專(zhuān)利名稱(chēng)：小麥生長(zhǎng)素合成基因TaYUCCA1序列及其應(yīng)用和植物表達(dá)載體的制作方法
TaYUCCAl§H*
(Triticum aestivum L.) ^ TMi^jR'n'J$36l3 TaYUCCAl tfttMMXftXXWm&TK
(Wang and Li, 2008) /J^>7jaS^#tf WWft YUCCA(flavinmonooxygenase-like enzyme, FM0)EKj^ixll' IAA(indole-3-acetic acid)EKlKI^BI (Zhao et al. ,2001) Zhao ^ (2001) yuccam^#4* YUCCA 1-Mif (GC-MS)IAA#￡ YUCCA, YUCCA2.YUCCA4 fR YUCCA6 % YUCCA1J±Jt^tii YUCCA2>YUCCA4 JiJc YUCCA6 yuccal (35S: :YUCCA1) W#-$ife yuclyuc4> yuc2yuc6m&mw yucca(Cheng et al. ,2006)o
YUCCAYUCCAic 11 'NcM (Zhao et al. ,2001 ;Cheng et al. , 2006) ￡7fOsYUCCA^S (0sYUCCAl-7) , ^ OsYUCCAlIAA(Yamamoto et al. , 2007) Gallavotti et al. (2008)YUCCA4>- xmmmyucca
A p
TaYUCCAl mu

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種小麥生長(zhǎng)素合成基因TaYUCCAl，同時(shí)提供一種該基因 在獲得株型改變的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的應(yīng)用，并應(yīng)用于生產(chǎn)其它具有明顯株型改變的轉(zhuǎn)基因 植物。本發(fā)明提供的核苷酸序列及氨基酸序列來(lái)自小麥。本發(fā)明根據(jù)擬南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麥的EST序列設(shè)計(jì)引物， 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、基因克隆等技術(shù)，從小麥 (Triticum aestivum L.)中分離出編碼合成生長(zhǎng)素的TaYUCCAl基因序列，其基因核苷酸序 列如SEQ. ID. NO. 1所示；其cDNA的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。具體方法如下本發(fā)明根據(jù)擬南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麥的EST序列，設(shè)計(jì)一 對(duì)引物；從小麥幼苗中提取小麥基因組DNA ;從小麥幼苗中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA ； 分別用小麥基因組DNA和cDNA為模板進(jìn)行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，PCR產(chǎn)物連接到 PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組子，進(jìn)行序列測(cè)定。獲得了小麥 生長(zhǎng)素合成基因TaYUCCAl的基因序列和cDNA序列。該基因TaYUCCAl的基因序列為1448bp，含4個(gè)外顯子序列，分別為612bp、234bp、 123bp和180bp ；cDNA序列為1149bp，編碼382個(gè)氨基酸殘基。將TaYUCCAl編碼的氨基酸 序列與已知的來(lái)自擬南芥、水稻、玉米(Maize ZmSPIl)的YUCCA基因編碼的氨基酸序列進(jìn) 行聚類(lèi)分析表明，TaYUCCAl與擬南芥的YUCCA10和YUCCA11有較高的同源性。該結(jié)果表明 這個(gè)基因?yàn)樯L(zhǎng)素合成基因YUCCA在小麥中的同源基因。除了提供TaYUCCAl基因序列外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種改變植株形態(tài) 的方法，但也包括與生長(zhǎng)素參與調(diào)控的其它生物學(xué)性狀的改變。該方法包括用本發(fā)明的 TaYUCCAl基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物。所述轉(zhuǎn)化是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行。所用表達(dá)載 體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接的DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等導(dǎo)入植 物細(xì)胞。