穩(wěn)定性提高的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，特別是ー種酶活性及熱穩(wěn)定性提高的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。
背景技術(shù)：
微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(蛋白質(zhì)-谷氨酸-谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，Microbial Transglutaminase, EC2. 3. 2. 13簡(jiǎn)稱MTG)其生物學(xué)功能是直接改變蛋白質(zhì)本身以及蛋白質(zhì)所附著的細(xì)胞、組織等的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的特性，提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，MTG在食品、紡織、生物制藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。但由于MTG自身的一些缺陷如比酶活、熱穩(wěn)定性等因素，限制了 MTG的應(yīng)用范圍。因此基于已得到的MTG在大腸桿菌中的表達(dá)平臺(tái)，利用氨基酸缺失和飽和突變，對(duì)MTG進(jìn)行分子改造，以期得到酶學(xué)性質(zhì)更適合エ業(yè)應(yīng)用的 MTG。

發(fā)明內(nèi)容
為改善MTG比酶活低，熱穩(wěn)定性差的現(xiàn)狀，本研究通過(guò)對(duì)MTG的N端氨基酸進(jìn)行缺失，從而降低底物與MTG活性中心的結(jié)合阻力，提高M(jìn)TG對(duì)底物的親和能力。對(duì)得到比酶活提高的突變株繼續(xù)利用飽和突變，改變MTG內(nèi)部氨基酸之間的極性作用，繼而提高M(jìn)TG比酶活和熱穩(wěn)定性。本研究提供一種新的改造思路，結(jié)合理性設(shè)計(jì)和飽和突變，提高改造效率，并得到了比酶活和熱穩(wěn)定都提高的突變株。在前期研究中，本研究室篩選出一株新的產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的菌株(Streptomyces hygroscopicus CCTCC NO. M203062),通過(guò)基因克隆方法，得到了 MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的啟動(dòng)子和終止子(Genebank EU477523 )，并實(shí)現(xiàn)了 MTG和其酶原區(qū)在大腸桿菌中的高效表達(dá)(Liu S，Zhang D, Wang M, Cui ff, ChenK, Liu Y, Du G, Chen J, Zhou Z (2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicustransglutaminase affects its secretion by Escherichia coll. FEMb Microbiol Lett324(2) :98-105)?；诖竽c桿菌構(gòu)建平臺(tái)，我們對(duì)MTG成熟酶N端氨基酸進(jìn)行缺失和飽和突變，得到了酶學(xué)性質(zhì)較好的突變株。本發(fā)明所用到的培養(yǎng)基LB 培養(yǎng)基胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl 10g/L, pH 7. O ；TB 培養(yǎng)基蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，甘油 8g/L，17mmol/L KH2PO4, 7 2mmo I/LK2HPO4。本發(fā)明中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活力的測(cè)定比色法測(cè)定酶活以N- a -CBZ-GLN-GLY為作用底物，L-谷氨酸-Y單羥胺酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。I個(gè)單位谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶活定義為37C時(shí)每分鐘催化形成I μ mol L-谷氨酸-Y單羥胺酸的酶量(U/mL)。試劑A :IOOmg 的 N a -CBZ-GLN-GLY 溶解于 2mL 0. 2moL/L 的 NaOH 溶液中，加入O. 2mol/L pH6. O 的 Tris-HC 緩沖液 4mL，0. lmol/L 羥胺 2mL，0. Olmol/L 的還原型谷胱甘肽2mL,并調(diào)節(jié)pH至6. O。試劑 B 3mol/L 的 HCL, 12%TCA, 5%FeCL3 按 I : I : I 混合。配制0-4 μ mol/mL的L-谷氨酸-Y -單異羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取ImL試劑A與O. 4mL不同濃度的L-谷氨酸-Y -單異羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，37°C水浴10分鐘。加O. 4mL試劑B終止反應(yīng)，在525nm比色，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。以O(shè). 4mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同條件下保溫和比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出酶活。以100C加熱10分鐘的離心后的上清液為空白。酶活力(u/mL) = (6. 8548XOD525-O. 0164) X 稀釋倍數(shù)本發(fā)明以MTG在大腸桿菌中的高效表達(dá)為改造平臺(tái)，對(duì)MTG成熟酶N端氨基酸進(jìn)行缺失和飽和突變，得到了酶學(xué)性質(zhì)較好的突變株，比酶活提高I. 85倍，熱穩(wěn)定性提高2. 7倍。改造后的酶更適合エ業(yè)應(yīng)用，可降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。


