專利名稱：生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工業(yè)的技術(shù)，更明確地，涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法。作為可通過發(fā)酵生產(chǎn)的堿性物質(zhì)，例如L-賴氨酸作為動(dòng)物飼料的添加劑是有用的，L-精氨酸和L-組氨酸對(duì)于藥物制劑例如輸注液(infusion)是有用的。
背景技術(shù)：
在通過發(fā)酵生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法中，培養(yǎng)具有產(chǎn)生堿性物質(zhì)的能力的微生物來在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累堿性物質(zhì)，并從所述培養(yǎng)基收集所述堿性物質(zhì)。在這種方法中，作為分批培養(yǎng)、補(bǔ)料培養(yǎng)·(feeding culture)或連續(xù)培養(yǎng)來進(jìn)行培養(yǎng)。在這樣的通過發(fā)酵生產(chǎn)堿性物質(zhì)中，一般地將硫酸根離子或氯離子添加到培養(yǎng)基中作為目標(biāo)物質(zhì)的反荷陰離子，所述目標(biāo)物質(zhì)在培養(yǎng)基中解離成陽離子來將培養(yǎng)基的PH維持在中性水平(特開平5-30985號(hào)公報(bào)和特開平5-244969號(hào)公報(bào))。在需要進(jìn)行純化時(shí)，很多情況下通過離子交換從培養(yǎng)基中收集堿性物質(zhì)。例如，在L-賴氨酸的情況下，將發(fā)酵液調(diào)整為弱酸性之后，L-賴氨酸被吸附在離子交換樹脂上，然后用銨離子從樹脂上洗脫。洗脫的L-賴氨酸按原樣(asit is)作為賴氨酸堿(lysinebase)來直接使用，或可以與鹽酸結(jié)晶來形成L-賴氨酸鹽酸鹽。當(dāng)在上述的L-賴氨酸純化中氯離子被用作培養(yǎng)基中的反荷陰離子時(shí)，可以通過濃縮培養(yǎng)基直接獲得L-賴氨酸鹽酸鹽。然而，由于氯離子腐蝕金屬發(fā)酵罐等等，在實(shí)際生產(chǎn)中使它們以高濃度存在于培養(yǎng)基中不是優(yōu)選的。另一方面，當(dāng)不純化堿性物質(zhì)時(shí)，按照原樣濃縮發(fā)酵液，或用鹽酸或硫酸調(diào)為弱酸性，隨后噴霧造粒。在這種情況下，殘余成分含有添加到培養(yǎng)基的反荷陰離子，因而在得到的發(fā)酵產(chǎn)物中堿性物質(zhì)的含量被降低。特開2002-65287(美國(guó)專利申請(qǐng)N0.2002025564)公開了在堿性氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)中利用碳酸根離子和碳酸氫根離子作為堿性氨基酸的反荷陰離子來代替一部分硫酸根離子或氯離子的方法。通過將培養(yǎng)基的PH值調(diào)為酸性，或濃縮培養(yǎng)基，或這兩種途徑，可以相對(duì)容易地從培養(yǎng)基中除去碳酸根離子和碳酸氫根離子。以上引用的出版物教導(dǎo)了控制發(fā)酵罐中的內(nèi)部壓力使它在發(fā)酵過程中為正值、或?qū)⒍趸細(xì)怏w或含有二氧化碳的混合氣體添加到培養(yǎng)基中的方法作為向培養(yǎng)基添加碳酸根離子和碳酸氫根離子的手段。然而，在典型培養(yǎng)基條件下，例如中性pH值，就算有的話，也僅有少量的二氧化碳?xì)怏w溶解。因此，為了維持培養(yǎng)基中碳酸氫根離子和碳酸根離子的存在從而降低維持硫酸根離子或氯離子濃度的影響，必須在堿性PH下進(jìn)行培養(yǎng)。然而，如果pH值變高，細(xì)菌生長(zhǎng)速率和目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)力通常被降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種方法，用于在通過使用具有生產(chǎn)目標(biāo)堿性物質(zhì)能力的微生物進(jìn)行發(fā)酵的堿性物質(zhì)生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)硫酸根離子和氯離子的降低和目標(biāo)物質(zhì)的有效生產(chǎn)，并利用碳酸根離子和碳酸氫根離子作為所述堿性物質(zhì)的反荷陰離子同時(shí)避免微生物生長(zhǎng)速率的降低或目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)力的降低。當(dāng)使用棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏菌屬細(xì)菌來發(fā)酵生產(chǎn)堿性物質(zhì)時(shí)，如果pH變得過高，細(xì)菌生長(zhǎng)速率或目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)力通常被降低。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，引起這種現(xiàn)象的主要因素是氨，其被添加到培養(yǎng)基中作為用于堿性物質(zhì)生產(chǎn)、細(xì)菌生長(zhǎng)的氮源，或作為堿性物質(zhì)的反荷離子的來源，通過將總氨濃度控制在適合的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵可以顯著地抑制高PH值條件下微生物生長(zhǎng)速率或目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)力的降低。在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明提供如下。(I) 一種通過發(fā)酵來生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法，包括在發(fā)酵罐中含有的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)所述堿性物質(zhì)的能力的微生物，從而在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累所述堿性物質(zhì)，其中在培養(yǎng)過程的總時(shí)期的至少一部分期間通過將所述培養(yǎng)基中總氨濃度調(diào)節(jié)到特定濃度范圍之內(nèi)，來降低用作所述堿性物質(zhì)的反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的量。(2)根據(jù)⑴的方法，其中所述總氨濃度的特定濃度范圍是滿足以下條件的范圍:(A)所述培養(yǎng)基中銨離子的濃度是這樣的水平，使得溶于所述培養(yǎng)基中的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子以及其他陰離子的離子當(dāng)量的總和大于所述培養(yǎng)基中積累的所述堿性物質(zhì)中電離的所述堿性物質(zhì)的離子當(dāng)量，以及(B)所述培養(yǎng)基中所述總氨濃度是不抑制所述微生物的堿性物質(zhì)生產(chǎn)的水平，其是如下預(yù)先確定的: 在具有不同pH值和不同總氨濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，測(cè)量每個(gè)pH值和每個(gè)總氨濃度下的所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力，確定各個(gè)PH值條件下提供最佳條件下的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的50 %或更高的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的總氨濃度。(3)根據(jù)⑴的方法，其中所述總氨濃度的特定范圍是如下預(yù)先測(cè)定的:(A’ )在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有其量足以在pH 7.2或更低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子作為所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的反荷離子的來源，通過添加氨氣、氨水和尿素的至少一種來將所述培養(yǎng)基的PH值維持在6.5到7.2之間的范圍內(nèi)，并測(cè)量所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力，(B’ )在與步驟(A’ )中使用的培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)，只是培養(yǎng)基成分的硫酸根離子和/或氯離子降低期望的量，在一定時(shí)期內(nèi)用不同的總氨濃度繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，在所述時(shí)期中由于所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累引起的作為堿性物質(zhì)反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的不足，維持所述培養(yǎng)基的PH值到7.2或更低變得不可能，以根據(jù)步驟(A’ )中測(cè)量的生產(chǎn)力來確定提供了 50%或更高生產(chǎn)力的總氨濃度范圍。(4)根據(jù)⑴的方法，其中所述總時(shí)期的至少一部分包括下列中的至少一個(gè):由于所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累引起的反荷離子的不足而使所述培養(yǎng)基的PH值提高的時(shí)期，和由于向所述培養(yǎng)基添加陽離子而使所述PH值提高的時(shí)期。