該基因的DNA序列如下CGCTACGAGT TGTGATGGAG GAGGTCGTAG TTTTGATTGT TGGCGCAGGG CCTGCGGGAC 60TCGCMCTGC AGCATGCGTT AGCCMTTCT CCATCCCATA TGTCATCGTT GAGCGTGAGA 120ATTGCAGCGC ATCACTATGG CGCMCCGCA CGTATGACCG TCTGAAGCTA CATCTAGCGA 180GGGMTTTTG TGAGTTGCCA CACATGCCAT ACCCTGCAGA TACCCCAACA TACATACCM 240AGMCACTTT CGTCAAGTAC GTGGATGACT ACATTGAGTG TTTCGCTATC CATACGAGGT 300ATCTCACTGT TGTTGAGTCA TCCACATATG ACTTCMTGG AAMTATTGG TCCATCATGG 360CGCACGACAT GGCAMGTGC AAMTAGTTA ATTACAGGGC AMGTTTCTT GTTGTGGCM 420GTGGTMGM TAGTGTTGAG MTATTCCAG TGGTCCCTGG CCTGGAAMC TTTCCGGGTG 480TGGCCATCCA TTCATCATGT TACAAGTCAG GCATCGACTA CTCCGGGAGG MCGTGTTGG 540TCATCGGATC TGGTMCTCT GGGATGGAGA TCGCCTACGA CCTTGCTTCT CATGGTGCCA 600ATACTTCTAT MTTATACGA AGTCCGGTAT GTATACTATA TGTGACTTTA ACTGCAMTC 660TCTTTTATAG ATCTTATTTT ATCTTGCATA TTGTAAMGA TGGTGACCCT TTTGTGACTG 720CAGATTCATG TMTGACAM GGMTTMTC CGACTAGGGA TGACACTAGT CCATTATCTT 780
CCACTAAAGA TGATAGATGG TCTCCTTTTG ATGATGGCAA ATGCCGTATT CGGGGACCTC 840
TCTAGGCATG GCATCACAAG ACCAGAAAAG GGTCCATTTG TGCTGAAGTC GGAAACTGGT 900
CGATCCGCAG TGATTGATGT TGGCACCATA GGGTTAATCA AGAAAGACAA AATTAAAGTG 960
AGCATATCCT CGGTCAAACA TACATAGTAT AAGAAATTTA GTTTCATATA TGACAAGTTA1020
TAGTTTTTAA CCTGCTGTAG GTTCATGGAA GGATTACTAA GATCAAAGGA AAAACAATTG1080
AATTTGAAGG TGGGAAGGAA GCCTCCTTTG ATGCCATTGT GTTTGCAACC GGATACAAAA1140
GCACAACAAA TTCGTGGCTC AAGGTAATAA GATAAACTGA GATTTGAATT TCATGCACTG1200
TAACTTCTCT AGATGCAAGA CTTGTTATAT GTTCTTAATC GAGTAAGATT TGCAAGTGCA1260
GAATGATGAG GACATGCTTA ATAGCGATGG CGTGCCCAAG AGGGAATTCC CTAATCATTG1320
GAAAGGGGCA AATGGGCTCT ACTGTGCCGG GTTAGGGAGA AGGGGATTGG CCGGTATTGC1380
CATGGATGCT AAGAACATCG CCAATGACAT TAAACGCAGC ATAGACTCTA TGTGCAGCTA1440
AAATAGCA1448
tJ cDNA:
CGCTACGAGT TGTg| TG|gAG GAGGTCGTAG TTTTGATTGT TGGCGCAGGG CCTGCGGGAC60
TCGCAACTGC AGCATGCGTT AGCCAATTCT CCATCCCATA TGTCATCGTT GAGCGTGAGA 120
ATTGCAGCGC ATCACTATGG CGCAACCGCA CGTATGACCG TCTGAAGCTA CATCTAGCGA 180
GGGAATTTTG TGAGTTGCCA CACATGCCAT ACCCTGCAGA TACCCCAACA TACATACCAA240
AGAACACTTT CGTCAAGTAC GTGGATGACT ACATTGAGTG TTTCGCTATC CATACGAGGT300
ATCTCACTGT TGTTGAGTCA TCCACATATG ACTTCAATGG AAAATATTGG TCCATCATGG360
CGCACGACAT GGCAAAGTGC AAAATAGTTA ATTACAGGGC AAAGTTTCTT GTTGTGGCAA420
GTGGTGAGAA TAGTGTTGAG AATATCCCAG TGGTCCCTGG CCTGGAAAAC TTTCCGGGTG480
TGGCCATCCA TTCATCATGT TATAAGTCAG GCATCGACTA CTCCGGGAGG AACGTGTTGG540
TCATCGGATC TGGTAACTCT GGGATGGAGA TCGCCTACGA CCTTGCTTCT CATGGTGCCA600
ATACTTCTAT AATTATACGA AGTCCGATTC ATGTAATGAC AAAGGAATTA ATCCGACTAG660
GGATGACACT AGTCCATTAT CTTCCACTAA AGATGATAGA TGGTCTCCTT TTGATGATGG720
CAAATGCCGT ATTCGGGGAC CTCTCTAGGC ATGGCATCAC AAGACCAGAA AAGGGTCCAT780