圖IS. hygroscopicus來(lái)源MTG晶體結(jié)構(gòu)模擬圖2TGase N端缺失發(fā)酵上清(A)和純化蛋白SDS-PAGE(B)圖3飽和突變株發(fā)酵上清酶活和熱穩(wěn)定性檢測(cè)表IMTG發(fā)酵上清酶活和TGase酶學(xué)性質(zhì)表2MTG突變株酶學(xué)性質(zhì)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :吸水鏈霉菌來(lái)源MTG晶體結(jié)構(gòu)模擬以已報(bào)道的S. mobaraensis的TGase晶體結(jié)構(gòu)為模板，在swiss-model網(wǎng)站(http: // swissmodel. expasy. org/)模擬 S. hygroscopicus TGase 的晶體結(jié)構(gòu)，如圖 I 所
/Jn ο實(shí)施例2 :高活性突變株的獲得(Dell-4)I、利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖?TaKaRa)，分別缺失N端的7個(gè)氨基酸(Asp UAla 2、Ala
3、Asp 4、Glu 5、Arg 6、Val 7)，缺失ー個(gè)氨基酸命名為Del I，以此類推，缺失前七個(gè)氨基酸命名為Dell-7，轉(zhuǎn)化子由上海生エ進(jìn)行測(cè)序。2、將測(cè)序正確的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli BL 21，挑選轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C，培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中，接種量為3%。菌體長(zhǎng)到OD6tltl為2時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，并將培養(yǎng)溫度降到20°C，培養(yǎng)48h。3、收集發(fā)酵上清，檢測(cè)發(fā)酵上清酶活，并對(duì)樣品進(jìn)行His-鎳柱純化，純化蛋白電泳如圖2所示。 4、對(duì)純化的蛋白的比酶活和Km值進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表I所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Del1，比酶活有提高，但Del 1-2酶活明顯降低，當(dāng)缺失到Del l_3、Del 1_4的酶活得到明顯提高，而缺失到Del 1-5,Del 1_6酶活降低，到Del 1_7則檢測(cè)不到酶活。對(duì)缺失后的序列在swiss-model中模擬晶體結(jié)構(gòu)，如圖3所示，由于是N端氨基酸的缺失，TGase結(jié)構(gòu)基本沒(méi)變，但是對(duì)于N端loop結(jié)構(gòu)的位置影響比較大，Del UDel 1-3, Del 1-4, Del 1_5的N端都有活性中心上游轉(zhuǎn)移到了ー側(cè)，而Del 1-2的loop則仍在活性中心上游，且更靠近活性中心，同時(shí)檢測(cè)Km值，Del 1-2的Km值偏大，說(shuō)明缺失N端1_2影響了 TGase與底物的結(jié)
合能力，而Del 1-3、Del 1-4的Km值和對(duì)照相比偏小，說(shuō)明N端由活性中心上游轉(zhuǎn)移到一
偵牝有助于底物的結(jié)合。表I MTG發(fā)酵上清酶活和TGase酶學(xué)性質(zhì)
權(quán)利要求
1.一種酶活性及熱穩(wěn)定性提高的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.權(quán)利要求I所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于還可以為第一位的氨基酸由E突變?yōu)镈。
3.制備權(quán)利要求I所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的方法，其特征在于以含有S.hygroscopicusTGase的載體為材料，利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖蝎@得SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列，突變后的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，發(fā)酵純化后獲得權(quán)利要求I所述的酶活性及熱穩(wěn)定性提高的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種酶活性提高的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明以MTG在大腸桿菌中的高效表達(dá)為改造平臺(tái)，對(duì)MTG成熟酶N端氨基酸進(jìn)行缺失和飽和突變，得到了酶學(xué)性質(zhì)較好的突變株，比酶活提高1.85倍，熱穩(wěn)定性提高2.7倍。改造后的酶更適合工業(yè)應(yīng)用，可降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C12R1/55GK102660515SQ201210145179
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者劉松, 堵國(guó)成, 張東旭, 陳堅(jiān), 陳康康, 馬建龍 申請(qǐng)人:江南大學(xué)