(5)根據(jù)(I)的方法，其中當(dāng)根據(jù)如下指標(biāo)所測(cè)定的所述微生物的活性降低或停止時(shí)，通過向所述培養(yǎng)基添加氨或尿素來調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基中的總氨濃度，所述指標(biāo)是:所述培養(yǎng)基中溶解的氧濃度、所述培養(yǎng)基中碳源的消耗率、所述培養(yǎng)基的混濁度、所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力、和觀察到的所述培養(yǎng)基中的pH值變化。(6)根據(jù)⑴的方法，其中將與含有其量足以在pH值7.2或更低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子作為所述堿性物質(zhì)的反荷離子來源的培養(yǎng)基具有相同組分、只是將硫酸根離子和/或氯離子降低期望的量的培養(yǎng)基用作培養(yǎng)基，以及所述總時(shí)期的至少一部分是一個(gè)時(shí)期，在所述時(shí)期中由于所述培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的引起的反荷離子不足，所述培養(yǎng)基的PH值不能被維持在7.2或更低。(7)根據(jù)(2)的方法，其中所述其他陰離子選自硫酸根離子、氯離子、磷酸根離子和電離的有機(jī)酸。(8)根據(jù)⑵或(7)的方法，其中所述其他陰離子的總量是900meq/l或更低。(9)根據(jù)⑴的方法，其中所述培養(yǎng)基中的所述總氨濃度被調(diào)節(jié)到200mM或更低。(10)根據(jù)(I)的方法，其包括增殖所述微生物的步驟。(11)根據(jù)(10)的方法，其中在增殖所述微生物的所述步驟期間不調(diào)節(jié)所述總氨濃度。(12)根據(jù)(I)的方法，其中所述堿性物質(zhì)選自L-賴氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸。(13)根據(jù)(12)的方法，其中`所述堿性物質(zhì)是L-賴氨酸。(14)根據(jù)(12)的方法，其中所述堿性物質(zhì)是L-精氨酸。(15)根據(jù)(I)的方法，其中所述培養(yǎng)基或其處理物在發(fā)酵之后被加熱以除去碳酸氫根離子和碳酸根離子。(16)根據(jù)⑴的方法，其中所述微生物是棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏菌屬細(xì)菌。(17)含有堿性物質(zhì)的發(fā)酵液或發(fā)酵產(chǎn)物，其可以通過根據(jù)(15)的方法獲得。


圖1顯示通過使用常規(guī)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法進(jìn)行的L-賴氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)結(jié)果。圖2顯示在限制銨濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行的L-賴氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)結(jié)果。圖3顯示通過僅控制總氨濃度而非控制pH值進(jìn)行的L-賴氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)結(jié)果。圖4顯示在常規(guī)培養(yǎng)基和沒有硫酸銨和氯化銨的培養(yǎng)基中總氨濃度和pH值隨時(shí)間的變化。圖5顯示在限制銨濃度的培養(yǎng)基中L-精氨酸發(fā)酵的生長(zhǎng)、總氨濃度、pH值和殘?zhí)橇侩S時(shí)間的變化。圖6顯示在限制銨濃度的培養(yǎng)基中L-精氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)結(jié)果。發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案以下，將詳細(xì)解釋本發(fā)明。本發(fā)明的方法是通過發(fā)酵生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法，其包括在發(fā)酵罐中含有的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)能生產(chǎn)所述堿性物質(zhì)的微生物，從而在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累所述堿性物質(zhì)。本發(fā)明的方法的特征在于，通過在培養(yǎng)過程的總時(shí)期的至少一部分期間將培養(yǎng)基中總氨濃度調(diào)節(jié)到特定濃度范圍之內(nèi)來降低用作所述堿性物質(zhì)的反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的量。也就是說，本發(fā)明的方法是在培養(yǎng)基中生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法，在所述培養(yǎng)基中通過使用這樣的總氨濃度以確保所述總氨作為氮源處在所述微生物的生長(zhǎng)或所述目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)所需的量，從而降低了硫酸根離子和氯離子，并且所述微生物的生長(zhǎng)或所述目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)不被抑制?？偘睗舛鹊奶囟ǚ秶膶?shí)例包括滿足以下條件的范圍:(A)所述培養(yǎng)基中銨離子的濃度是這樣的水平，使得溶于所述培養(yǎng)基中的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子以及其他陰離子的離子當(dāng)量的總和大于從所述培養(yǎng)基中積累的所述堿性物質(zhì)電離的所述堿性物質(zhì)的離子當(dāng)量，以及(B)所述培養(yǎng)基中所述總氨濃度是不抑制所述微生物的堿性物質(zhì)生產(chǎn)的水平，其是如下預(yù)先確定的:在具有不同的pH值和不同的總氨濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，測(cè)量每個(gè)pH值和每個(gè)總氨濃度下的所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力，確定各個(gè)pH值條件下提供最佳條件下的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的50 %或更高的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的總氨濃度。此外，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述總氨濃度的特定范圍如下預(yù)先測(cè)定。
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(A’)(步驟1:在中性條件下評(píng)估發(fā)酵結(jié)果)在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含足以在pH 7.2或更低的pH下進(jìn)行培養(yǎng)的量的硫酸根離子和/或氯離子作為所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的反荷離子的來源，通過添加氨氣、氨水和尿素的至少一種來將所述培養(yǎng)基的PH值維持在6.5到7.2之間的范圍內(nèi)，并測(cè)量所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力，(B’)(步驟2:降低硫酸根離子和氯離子的量，改變銨離子濃度時(shí)的發(fā)酵結(jié)果的評(píng)價(jià))在與如上所述步驟I (步驟A’ )中使用的培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)，只是培養(yǎng)基成分的硫酸根離子和/或氯離子降低期望的量，用不同的總氨濃度繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)一段時(shí)間，在所述期間由于所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累，導(dǎo)致作為堿性物質(zhì)反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子不足，從而維持所述培養(yǎng)基的PH值到7.2或更低變得不可能，根據(jù)步驟(A’ )中測(cè)量的生產(chǎn)力來確定提供了 50%或更高生產(chǎn)力的總氨濃度范圍。
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此外，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)沒有預(yù)先測(cè)定總氨濃度的特定范圍時(shí)，可以將總氨濃度調(diào)節(jié)到所述預(yù)定范圍之內(nèi)。具體地，當(dāng)根據(jù)所述培養(yǎng)基中溶解的氧濃度、所述培養(yǎng)基中碳源的消耗率、所述培養(yǎng)基的混濁度、所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力、和觀察到的所述培養(yǎng)基中的PH值變化作為指標(biāo)而測(cè)定的所述微生物的活性降低或停止時(shí)，通過向所述培養(yǎng)基添加氨或尿素來調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基中的總氨濃度。所述培養(yǎng)基具有與含有其量足以在PH值7.2或更低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子作為所述堿性物質(zhì)的反荷離子來源的培養(yǎng)基相同的組分，只是將硫酸根離子和/或氯離子降低期望的量。所述總時(shí)期的至少一部分的實(shí)例包括一個(gè)時(shí)期，在所述時(shí)期中由于所述培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)而使反荷離子不足，所述培養(yǎng)基的PH值不能被維持在7.2或更低。其他陰離子的實(shí)例包括氯離子、硫酸根離子、磷酸根離子、有機(jī)酸(乙酸、乳酸、琥珀酸等)的離子，等等。