TTGTGCTGAA GTCGGAAACT GGTCGATCCG CAGTGATTGA TGTTGGCACC ATAGGGTTAA840
TCAAGAAAGA CAAAATTAAA GTTCATGGAA GGATTACTAA GATCAAAGGA AAAACAATTG900
AATTTGAAGG TGGGAAGGAA GCCTCCTTTG ATGCCATTGT GTTTGCAACC GGATACAAAA960
GCACAACAAA TTCGTGGCTC AAGAATGATG AGGACATGCT TAATAGCGAT GGCGTGCCCA1020
AGAAGGAATT CCCTAATCAT TGGAAAGGGG CAAATGGGCT CTACTGTGCC GGGTTAGGGA1080
GAAGGGGATT GGCCGGTATT GCCATGGATG CTAAGAACAT CGCCAATGAC ATTAAACGCA1140
GCATAGACTC TATGTGCAGC TAAAATAGCA1170
:
Met Glu Giù Val Val Val Leu Ile Val Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu
151015
Ala Thr Ala Ala Cys Val Ser Gin Phe Ser Ile Pro Tyr Val Ile Val
202530
Glu Arg Glu Asn Cys Ser Ala Ser Leu Trp Arg Asn Arg Thr Tyr Asp
354045
Arg Leu Lys Leu His Leu Ala Arg Glu Phe Cys Glu Leu Pro His Met
505560
Pro Tyr Pro Ala Asp Thr Pro Thr Tyr Ile Pro Lys Asn Thr Phe Val
65707580
Lys Tyr Val Asp Asp Tyr Ile Glu Cys Phe Ala Ile His Thr Arg Tyr
859095
Leu Thr Val Val Glu Ser Ser Thr Tyr Asp Phe Asn Gly Lys Tyr Trp
100105110
Ser Ile Met Ala His Asp Met Ala Lys Cys Lys Ile Val Asn Tyr Arg
115120125
Ala Lys Phe Leu Val Val Ala Ser Gly Glu Asn Ser Val Glu Asn Ile
130135140
Pro Val Val Pro Gly Leu Glu Asn Phe Pro Gly Val Ala Ile His Ser
145150155160
Ser Cys Tyr Lys Ser Gly Ile Asp Tyr Ser Gly Arg Asn Val Leu Val
165170175
Ile Gly Ser Gly Asn Ser Gly Met Glu Ile Ala Tyr Asp Leu Ala Ser
180185190
His Gly Ala Asn Thr Ser Ile Ile Ile Arg Ser Pro Ile His Val Met
195200205
Thr Lys Glu Leu Ile Arg Leu Gly Met Thr Leu Val His Tyr Leu Pro
210215220
Leu Lys Met Ile Asp Gly Leu Leu Leu Met Met Ala Asn Ala Val Phe
225230235240
Gly Asp Leu Ser Arg His Gly Ile Thr Arg Pro Glu Lys Gly Pro Phe
245250255
Val Leu Lys Ser Glu Thr Gly Arg Ser Ala Val Ile Asp Val Gly Thr
260265270
Ile Gly Leu Ile Lys Lys Asp Lys Ile Lys Val His Gly Arg Ile Thr
275280285
Lys Ile Lys Gly Lys Thr Ile Glu Phe Glu Gly Gly Lys Glu Ala Ser
290295300
Phe Asp Alalie Val Phe Ala Thr Gly Tyr Lys Ser Thr Thr Asn Ser
305310315320
Trp Leu Lys Asn Asp Glu Asp Met Leu Asn Ser Asp Gly Val Pro Lys
325330335
Lys Glu Phe Pro Asn His Trp Lys Gly Ala Asn Gly Leu Tyr Cys Ala
340345350Gly Leu Gly Arg Arg Gly Leu Ala Gly He Ala Met Asp Ala Lys Asn355360365He Ala Asn Asp He Lys Arg Ser He Asp Ser Met Cys Ser370380本發(fā)明提供了小麥新 型生長(zhǎng)素合成基因TaYUCCAl在其它植物中應(yīng)用的方法，可以改變轉(zhuǎn)基因植物株型。步驟為(a)利用如上述的TaYUCCAl基因，將其cDNA序列置于pR0K2載體的CaMV 35S啟動(dòng)子之后，構(gòu)建植物表達(dá)載體pR0K2-TaYUCCAl。對(duì)于單子葉植物如小麥、水稻、玉米等的轉(zhuǎn)化用的載體的構(gòu)建，可以采用類(lèi)似的方法將cDNA序列置于本領(lǐng)域人員熟知的Ubi等組成型啟動(dòng)子或組織特異型啟動(dòng)子之后，構(gòu)建植物表達(dá)載體。(b)采用本領(lǐng)域熟知的方法如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明涉及一種植物表達(dá)載體，包含有權(quán)利要求I所述的核苷酸序列SEQ.ID. NO. 2，用于改變植物株型，尤其是株高、葉型等。本發(fā)明涉及將上述植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，導(dǎo)入方法都是本領(lǐng)域人員熟知的，這些方法包括但不僅限于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、基因槍法、電擊法、顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法等，得到株型改變的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明人根據(jù)擬南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麥的EST序列設(shè)計(jì)引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、基因克隆等技術(shù)，從小麥(Triticum aestivum)中分離出編碼合成生長(zhǎng)素的TaYUCCAl基因序列。進(jìn)一步構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因植物株型改變，表現(xiàn)下胚軸加長(zhǎng)、株聞提聞、頂端優(yōu)勢(shì)增強(qiáng)、葉柄伸長(zhǎng)和葉片細(xì)長(zhǎng)卷曲等生長(zhǎng)素含量提聞的癥狀。本發(fā)明所用選擇標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因，可進(jìn)一步包括其它選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因?；跀M南芥生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)周期短、遺傳轉(zhuǎn)化效率高、基因組已經(jīng)測(cè)序、已經(jīng)作為生物學(xué)研究的模式植物等優(yōu)點(diǎn)，在下述實(shí)施例中以擬南芥為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明中TaYUCCAl基因及含有該基因的植物表達(dá)載體也可以用于生產(chǎn)其它株型改變的轉(zhuǎn)基因植物，包括用于形態(tài)改變的植物的器官、組織、細(xì)胞及其種子和后代。本發(fā)明對(duì)采用浸花法獲得的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行形態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥中TaYUCCAl的過(guò)量表達(dá)能顯著改變其株型?？蓪⒃摶蜣D(zhuǎn)化小麥、水稻、玉米、棉花等農(nóng)作物、需要改變株型的花卉植物或其它植物，改變其株型，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。


圖I.小麥 TaYUCCAl 的基因組 DNA 擴(kuò)增電泳圖。M, Marker DL2000 ；A, TaYUCCAl的基因全長(zhǎng)片段。圖 2.小麥 TaYUCCAl 的 cDNA 擴(kuò)增電泳圖。M，Marker DL2000 ；B, TaYUCCAl 的 cDNA全長(zhǎng)片段。
圖3.小麥中TaYUCCAl氨基酸序列與幾種其它植物的YUCCA氨基酸序列的聚類(lèi)結(jié)果。它們?cè)贕enBank中的注冊(cè)號(hào)及其物種來(lái)源分別為0sYUCCAl (水稻，BAD68007)、0sYUCCA2 (水稻，AAU43964)、0sYUCCA3 (水稻，BAD87432)、0sYUCCA4 (水稻，BAB32703)、0sYUCCA5 (水稻，ABA99096)、0sYUCCA6 (水稻，BAC80117)、0sYUCCA7 (水稻，CAE76085)、YUCCAl (擬南芥，At4g32540)、YUCCA2(擬南芥，At4gl3260)、YUCCA3 (擬南芥，Atlg04610)、YUCCA4(擬南芥，At5gll320)、YUCCA5(擬南芥，At5g43890)、YUCCA6 (擬南芥，At5g25620)、YUCCA7 (擬南芥，At2g33230)、YUCCA8 (擬南芥，At4g04610)、YUCCA9 (擬南芥，Atlg04180)、YUCCA 10 (擬南芥，Atlg48910)、YUCCAlI (擬南芥，Atlg21430)、ZmSPIl (玉米，ACI43575)。圖4.小麥中TaYUCCAl氨基酸序列與幾種其它植物的YUCCA氨基酸序列的聚類(lèi)結(jié)果。它們?cè)贕enBank中的注冊(cè)號(hào)及其物種來(lái)源分別為0sYUCCA4(水稻，BAB32703)、YUCCA 10 (擬南芥，Atlg48910)、YUCCAlI (擬南芥，Atlg21430)、ZmSPIl (玉米，ACI43575)。圖5.構(gòu)建的植物表達(dá)載體示意圖。