此外，溶于所述培養(yǎng)基的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子起到堿性物質(zhì)的反荷陰離子的作用。在本發(fā)明中，離子當(dāng)量是通過每種離子的摩爾濃度乘以該離子的化合價(jià)獲得的值，它以eq/Ι的單位來表示。也就是說，ImM單價(jià)離子的離子當(dāng)量是lmeq/1, ImM 二價(jià)離子的離子當(dāng)量是2meq/l。調(diào)節(jié)上述的總氨濃度來使培養(yǎng)基中存在的總氨處在微生物的生長(zhǎng)或堿性物質(zhì)的產(chǎn)生所需的量，并且處于不抑制微生物的堿性物質(zhì)生產(chǎn)的濃度，從而所述培養(yǎng)基被自動(dòng)地調(diào)節(jié)到適合于溶解作為堿性物質(zhì)的反荷陰離子所需的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的pH值。在本發(fā)明中，“總氨”是指未解離的氨(NH3)和銨離子(NH4+)的總和。當(dāng)調(diào)節(jié)所述總氨濃度時(shí)，可以測(cè)量未離解的氨或銨離子，或可以測(cè)量這兩者。一般地，向培養(yǎng)基添加硫酸銨和氯化銨作為堿性物質(zhì)的反荷陰離子的來源和氮源，一般而言。此外，由于氨和尿素一般用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值，在培養(yǎng)基中存在高濃度的氨和銨離子。當(dāng)降低硫酸銨或氯化銨的量以降低添加到培養(yǎng)基的硫酸根離子或氯離子的量時(shí)，以相應(yīng)于被降低量的量來提供氮源例如氨。對(duì)于這種操作，必須的是開發(fā)一種提供氨的方法，其考慮到陽離子和陰離子之間的平衡，所述陽離子包括由細(xì)菌產(chǎn)生的和隨培養(yǎng)的進(jìn)展而增加的那些陽離子，例如目標(biāo)堿性物質(zhì)的陽離子、從添加的氨電離的陽離子、添加到培養(yǎng)基的陽離子例如鈉離子和鉀離子等等，所述陰離子為由于細(xì)菌的呼吸作用或向培養(yǎng)基添加而產(chǎn)生的在培養(yǎng)基中增加的陰離子。如果不能維持這種平衡，發(fā)酵將不會(huì)發(fā)展，因?yàn)榘睗舛葧?huì)變得過高，或pH值會(huì)變得過高，或反之，氨會(huì)被耗盡。根據(jù)本發(fā)明，開發(fā)添加氨來將總氨濃度調(diào)節(jié)到特定范圍之內(nèi)的方法可以有利地維持陽離子和陰離子的上述平衡，因而甚至在培養(yǎng)基中存在的硫酸根離子和氯離子的量降低的條件下，也可以實(shí)現(xiàn)微生物的良好生長(zhǎng)和堿性物質(zhì)的順利產(chǎn)生。通過向培養(yǎng)基添加氨氣、氨溶液和尿素的至少一種來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的總氨濃度，使得培養(yǎng)基中的總氨濃度處在可接受的水平。此外，也可以添加銨鹽，例如氯化銨或硫酸銨，只要無損于本發(fā)明的效果。此外，也可以使用含有碳酸氫根離子或碳酸根離子作為反荷離子的銨鹽，其可以在完成培養(yǎng)之后作為氣體容易地除去。通過使用培養(yǎng)基或排氣(exhaust gas)中的銨離子或氨濃度的測(cè)量值作為指標(biāo),可以調(diào)節(jié)總氨濃度。此外,還可能的是，通過預(yù)先測(cè)定提供了可接受的總氨濃度的PH值來調(diào)節(jié)總氨濃度，此時(shí)用氨或添加氨來調(diào)節(jié)PH值從而可以獲得這樣的pH值。在這種情況下，如果需要，在培養(yǎng)期間可以變化如上所述測(cè)定的PH值。此外，當(dāng)根據(jù)所述培養(yǎng)基中溶解的氧濃度、所述培養(yǎng)基中碳源的消耗率、所述培養(yǎng)基的混濁度、所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力、和觀察到的所述培養(yǎng)基中的PH值變化作為指標(biāo)所測(cè)定的所述微生物的活性降低或停止時(shí)，通過向所述培養(yǎng)基添加氨或尿素，也可以調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基中的總氨濃度。也就是說，如果培養(yǎng)基中的氮源變得不足或被耗盡，微生物的增殖或微生物的活性，例如目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)被降低或停止。微生物的活性通常表現(xiàn)為培養(yǎng)基中溶解氧和碳源的消耗、培養(yǎng)基混濁度的提高、目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)和由于通過呼吸作用的氨消耗或二氧化碳釋放引起的培養(yǎng)基的PH降低。因此，當(dāng)微生物的活性降低或停止時(shí)，在每單位時(shí)間的通氣量和攪拌速度恒定時(shí)培養(yǎng)基中溶解氧的濃度增加，二氧化碳分泌和氨消耗的下降，從而培養(yǎng)基的PH值提高。此外， 碳源的消耗速度、培養(yǎng)基混濁度的增加速度和目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)速度降低。因此，在除氮源之外的培養(yǎng)基成分充足的狀態(tài)之下根據(jù)這些項(xiàng)目作為指標(biāo)觀察到微生物活性的停滯(stagnation)時(shí)，氮源變得不足或被耗盡。如果這種情況發(fā)生，以微生物的生長(zhǎng)或目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)所需的量向培養(yǎng)基添加氨或尿素。通過重復(fù)這個(gè)步驟，作為結(jié)果，培養(yǎng)基中的總氨濃度被維持在特定范圍之內(nèi)。如果向培養(yǎng)基添加尿素來進(jìn)行培養(yǎng)，尿素被微生物利用，氨被釋放到培養(yǎng)基中。如果如上所述重復(fù)氨或尿素的添加，培養(yǎng)基的pH值逐漸地增加。每次添加的氨或尿素的量可以是，例如，300mM，優(yōu)選200mM，更優(yōu)選lOOmM，表示為培養(yǎng)基中總氨的終濃度。作為選擇，可以添加氨或尿素，從而在添加氨或尿素之后PH值增加0.3或更少，優(yōu)選0.15或更少，更優(yōu)選0.1或更少。例如,通過使用溶解氧電極,可以測(cè)量培養(yǎng)基中的溶解氧濃度。通過測(cè)量碳酸氫根離子、碳酸根離子和其他陰離子的濃度以及所述堿性物質(zhì)的濃度，可以確認(rèn)全部溶于培養(yǎng)基中的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子以及其他陰離子的離子當(dāng)量的總和是否高于在培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的離子當(dāng)量。此外，通過進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)來測(cè)定滿足上述條件的PH值和/或氨添加量，并在預(yù)先測(cè)定的pH值和/或添加預(yù)先測(cè)定量的氨進(jìn)行培養(yǎng)，也可以滿足以上條件。在本發(fā)明中，培養(yǎng)物的pH值可以是或可以不是恒定的。此外，當(dāng)控制培養(yǎng)基的pH值時(shí)，可以通過使用PH值本身作為指標(biāo)、或間接地通過控制總氨濃度而不直接控制pH值來進(jìn)行控制。此外，如果如上所述使用微生物的活性作為指標(biāo)來添加氨或尿素，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的總氨濃度使它處在合適的濃度范圍之內(nèi)，PH值隨著堿性物質(zhì)的積累逐漸地增加。此外，如果將總氨濃度控制到特定范圍之內(nèi)來進(jìn)行培養(yǎng)，PH值作為培養(yǎng)基中各種陽離子和陰離子的積累平衡變化的結(jié)果而變化。無論選擇哪種方法，作為結(jié)果培養(yǎng)基中的總氨濃度被調(diào)節(jié)到特定濃度范圍之內(nèi)，因而可以降低用作堿性物質(zhì)的反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的量。在本發(fā)明中，表述“不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)”是指用于本發(fā)明的微生物良好地生長(zhǎng)，堿性物質(zhì)順利地產(chǎn)生。當(dāng)微生物的生長(zhǎng)不充分時(shí)，或當(dāng)盡管微生物生長(zhǎng)良好但不能有效產(chǎn)生堿性物質(zhì)時(shí)，認(rèn)為是堿性物質(zhì)的生產(chǎn)被抑制。
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具體地，用于本發(fā)明的微生物被培養(yǎng)在不同pH值水平和總氨濃度的培養(yǎng)基中，測(cè)量培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力，與在最佳條件，例如通常使用的中性pH值的一般條件下可獲得的堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力相比，導(dǎo)致在每種PH值下以優(yōu)選50%或更高、更優(yōu)選70%或更高、特別優(yōu)選90%或更高的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的總氨濃度，被認(rèn)為是“不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)”的濃度。在本發(fā)明中，“生產(chǎn)力”是指產(chǎn)率、生產(chǎn)速度或總生產(chǎn)量?！爱a(chǎn)率”是指基于能被同化的、培養(yǎng)基中存在的碳源，堿性物質(zhì)的生產(chǎn)量，“生產(chǎn)速度”是指每單位時(shí)間的生產(chǎn)量。此外，當(dāng)單獨(dú)地使用術(shù)語“生產(chǎn)量”或“生產(chǎn)的量”時(shí)，是指一旦完全消耗了碳源，在培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的量。作為選擇，在最佳條件下，例如通常使用的中性pH值的一般條件下，培養(yǎng)用于本發(fā)明的微生物，并測(cè)量培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力。然后，在具有相同組成只是硫酸根離子和/或氯離子的量降低了期望的量的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并測(cè)量堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力。在這種情況下，存在一個(gè)時(shí)期，在所述時(shí)期中由于隨著目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累作為反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子不足，培養(yǎng)基的PH值將增加。對(duì)于這個(gè)時(shí)期，將總氨濃度維持到特定濃度范圍之內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于控制濃度的范圍，用I到500mM范圍內(nèi)的各種濃度進(jìn)行培養(yǎng)，將提供了在最佳條件下可獲得的生產(chǎn)力的優(yōu)選50%或更高、更優(yōu)選70%或更高、特別優(yōu)選90%或更高的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的范圍內(nèi)的濃度，確定為“不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)”的濃度。用于上述“通常使用的中性PH值的一般條件”的培養(yǎng)基的實(shí)例包括含有其量足以在pH7.2或更低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子的培養(yǎng)基。硫酸根離子和/或氯離子降低的期望的量沒有具體的限制，只要可以獲得堿性物質(zhì)的目標(biāo)生產(chǎn)力。例如，被定義為“不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)”的總氨濃度也可以如下測(cè)定。將用于本發(fā)明的微生物在培養(yǎng)基的不同PH值水平和總氨濃度下培養(yǎng)，并測(cè)量培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的量。將在各種條件下獲得的堿性物質(zhì)積累量與最佳條件下積累的量進(jìn)行比較。因而，可以確定不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)的總氨濃度。最佳條件被定義為如通常使用的中性PH值的一般條件中的、在中性PH值使用足夠反荷離子的培養(yǎng)條件。此外，例如，用于測(cè)定被定義為“不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)”的總氨濃度的另一種方法如下。將用于本發(fā)明的微生物在最佳條件，例如通常使用的中性PH值的一般條件下培養(yǎng)，并測(cè)量培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力。然后，在具有相同組成只是將硫酸根離子和/或氯離子降低了期望的量的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，檢查生產(chǎn)力。在這種情況下，存在一個(gè)時(shí)期，在所述時(shí)期中由于隨著目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累作為反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子不足，培養(yǎng)基的PH值將增加。對(duì)于這個(gè)時(shí)期，將總氨濃度維持到特定濃度范圍之內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于控制濃度的范圍，用I到500mM范圍內(nèi)的各種濃度進(jìn)行培養(yǎng)，并將由此獲得的生產(chǎn)力與最佳條件下的進(jìn)行比較。被定義為“不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)”的濃度包括，例如，與最佳條件下的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力相比，容許優(yōu)選50%或更高、更優(yōu)選70%或更高、特別優(yōu)選90%或更高的堿性物質(zhì)生產(chǎn)的濃度。具體地，培養(yǎng)基中的總氨濃度是，例如，優(yōu)選300mM或更低、更優(yōu)選200mM或更低、特別優(yōu)選IOOmM或更低。隨著pH值增加，氨解離的程度降低。與銨離子相比，未解離的氨對(duì)于細(xì)菌是更有毒性的。因此，總氨濃度的上限還取決于培養(yǎng)基的PH值。也就是說，當(dāng)培養(yǎng)基的PH值增加時(shí)，可接受的總氨濃度變得更低。因此，對(duì)于上述被定義為“不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)”的總氨濃度，在培養(yǎng)期間對(duì)于最高PH值可接受的總氨濃度范圍可以被看作是整個(gè)培養(yǎng)的總氨濃度范圍。
另一方面，微生物的生長(zhǎng)和堿性物質(zhì)的產(chǎn)生所需的作為氮源的氨總濃度沒有具體的限制，只要微生物提供的目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)力在培養(yǎng)期間不因?yàn)榈床蛔愣档?，而且它可以適當(dāng)?shù)卮_定。例如，在培養(yǎng)期間隨時(shí)間測(cè)量氨濃度，當(dāng)培養(yǎng)基中的氨被耗盡時(shí)，可以將少量氨添加到培養(yǎng)基中。雖然添加氨之后的濃度沒有具體的限制，但就總氨濃度而言，它是，例如，優(yōu)選ImM或更高、更優(yōu)選5mM或更高、特別優(yōu)選IOmM或更高。本發(fā)明的方法可以包括主要用于增殖具有產(chǎn)生堿性物質(zhì)能力的微生物的培養(yǎng)步驟，和主要用于容許微生物產(chǎn)生堿性物質(zhì)的培養(yǎng)步驟。此外，在本發(fā)明的方法中，微生物的增殖和堿性物質(zhì)的生產(chǎn)可以并行地進(jìn)行。此外，除了如上所述的這種培養(yǎng)，其也可被稱為主發(fā)酵、主培養(yǎng)等之外，也可以獨(dú)立地進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。在本發(fā)明中，除了如上所述調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的總氨濃度之外，也可以進(jìn)行促進(jìn)培養(yǎng)基中碳酸氫根離子和/或碳酸根離子溶解的操作。這種操作的實(shí)例包括在培養(yǎng)期間控制發(fā)酵罐中的壓力使得它是正的，向培養(yǎng)基提供二氧化碳?xì)怏w或含有二氧化碳?xì)怏w的混合氣體，限制向發(fā)酵罐中通氣使得碳酸氫根離子和/或碳酸根離子溶于培養(yǎng)基中，通過向培養(yǎng)基添加銨離子以外的陽離子例如鈉離子和鉀離子來提高培養(yǎng)基的PH值，等等。為了使發(fā)酵罐中的壓力為正，例如，可以使供應(yīng)到發(fā)酵罐的空氣壓力比排氣的壓力更高。通過使發(fā)酵罐中的壓力更高，由發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳?xì)怏w溶于培養(yǎng)基中并產(chǎn)生碳酸氫根離子或碳酸根離子。具體地，發(fā)酵罐中的壓力可以是0.13到0.3MPa，優(yōu)選0.15到0.25MPa。此外，通過向培養(yǎng)基提供二氧化碳?xì)怏w或含有二氧化碳?xì)怏w的混合氣體，可將二氧化碳?xì)怏w溶于培養(yǎng)基中。作為選擇，通過限制對(duì)發(fā)酵罐的通氣，由發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳?xì)怏w也可以溶于培養(yǎng)基中。通過，例如，測(cè)量培養(yǎng)基中碳酸氫根離子或碳酸根離子的量、或測(cè)量培養(yǎng)基的PH值和氨濃度，可以確定適合的通氣速率。當(dāng)向培養(yǎng)基提供二氧化碳?xì)怏w時(shí)，例如，可將純二氧化碳?xì)怏w或含有5體積％或更多二氧化碳?xì)怏w的混合氣體鼓泡到培養(yǎng)基中。用于將碳酸氫根離子和/或碳酸根離子溶解到培養(yǎng)基中的上述方法可以獨(dú)立地、或作為兩種或多種的組合來使用。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中總氨濃度的操作，以及如果需要促進(jìn)培養(yǎng)基中碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的溶解的操作，可以在培養(yǎng)過程的總時(shí)期的至少一部分期間進(jìn)行。雖然“總時(shí)期的至少一部分”沒有具體的限制，只要獲得了期望的生產(chǎn)力，但具體地它可以是，例如，主培養(yǎng)的總培養(yǎng)過程的1/10或更多、優(yōu)選1/5或更多。更具體地，所述時(shí)期的實(shí)例包括，由于隨著所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累，反荷離子例如硫酸根離子和/或氯離子的不足引起所述培養(yǎng)基的PH值提高的時(shí)期，或由于添加陽離子而使所述pH值提高的時(shí)期，或這兩個(gè)時(shí)期。本發(fā)明使用的培養(yǎng)基沒有具體的限制，只要通過調(diào)節(jié)總氨濃度的操作至少總氨濃度可以被調(diào)節(jié)到上述范圍之內(nèi)，并且取決于使用的微生物，可以適當(dāng)?shù)厥褂煤杏袡C(jī)和無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物，例如碳源和氮源和其他痕量營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基?？