圖6.部分轉(zhuǎn)基因植株的 PCR 鑒定結(jié)果。M =Marker DL2000 ；CK+ :pR0K2_TaYUCCAl質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照；CK-:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?_5 :轉(zhuǎn)基因擬南芥各株系。圖7 :過(guò)量表達(dá)TaYUCCAl的轉(zhuǎn)基因擬南芥可以提高株高，葉片細(xì)長(zhǎng)卷曲。A :示轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)50天時(shí)株高可達(dá)60厘米；B :示生長(zhǎng)20天時(shí)的野生型擬南芥，葉片橢圓形；C :示生長(zhǎng)20天的轉(zhuǎn)基因擬南芥，葉片細(xì)長(zhǎng)卷曲。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施方式(一)小麥新型生長(zhǎng)素合成基因TaYUCCAl基因序列I.小麥基因組DNA的提取利用CTAB法從小麥三葉期幼苗中提取小麥DNA ；2. TaYUCCAl基因序列的獲得根據(jù)擬南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麥的EST序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物正向引物TaYUCCAlF2 5，-TGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3’ ；反向引物TaYUCCAR2 5 ’ -TTTTAGCTGCACATAGAGTC-3 ’。以小麥基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得TaYUCCAl基因。50 反應(yīng)體系中含第一鏈 cDNA 產(chǎn)物 l、25ii I 的 LA GC Taq DNA 聚合酶緩沖液 GC buffer IUu I I Ommol/L的dNTP、分別加IiU 50iimol/L的上游引物和下游引物、0. 5iil LA GC Taq DNA聚合酶，其余用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊。反應(yīng)程序?yàn)?50C 3min ;然后運(yùn)行 35 個(gè)循環(huán)94°C lmin,50°C lmin,72°C°C 2min ;最后于72°C 延伸 5min。反應(yīng)完畢后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，得到約1.5kb的條帶(圖1)，按照TaKaRa公司的DNA片段凝膠回收試劑盒說(shuō)明純化回收該片段。取回收的PCR產(chǎn)物4 yl與克隆載體PMD18-T連接，操作步驟按照TaRaKa公司產(chǎn)品pMD18_T Vector說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素^Omg/L)、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落至含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)8h，進(jìn)行菌液PCR鑒定。將正確的菌樣堿法小量提取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒PCR和酶切鑒定正確后進(jìn)行序列測(cè)定。3.同源檢索利用BLAST軟件將分離出的全長(zhǎng)TaYUCCAl序列與GenBank中的序列進(jìn)行比較。實(shí)施方式(二)小麥新型生長(zhǎng)素合成基因TaYUCCAl基因cDNA序列的克隆1. RNA 的提取用 Roche Applied Science 公司 Tripure Isolation Reagent 總RNA提取試劑盒提取小麥三葉期幼苗總RNA2. cDNA第一鏈的合成按照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在0. 2ml離心管中加入試劑
Total RNA5. 0 n I
01igo(dT)l81.0 nl
2XES Reaction Mix10. 0 u I
ES Reverse Transcriptase I. 0 uI
Rnase-free Water to20. 0 U I輕輕混勻，稍離心后，42°C保溫50min，70°C加熱15min。然后_20°C保存?zhèn)溆谩?. cDNA全長(zhǎng)序列的獲得根據(jù)擬南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麥的EST序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物正向引物TaYUCCAlF2 5，-TGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3，；反向引物TaYUCCAR2 5 ’ -TTTTAGCTGCACATAGAGTC-3 ’。以上述的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得TaYUCCAl基因cDNA序列。50 反應(yīng)體系中含第一鏈cDNA產(chǎn)物4 ill、25 ill的LA GC Taq DNA聚合酶緩沖液GC buffer IUu I