梢允褂萌魏翁荚?，只要它能被所述微生物同化，而實(shí)例包括糖類例如蔗糖、葡萄糖、果糖、糖蜜和淀粉水解物，有機(jī)酸例如乙酸，醇類例如乙醇，和烴類例如甲烷。氮源的實(shí)例包括無機(jī)物例如氨，蛋白水解物，酵母提取物，等等。痕量營(yíng)養(yǎng)物的實(shí)例包括氨基酸，維生素和痕量金屬元素。存在于培養(yǎng)基中除碳酸氫根離子和/或碳酸根離子之外的陰離子的實(shí)例包括氯離子、硫酸根離子、磷酸根離子、離子化的有機(jī)酸、氫氧根離子，等等。這些其他離子的離子當(dāng)量的總和通常是900meq/l或更低，優(yōu)選700meq/l或更低，更優(yōu)選500meq/l或更低，還更優(yōu)選300meq/l或更低，特別優(yōu)選200meq/l或更低。本發(fā)明的目的之一是降低使用的硫酸根離子和/或氯離子的量，硫酸根離子或氯離子的離子當(dāng)量、或培養(yǎng)基中存在的這些離子的離子當(dāng)量的總和通常是700meq/l或更低，優(yōu)選500meq/l或更低，更優(yōu)選300meq/l或更低,還更優(yōu)選200meq/l或更低，特別優(yōu)選IOOmeq/1或更低。發(fā)酵方案沒有具體的限制，并可以是其中不添加培養(yǎng)基的分批培養(yǎng)，其中在加料的糖類被消耗之后進(jìn)料培養(yǎng)基的補(bǔ)料培養(yǎng)，其中當(dāng)培養(yǎng)基的體積超出發(fā)酵罐可接受的體積時(shí)抽取培養(yǎng)基的連續(xù)培養(yǎng)，其中細(xì)菌細(xì)胞再回收的細(xì)胞再循環(huán)方法，等等。培養(yǎng)溫度可以取決于選擇的微生物適當(dāng)?shù)卮_定。其通常是25到45°C，優(yōu)選30到40°C。此外，優(yōu)選充分地?cái)嚢枋沟冒l(fā)酵期間存在充足的氧氣 。例如，具體地如下進(jìn)行用于生產(chǎn)目標(biāo)堿性物質(zhì)的培養(yǎng)。制備含有典型培養(yǎng)基成分的培養(yǎng)基，但是除去部分或者全部的銨鹽，例如硫酸銨和氯化銨。將已經(jīng)單獨(dú)地培養(yǎng)的微生物接種到此培養(yǎng)基中，并將總氨濃度控制到如上述確定的適合于選擇的微生物的范圍之內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。通過使用，例如，商業(yè)上可獲得的離子計(jì)等，可以測(cè)量發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基中或采樣的培養(yǎng)基中的氨濃度。通過使用測(cè)量的值作為指標(biāo)，可以控制總氨濃度。為了將總氨濃度維持在預(yù)定的濃度范圍之內(nèi)，可以向培養(yǎng)基添加氨氣、氨水或尿素。通過使用普通的氨電極測(cè)量來自發(fā)酵罐的排氣中的氨濃度，也可以間接地測(cè)量培養(yǎng)基中的總氨濃度。此外，在本發(fā)明中，如上所述，通過使用培養(yǎng)基的pH值作為指標(biāo)的如下方法，可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的總氨濃度。在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基具有與含有其量足以在pH7.2或更低的條件下維持培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子的培養(yǎng)基相同的成分，只是將硫酸根離子和/或氯離子的量在各個(gè)PH值水平降低了期望的量，其中通過添加氨氣、氨水和尿素的至少一種來改變PH值水平，以及繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)根據(jù)指標(biāo)，例如培養(yǎng)基中溶解氧濃度的變化、培養(yǎng)基中碳源消耗速度的變化、培養(yǎng)基混濁度的變化、培養(yǎng)基中PH值的變化等等，通過向培養(yǎng)基添加氨氣、氨水和尿素的任何一種，在一定時(shí)期內(nèi)以間接的方式維持培養(yǎng)基中的總氨濃度使它在優(yōu)選的濃度范圍之內(nèi)，在所述時(shí)期中由于對(duì)培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的反荷離子的不足而不能將培養(yǎng)基的PH值維持在7.2或更低。通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的堿性物質(zhì)的實(shí)例包括堿性氨基酸，具體地，L-賴氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸。其中，L-賴氨酸是優(yōu)選的。能生產(chǎn)堿性 物質(zhì)的微生物沒有具體的限制，可以選擇任何微生物只要它可以通過發(fā)酵生產(chǎn)堿性物質(zhì)。具體地，優(yōu)選即使在高培養(yǎng)基PH值下，也能在培養(yǎng)基的總氨濃度低的條件下良好地生產(chǎn)堿性物質(zhì)的微生物，。這種微生物的實(shí)例包括屬于棒狀桿菌型細(xì)菌、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙雷氏菌屬(Serratia)或芽孢桿菌屬(Bacillus)。以下將說明棒狀桿菌型細(xì)菌和埃希氏菌屬細(xì)菌，然而，用于本發(fā)明的方法的微生物不限于這些細(xì)菌。用于本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌包括棒桿菌屬(Corynebacterium)細(xì)菌和早先已經(jīng)被分類為短桿菌屬(Brevibacterium)、但已經(jīng)重新分類為棒桿菌屬(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255 (1981))的那些細(xì)菌，并進(jìn)一步包括屬于短桿菌屬的細(xì)菌，其極其接近于棒桿菌屬。具體的實(shí)例包括以下:嗜乙酸乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)燒醇棒桿菌(Corynebacterium alkanolyticum)美棒桿菌(CorynebacteriumcalIunae)谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)百合花棒桿菌(CorynebacteriumIilium)棲糖蜜棒桿菌(Corynebacteriummelassecola)嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)Corynebacterium efficiens力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)二歧短桿菌(Brevibacterium divaricatum)(谷氨酸棒桿菌)
黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)(谷氨酸棒桿菌)Brevibacterium immariophilum乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)(谷氨酸棒桿菌)玫瑰色短桿菌(Brevibacteriumroseum)解糖短桿菌(BrevibacteriumsaccharoIyticum)生硫短桿菌(Brevibacteriumthiogenitalis)產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)白色短桿菌(Brevibacteriumalbum)臘狀短桿菌(Brevibacteriumcerinum)嗜氨微桿菌(Microbacteriumammoniaphilum)具體地，包括如下菌株:嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870 醋谷棒桿菌ATCC15806烷醇棒桿菌ATCC21511美棒桿菌ATCC15991谷氨酸棒桿菌ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060百合花棒桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC15990棲糖蜜棒桿菌ATCC17965嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌AJ12340(FERM BP-1539)力士棒桿菌ATCC13868二歧短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC14020黃色短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13826, ATCC14067Brevibacterium immariophilum ATCC 14068乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13665，ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240產(chǎn)氨短桿菌(產(chǎn)氨棒桿菌)ATCC6871白色短桿菌ATCC15111蠟狀短桿菌ATCC15112嗜氛微桿菌ATCC15354埃希氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括大腸桿菌(Escherichia coli)。當(dāng)使用遺傳工程技術(shù)培育大腸桿菌時(shí)，可以選擇大腸桿菌K12菌株和其衍生物，即大腸桿菌MG1655菌株(ATCCN0.47076)、W3110菌株(ATCC N0.27325)等等。大腸桿菌K12菌株是1922年在斯坦福大學(xué)分離的，并且是λ噬菌體的溶原細(xì)菌。另外，它是具有F因子的多用途菌株，通過接合等等可以構(gòu)建它的遺傳重組體。此外，已經(jīng)確定了大腸桿菌Κ12菌株的基因組序列，該遺傳信息是公眾可獲得的。大腸桿菌Κ12菌株和其衍生物可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，地址:P.0.Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)獲得。能夠生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括S-(2_氨基乙基)半胱氨酸(以下縮寫為“AEC”)抗性突變菌株、需要氨基酸例如L-高絲氨酸用于生長(zhǎng)的突變菌株(特公昭48-28078號(hào)和特公昭56-6499號(hào))、具有對(duì)AEC的抗性并且進(jìn)一步需要氨基酸例如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨酸的突變菌株(美國(guó)專利Nos.3，708，395和3，825，472)、具有對(duì)DL-α -氨基-ε -己內(nèi)酰胺、α -氨基-月桂基內(nèi)酰胺(a-amino-lauryllactam)、天冬氨酸類似物、磺胺藥(sulfa drug)、類醌(quinoid)和N-月桂?；涟彼?N-1auroylleucine)的抗性的生產(chǎn)L-賴氨酸的突變菌株、具有對(duì)草酰乙酸脫羧酶或呼吸道酶抑制物的抗性的生產(chǎn)L-賴氨酸的突變菌株(特開昭
50-53588，特開昭50-31093，特開昭52-102498，特開昭53-9394，特開昭53-86089，特開昭55-9783，特開昭55-9759，特開昭56-32995，特開昭56-39778，特公昭53-43591和特公昭53-1833)、需要環(huán)己六醇(inositol)或乙酸的生產(chǎn)L-賴氨酸的突變菌株(特開昭55-9784和特開昭56-8692)、對(duì)氟丙酮酸(fluoropyruvic acid)或34 或更高的溫度敏感的生產(chǎn)L-賴氨酸的突變菌株(特開昭55-9783和特開昭53-86090)、具有對(duì)乙二醇的抗性的短桿菌屬或棒桿菌屬細(xì)菌的生產(chǎn)L-賴氨酸的突變菌株，等等。

具體實(shí)例包括，例如，乳發(fā)酵短桿菌ATCC 31269、黃色短桿菌ATCC21475和醋谷棒桿菌ATCC 21491菌株。此外，在實(shí)施例中描述的乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869/pVK-C*，plysE菌株也是優(yōu)選的生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌。通過將含有編碼天冬氨酸激酶的基因的質(zhì)粒pVK-C*和含有IysE基因的質(zhì)粒plysE(美國(guó)專利申請(qǐng)N0.2003113899)摻入到ATCC 13869菌株中來獲得這個(gè)菌株，所述天冬氨酸激酶是對(duì)L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制脫敏感的(IysC*)，所述IysE基因與已知促進(jìn)棒桿菌屬細(xì)菌的L-賴氨酸分泌的基因是同源的(國(guó)際專利公開9723597A2)，所述ATCC 13869菌株是乳發(fā)酵短桿菌的野生型菌株。IysC*基因可以從例如生產(chǎn)L-賴氨酸的突變菌株AJ3463(FERM P-1987)(參見特公昭51-34477號(hào)公報(bào))分離，所述菌株是通過誘變ATCC 13869菌株產(chǎn)生的。AJ3463菌株于1973年3月22日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(以前為工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所)(地址:Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi, Ibarak1-ken, 305-8566，日本)，分配的登記號(hào)是FERM P-1987。此外，IysC*基因片段也可以從含有質(zhì)粒P399AK9B的乳發(fā)酵短桿菌AJ12691菌株分離，所述質(zhì)粒含有該基因。AJ12691菌株于1992年4月10日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心，分配的登記號(hào)是FERM P-12918。之后，于1995年2月10日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，分配的登記號(hào)是FERMBP-4999。通過將允許質(zhì)粒在棒桿菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的DNA片段插入質(zhì)粒p399AK9來獲得質(zhì)粒p399AK9B(美國(guó)專利N0.5，766，925)，質(zhì)粒p399AK9是通過將來自AJ3463菌株的IysC插入克隆載體pHSG399來獲得的(參見，Takeshita, S 等，Gene(1987)，61，63-74)。在上述脫敏感的天冬氨酸激酶中，野生型天冬氨酸激酶的α -亞基的位置279處的丙氨酸殘基和亞基的位置30處的丙氨酸殘基各自被替換為蘇氨酸殘基。α-亞基和β-亞基都在IysC基因的相同閱讀框內(nèi)編碼。IysC*基因的核苷酸序列和脫敏感的天冬氨酸激酶的α -亞基的氨基酸序列在序列表中示出，分別為SEQ ID NO:5和6，同一個(gè)基因的核苷酸序列和脫敏感的天冬氨酸激酶的亞基的氨基酸序列分別顯示為SEQ ID NO: 7和8。
使用根據(jù)報(bào)道的核苷酸序列(GenBank登記號(hào)X96471)的引物，例如SEQID NO:3和4所示的引物和棒狀桿菌型細(xì)菌的染色體DNA作為模板，通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，參見White’T.J.等，Trends Genet.，5，185 (1989))可以獲得棒狀桿菌型細(xì)菌的IysE基因。含有谷氨酸棒桿菌IysG和IysE基因(GenBank登記號(hào)X96471)的DNA片段的核苷酸序列在SEQ ID N0:9中示出，由這個(gè)基因編碼的LysE蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO: 10中示出。LysG由相應(yīng)于SEQ ID NO:8中核苷酸編號(hào)1723到2352的互補(bǔ)序列編碼。編碼天冬氨酸激酶的α -亞基、β -亞基和LysE蛋白的DNA包括編碼蛋白的DNA，所述蛋白可以在每個(gè)蛋白中一個(gè)或幾個(gè)位置包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的缺失、取代、插入或添加，只要不喪失所述蛋白的活性。雖然術(shù)語“幾個(gè)”意指的氨基酸殘基數(shù)目可以取決于蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置和種類而變化，對(duì)于每個(gè)蛋白它優(yōu)選為2到30個(gè)、更優(yōu)選2到20個(gè)、特別優(yōu)選2到10個(gè)。這基于以下理由。也就是，由于某些氨基酸相互間是高度同源的，這些氨基酸之中的差異不會(huì)很大地影響蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和活性。因此，每個(gè)蛋白可以是與SEQ ID Ν0:6、8或10的氨基酸殘基具有50%或更高、優(yōu)選70%或更高、更優(yōu)選90%或更高、特別優(yōu)選95%或更高的同源性，并具有天冬氨酸激酶或LysE蛋白的活性的蛋白質(zhì)。如上所述的這種蛋白質(zhì)修飾是維持每個(gè)蛋白活性的保守突變。取代是一種改變，其中氨基酸序列中至少一個(gè)殘基被除去，并在此插入另一個(gè)殘基。被認(rèn)為是保守性取代的氨基酸殘基對(duì)原始氨基酸殘基的取代的實(shí)例包括ser或thr對(duì)ala的取代,gln、his或Iys對(duì) arg 的取代，glu、gln、lys、his 或 asp 對(duì) asn 的取代，asn、glu 或 gin 對(duì) asp 的取代，ser或 ala 對(duì) cys 的取代，asn、glu、Iys、hi S、asp 或 arg 對(duì) gin 的取代，asn、gin、Iys 或 asp 對(duì)glu 的取代，pro 對(duì) gly 的取代，asn、lys、gin、arg 或 tyr 對(duì) his 的取代，leu、met、val 或phe 對(duì) ile 的取代，ile、met、val 或 phe 對(duì) Ieu 的取代，asn、glu、gin、his 或 arg 對(duì) Iys 的取代，ile、leu、val 或 phe 對(duì) met 的取代，trp、tyr、met、ile 或 leu 對(duì) phe 的取代，thr 或ala對(duì)ser的取代，ser或ala對(duì)于thr的取代，phe或tyr對(duì)trp的取代，his、phe或trp對(duì)tyr的取代和met、ile或Ieu對(duì)val的取代。編碼與具有SEQ I D N0:6、8或10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA，可以通過使用例如位點(diǎn)特異性誘變，從而發(fā)生一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加，修飾編碼SEQ ID N0:6、8或10所示氨基酸序列的核苷酸序列來獲得。這種修飾的DNA可以通過用試劑處理或在引起突變的條件下處理以常規(guī)方式來獲得。這種處理的實(shí)例包括用羥胺處理編碼本發(fā)明的蛋白的DNA、紫外線照射含有所述DNA的微生物、用試劑例如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸處理。編碼如上所述這種修飾的蛋白的DNA也可以通過分離DNA來獲得，被分離的DNA能在嚴(yán)格條件下與IysC基因、IysE基因或這些基因的一部分雜交并仍編碼具有天冬氨酸激酶活性或LysE蛋白的活性的蛋白。術(shù)語“嚴(yán)格條件”包括這樣的條件，在這些條件下形成所謂的特異性雜合體(specific hybrid),而不形成非特異性雜合體。嚴(yán)格條件包括,例如，這樣的條件，在這些條件下相互具有高同源性的DNA，例如具有不低于70%、優(yōu)選不低于80 %、更優(yōu)選不低于90 %、特別優(yōu)選不低于95 %的同源性的DNA能夠雜交。嚴(yán)格條件還包括Southern雜交的典型的洗滌條件，例如，在60°C，lxSSC，0.1% SDS，優(yōu)選0.lxSSC,0.1%SDS。