IOmmo I/L的dNTP、分別加Iul 50 u mol/L的上游引物和下游引物、0. 5u I LA GC Taq DNA聚合酶，其余用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊。反應(yīng)程序?yàn)?50C 3min ;然后運(yùn)行 35 個(gè)循環(huán)94°C lmin,50°C lmin,72°C lmin30sec ;最后于72°C 延伸 5min。反應(yīng)完畢后，過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，得到約I. 2kb的條帶(圖2)，按照TaKaRa公司的DNA片段凝膠回收試劑盒說(shuō)明純化回收該片段。取回收的PCR產(chǎn)物4 yl與克隆載體PMD18-T連接，操作步驟按照TaRaKa公司產(chǎn)品pMD18_T Vector說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素^0mg/L)、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落至含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)8h，進(jìn)行菌液PCR鑒定。將正確的菌樣堿法小量提取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒PCR和酶切鑒定正確后進(jìn)行序列測(cè)定。4.同源檢索利用BLAST軟件將分離出的全長(zhǎng)TaYUCCAl的cDNA序列與GenBank中的序列進(jìn)行比較。將TaYUCCAI編碼的氨基酸序列與已知的來(lái)自擬南芥、水稻、玉米(Maize ZmSPIl)的YUCCA基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行聚類(lèi)分析表明，TaYUCCAl與擬南芥的YUCCA10和YUCCA11有較高的同源性(圖3)。該結(jié)果表明這個(gè)基因?yàn)樯L(zhǎng)素合成基因YUCCA在小麥中的同源基因。TaYUCCAl的氨基酸序列與水稻0sYUCCA4 (BAB32703)、擬南芥YUCCA10(Atlg48910)、YUCCA 11 (Atl g21430)和玉米 ZmSPIl (ACI43575)序列類(lèi)比分析表明，這幾個(gè)序列見(jiàn)有多個(gè)保守的位點(diǎn)(圖4)。5. TaYUCCAl基因內(nèi)含子分析根據(jù)實(shí)施方式(一)和實(shí)施方式(二)中分別獲得的基因序列以及cDNA序列進(jìn)行比較，分析內(nèi)含子的信息。實(shí)施方式(三)小麥新型生長(zhǎng)素合成基因TaYUCCAl的序列見(jiàn)SEQ. ID. NO. USEQ.ID. NO. 2 和 SEQ. ID. NO. 3。實(shí)施方式(四)表達(dá)載體pR0K2_TaYUCCAl的構(gòu)建(I)根據(jù)分離出的TaYUCCAl基因的cDNA核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物正向引物TaYUCCAlFl :5’ -CGGGGATCCTGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3 (下劃線為 BamHI切點(diǎn))；反向引物TaYUCCAlRl :5’ -CGGGGTACCTTTTAGCTGCACATAGAGTC-3’(下劃線為 KpnI切點(diǎn))。以小麥三葉期幼苗的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。(2)取PCR產(chǎn)物4 ill與pMD19-T Simple載體連接，操作步驟按照TaKaRa公司產(chǎn)品PMD19-T Simple Vector說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素^Omg/L)、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落至含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)8h，進(jìn)行菌液PCR鑒定。將正確的菌樣堿法小量提取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒PCR和酶切鑒定正確后進(jìn)行序列測(cè)定。(3)以步驟⑵所得的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I和Kpa I進(jìn)行雙酶切，回收酶切片段，與用相同酶切并回收的PR0K2表達(dá)載體連接。連接體系如下
目的 TaYUCCAl 片段 DNA3. 0 u I 酶切回收的載體PR0K2片段5.0 Ul
IOXT4連接酶緩沖液1.0 Ul
T4連接酶1.0 Ul混勻后于16°C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序鑒定。構(gòu)建成功植物表達(dá)載體pR0K2-TaYUCCAl (圖5)。(4)將構(gòu)建好的表達(dá)載體pR0K2_TaYUCCAl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，本發(fā)明采用的是凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。實(shí)施方式(五)轉(zhuǎn)基因植物的獲得(I)野生型擬南芥(Columbia生態(tài)型)種子播種于浸透1/2MS培養(yǎng)液的育苗基質(zhì)中，4°C下春花2-3天。然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱中23°C下光照培養(yǎng)，16h光照/8h黑暗。(2)挑取攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C，250rpm，振蕩培養(yǎng)約48小時(shí)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。(3)離心收集菌體，沉淀用滲透液(1/2 MS培養(yǎng)液中含5%蔗糖，0.02% Silwet、L-77)懸浮，菌液OD6tltl在0. 8左右。(4)將未授粉的擬南芥花序浸入滲透液中，浸泡50sec，用塑料薄膜覆蓋整個(gè)托盤(pán)并適留通氣孔后，在弱光下培養(yǎng)，24h后取下薄膜，于室溫中繼續(xù)培養(yǎng)。收獲種子。(5)將收獲的種子在篩選培養(yǎng)基(1/2MS鹽，1%蔗糖，pH5. 7，0. 8%瓊脂，卡那霉素50mg/L)上篩選，培養(yǎng)得到抗性植株。(6)根據(jù)TaYUCCAl序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物正向引物TaYUCCAlF2 5，-TGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3’ ；反向引物TaYUCCAR2 5 ’ -TTTTAGCTGCACATAGAGTC-3 ’。
提取野生型及抗性植株的基因組DNA，進(jìn)行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定(圖6)。(7)將T3代純合株系種子于燒透1/2MS培養(yǎng)液的育苗基質(zhì)缽上培養(yǎng)。觀察植株表型變化。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)下胚軸加長(zhǎng)、株高提高、頂端優(yōu)勢(shì)增強(qiáng)、葉柄伸長(zhǎng)和葉片細(xì)長(zhǎng)卷曲等生長(zhǎng)素含量提高的癥狀(圖7)?？蓪⒃摶蜣D(zhuǎn)化小麥、玉米、棉花、花卉等農(nóng)作物，改變植物的株型，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種小麥生長(zhǎng)素合成基因TaYUCCAl，其特征在于，其基因核苷酸序列如SEQ.ID. NO. I所示；其cDNA的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小麥生長(zhǎng)素合成基因TaYUCCAl，其特征在于，該基因選自小麥。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種小麥生長(zhǎng)素合成基因TaYUCCAl的應(yīng)用，其特征在于，該基因在擬南芥中過(guò)量表達(dá)，能改變轉(zhuǎn)基因擬南芥的株型，如下胚軸加長(zhǎng)、株聞提聞、頂端優(yōu)勢(shì)增強(qiáng)、葉柄伸長(zhǎng)和葉片細(xì)長(zhǎng)卷曲等生長(zhǎng)素含量提高的癥狀。
4.一種植物表達(dá)載體,包含有權(quán)利要求I所述的核苷酸序列SEQ. ID. NO. 2。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一小麥生長(zhǎng)素合成基因TaYUCCA1，其基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其cDNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。將該基因的全長(zhǎng)cDNA序列置于CaMV 35S啟動(dòng)子之后，構(gòu)建植物表達(dá)載體pROK2-TaYUCCA1，轉(zhuǎn)化擬南芥，使該基因在擬南芥中過(guò)量表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)下胚軸加長(zhǎng)、株高提高、頂端優(yōu)勢(shì)增強(qiáng)、葉柄伸長(zhǎng)和葉片細(xì)長(zhǎng)卷曲等生長(zhǎng)素含量提高的癥狀。如將該基因轉(zhuǎn)化小麥、水稻、玉米等農(nóng)作物、需要改變株型的花卉植物或其它植物，改變其株型，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102660556SQ201210146830
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者封德順, 尹娜, 王洪剛, 馬信 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)