屬于埃希氏菌屬的生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌的實(shí)例包括具有對(duì)L-賴氨酸類似物的抗性的突變體。L-賴氨酸類似物抑制埃希氏菌屬細(xì)菌的生長(zhǎng)，但當(dāng)L-賴氨酸同時(shí)存在于培養(yǎng)基中時(shí)這種抑制完全地或部分地消除了。L-賴氨酸類似物的實(shí)例包括氧代賴氨酸(oxalysine)、賴氨酸氧廂酸(lysine hydroxamate)、(S)_(2_ 氨基乙基)_L_ 半胱氨酸(AEC)、Y-甲基賴氨酸、α -氯己內(nèi)酰胺(a-chlorocaprolactam),等等。具有對(duì)這些賴氨酸類似物的抗性的突變體可以通過使埃希氏菌屬微生物經(jīng)受常規(guī)的人工突變處理來獲得。用于生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌菌株的具體實(shí)例包括大腸桿菌AJ11442(FERM BP-1543,NRRLB-12185 ;參見特開昭56-18596和美國(guó)專利N0.4, 346, 170)和大腸桿菌VL611菌株。AJ11442菌株于1981年5月I日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(以前為工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所)(地址=Tsukuba Central
6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarak1-ken, 305-8566，日本)，分配的登記號(hào)是FERM P-5084。之后，這個(gè)保藏物于1987年10月29日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，分配的登記號(hào)是FERM BP-1543。在這些微生物中，L-賴氨酸的天冬氨酸激酶反饋抑制被脫敏了。此外，例如，除了脫敏的天冬氨酸激酶之外，具有編碼涉及L-賴氨酸生物合成的酶的基因的增強(qiáng)表達(dá)的細(xì)菌也可用作優(yōu)選的生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌。這種酶的實(shí)例包括二氨基庚二酸(diaminopimelate)途徑中涉及的酶，例如二氫吡啶二羧酸合酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氫酶(對(duì)于所有上述的酶，國(guó)際專利公開TO96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(特開昭60-87788)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(特公平6-102028)、二氨基庚二酸表異構(gòu)酶(特開2003-135066)和天冬氨酸半醛脫氫酶(國(guó)際專利公開W000/61723),氨基己二酸途徑中涉及的酶,例如高烏頭酸水合酶(homoaconitatehydratase)(特開 2000-157276)，等等。具有生產(chǎn)L-賴氨酸的能力的大腸桿菌菌株的具體實(shí)例包括大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2 菌株(國(guó)際專利公開 W095/16042)等等。大腸桿菌 W3110 (tyrA) /PCABD2菌株是通過向W3110(tyrA)中導(dǎo)入含有編碼L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)酶的基因的質(zhì)粒PCABD2來獲得的，W3110(tyrA)是大腸桿菌的tyrA缺陷菌株(它被稱為AJ12604，于1991年I月28日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(以前為工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所)(地址:Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarak1-ken, 305-8566，日本)，分配登記號(hào)FERM P-11975，然后該保藏物根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定在1991年9月26日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，分配登記號(hào)FERMBP-3579)。質(zhì)粒PCABD2含有編碼突變二氫吡啶二羧酸合酶的基因，其中位置118的組氨酸殘基被突變?yōu)槔野彼釟埢?，L-賴氨酸的反饋抑制被脫敏，編碼突變天冬氨酸激酶III的基因，其中位置352的蘇氨酸殘基被突變?yōu)楫惲涟彼釟埢?，L-賴氨酸的反饋抑制被脫敏，和編碼二氫吡啶二羧酸還原酶和二氨基庚二酸脫氫酶的基因。此外，可以如下所述獲得大腸桿菌W3110(tyrA)菌株。也就是說，通過將質(zhì)粒導(dǎo)Λ W3110 (tyrA)菌株獲得的許多菌株在歐洲專利公開N0.488424/1992中公開。例如，通過導(dǎo)入質(zhì)粒pHATerm獲得的菌株被稱 為大腸桿菌W3110 (tyrA) /pHATerm菌株,并保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，分配登記號(hào)FERM BP-3653。通過，例如，從大腸桿菌W3110 (tyrA) /pHATerm菌株消除質(zhì)粒pHATerm可以獲得W3110 (tyrA)菌株。質(zhì)粒的消除可以按常規(guī)方式進(jìn)行。此外，WC196菌株(參見國(guó)際專利公開W096/17930)也可以被用作大腸桿菌的生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株。WC196菌株是通過給源自大腸桿菌K-12的W3110菌株賦予AEC (S- (2-氨乙基)半胱氨酸)抗性而培育的。這個(gè)菌株被稱為大腸桿菌AJ13069，并于1994年12月6日保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarak1-ken, 305-8566,日本))，分配的登記號(hào)是FERM P-14690。之后，該保藏物于1995年9月29日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，分配的登記號(hào)是FERM BP-5252。本發(fā)明可以使用的微生物可以具有降低的酶活性，所述酶經(jīng)由作為L(zhǎng)-賴氨酸生物合成途徑的分支的途徑，催化產(chǎn)生除L-賴氨酸外的化合物的反應(yīng)，或是下調(diào)L-賴氨酸生產(chǎn)，或可以在這種酶中有缺陷。在L-賴氨酸生產(chǎn)中，這樣的酶的說明性實(shí)例包括高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(cadA，ldcC)和蘋果酸酶。其中這些酶的活性被降低或有缺陷的菌株在國(guó)際專利公開W095/23864、W096/17930、W02005/010175，等等中描述。為了降低或消除酶的活性，可以通過常規(guī)的誘變方法來突變?nèi)旧w上編碼酶的基因，使得酶的細(xì)胞內(nèi)活性被降低或消除。例如，這可以通過使用遺傳重組消除染色體上編碼酶的這些基因，或修飾表達(dá)控制序列，例如啟動(dòng)子或Shine-Dalgarno(SD)序列來實(shí)現(xiàn)。這也可以通過導(dǎo)入氨基酸取代(錯(cuò)義突變)、導(dǎo)入終止密碼子(無義突變)、添加或缺失染色體上酶的編碼區(qū)中一個(gè)或兩個(gè)核苷酸導(dǎo)入移碼突變，或缺失一部分基因來實(shí)現(xiàn)(Journalof Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997))。也可以通過構(gòu)建編碼突變的酶的基因，其中編碼區(qū)被缺失，并通過同源重組等等用突變的基因取代染色體上的野生型基因，或向基因?qū)朕D(zhuǎn)座子或IS因子，來降低或消除酶的活性。例如，可以采用以下方法來導(dǎo)入突變，所述突變引起上述酶的活性的下降，或通過遺傳重組消除活性。通過修飾目標(biāo)基因的部分序列來制備突變基因，并用含有突變基因的DNA轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌來引起突變基`因和染色體上基因之間的重組，染色體上的目標(biāo)基因可以被取代為不產(chǎn)生正常起作用的酶的突變基因。已經(jīng)建立了使用同源重組基于基因置換(gene substitution)的這種位點(diǎn)特異性誘變,并且已知使用線性DNA的方法、使用含有溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000, vol.97, N0.12, pp.6640-6645;U.S.專利N0.6，303，383;特開平05-007491)等等。此外，如上所述使用同源重組基于基因置換的這種位點(diǎn)特異性誘變也可以用不能在宿主中復(fù)制的質(zhì)粒來進(jìn)行。此外，已經(jīng)被修飾使得L-賴氨酸和L-精氨酸分泌基因ybiE的表達(dá)量提高的微生物也可用于本發(fā)明(國(guó)際專利公開W02005/073390)。屬于沙雷氏菌屬的生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌的實(shí)例包括用編碼二氫吡啶二羧酸合酶的DNA轉(zhuǎn)化的沙雷氏菌屬細(xì)菌，所述二氫吡啶二羧酸合酶具有脫敏化L-賴氨酸反饋抑制的突變，和含有天冬氨酸激酶的沙雷氏菌屬細(xì)菌，所述天冬氨酸激酶是對(duì)L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的(國(guó)際專利公開W096/41871)。生產(chǎn)L-精氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括棒狀桿菌型細(xì)菌的野生型菌株；對(duì)某些試劑包括磺胺藥類、2-噻唑丙氨酸(2-thiazolealanine)、<1-氨基-0-輕基戍酸(a-amino-β-hydroxyvaleric acid)等等有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌；除了對(duì)2_噻唑丙氨酸有抗性之外顯示對(duì)L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷的棒狀桿菌型細(xì)菌(特開昭54-44096);對(duì)酮基丙二酸(ketomalonicacid)、氟丙二酸(fluoromalonic acid)或單氟乙酸(monofluoroacetic acid)有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌(特開昭57-18989);對(duì)argininol有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌(特開昭62-24075);對(duì)X-胍有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌(X代表脂肪酸或脂肪族鏈的衍生物，特開平2-186995)等等。此外，在L-精氨酸抑制物方面有缺陷的棒狀桿菌型細(xì)菌(美國(guó)專利申請(qǐng)N0.20020045233)，和具有提高的谷氨酸脫氫酶活性的棒狀桿菌型細(xì)菌(歐洲專利申請(qǐng)公開1057893)也是用于L-精氨酸生產(chǎn)的合適的菌株。
具體地，實(shí)例包括黃色短桿菌AJl 1169 (FERM BP-6892)、谷氨酸棒桿菌AJ12092(FERM BP-6906)、黃色短桿菌 AJl 1336 (FERM BP-6893)、黃色短桿菌 AJl 1345 (FERMBP-6894)和乳發(fā)酵短桿菌 AJ12430(FERM BP-2228)菌株。AJl1169 和 AJ12092 菌株對(duì)2-噻唑丙氨酸有抗性(特開昭54-44096)。AJ11336菌株對(duì)argininol和磺胺嘧啶(sulfadiazine)有抗性(日本專利公開 N0.62-24075)。AJ11345 菌株對(duì) arginino、2_ 噻唑丙氨酸和磺胺胍有抗性，且對(duì)組氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的(特公昭62-24075)。AJ12430菌株對(duì)辛基胍(octylguanidine)和2_噻唑丙氨酸有抗性(特開平2-186995)。谷氨酸棒桿菌AJ12092于1994年12月6日保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(Tsukuba Central
6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarak1-ken, 305-8566,日本)，分配的登記號(hào)是FERM P-12092。之后，該保藏物于1999年10月I日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，分配的登記號(hào)是FERMBP-6906。能生產(chǎn)L-精氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括用argA基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(參見特開昭57-5693)和大腸桿菌菌株237 (俄國(guó)專利申請(qǐng)N0.2000117677)，其是能夠同化乙酸的突變菌株的生產(chǎn)L-精氨酸的衍生物。237菌株于2000年4月10日保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika(地址=Russia, 117545, Moscow, IDorozhnyproezd, I)，分配編號(hào)VKPM B-7925。該保藏物于2001年5月18日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。大腸桿菌菌株382是對(duì)L-精氨酸的反饋抑制有抗性的突變體(特開2002-017342號(hào)公報(bào))，其是237菌株的衍生物，而且也可以采用。大腸桿菌菌株382于2000年4月10日以編號(hào)VKPM B-7926保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，于2001年5月18日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。能生產(chǎn)L-精氨酸的沙雷氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens),其不能分解L-精氨酸并對(duì)精氨酸拮抗劑和刀豆氨酸(canavanine)有抗性，并且對(duì)賴氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的(參見日本專利Laid-open N0.52-8729)。能生產(chǎn)L-組氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括屬于短桿菌屬對(duì)硫胺素拮抗劑有抗性的微生物，具體地，乳發(fā)酵短桿菌FERM P-2170, FERM P-2316、FERM P-6478、FERMP-6479、FERM P-6480和FERM P-6481菌株(特開昭59-63194)。此外，實(shí)例包括屬于短桿菌屬或棒桿菌屬的突變菌株，其對(duì)聚酮化合物(polyketides)有抗性和L-組氨酸生產(chǎn)能力，具體地，F(xiàn)ERM P-416UFERM P-7273.FERM P-837UFERM P-8372 和 ATCC 14067 菌株。能生產(chǎn)L-組氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括屬于埃希氏菌屬對(duì)組氨酸類似物有抗性的突變菌株，例如，大腸桿菌R-344菌株，和用分離自菌株R-344的L-組氨酸合成系統(tǒng)酶基因轉(zhuǎn)化的埃希氏菌屬細(xì)菌。具體地，實(shí)例包括大腸桿菌NRRL-12116、NRRL-12118、NRRL-12119、NRRL-12120 和 NRRL-12121 菌株(特開昭 56-5099)。能生產(chǎn)L-組氨酸的芽孢桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括屬于芽孢桿菌屬對(duì)組氨酸類似物有抗性的突變菌株，和用從這些突變菌株獲得的基因轉(zhuǎn)化的芽孢桿菌屬細(xì)菌，所述基因涉及對(duì)組氨酸拮抗劑的抗性。具體地，實(shí)例包括FERMBP-218、FERM BP-224和FERM BP-219菌株(特開昭58-107192)。含有通過本發(fā)明獲得的堿性物質(zhì)的發(fā)酵液或其處理物將含有碳酸根離子或碳酸氫根離子作為離解的堿性物質(zhì)的反荷陰離子。當(dāng)培養(yǎng)基被加熱或濃縮時(shí)，或如果培養(yǎng)基的PH值通過添加強(qiáng)酸例如鹽酸被降低時(shí)，這些碳酸根離子或碳酸氫根離子作為二氧化碳?xì)怏w逸出。在發(fā)酵液或發(fā)酵產(chǎn)物中的固體成分之中堿性物質(zhì)的相對(duì)量因而被提高。根據(jù)本發(fā)明，通過使用碳酸氫根離子、碳酸根離子等來代替氯離子和硫酸根離子，氯離子的量可以甚至降低到不引起設(shè)備腐蝕的水平，或可以減少硫酸根離子。此外，在發(fā)酵之后，僅通過向培養(yǎng)基添加鹽酸，碳酸氫根離子和碳酸根離子可以被氯離子取代，僅通過進(jìn)一步濃縮培養(yǎng)基而不使用離子交換可以獲得賴氨酸鹽酸鹽，并進(jìn)一步，可以直接分離賴氨酸鹽酸鹽的晶體。在本發(fā)明中，“發(fā)酵產(chǎn)物”包括從發(fā)酵液獲得的濃縮物和干燥產(chǎn)物，和通過加工發(fā)酵液或其干燥產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。
實(shí)施例以下，將參考如下實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明。實(shí)施例1:生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌的構(gòu)建將編碼脫敏的天冬氨酸激酶的基因和編碼賴氨酸分泌因子的基因?qū)胍吧魻顥U菌型細(xì)菌來制備生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌。(I)獲取編碼脫敏的天冬氨酸激酶的基因通過PCR從生產(chǎn)L-賴氨酸的突變菌株AJ3463 (FERM P-1987，參見特公昭
51-34477)來分離編碼對(duì)L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制脫敏的天冬氨酸激酶(Ask*)的基因(IysC*)，所述生產(chǎn)L-賴氨酸的突變菌株AJ3463通過誘變?cè)醋怨劝彼岚魲U菌(乳發(fā)酵短桿菌)ATCC 13869。在CM-Dex培養(yǎng)基中培養(yǎng)AJ3463菌株，通過一般方法從獲得的細(xì)胞提取染色體DNA (Biochem.Biophys.Acta.，72，619-629 (1963))。通過使用這個(gè)染色體 DNA 作為模板，用在目標(biāo)DNA片段的5’末端導(dǎo)入限制性酶BamHI位點(diǎn)的寡核苷酸ASK-F (SEQ ID NO:1)和在目標(biāo)DNA片段的3’末端導(dǎo)入限制性酶KpnI位點(diǎn)的寡核苷酸ASK-R(SEQ ID NO: 2)作為PCR的引物，擴(kuò)增含有作為目標(biāo)基因的IysC*基因的DNA片段。為了擴(kuò)增，將由98°C 10秒的變性步驟、55°C 30秒的退火步驟、72°C 2分鐘的延伸步驟組成的循環(huán)重復(fù)25次。根據(jù)廠家的說明書使用酶，Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)。通過苯酚/氯仿處理和乙醇沉淀來純化擴(kuò)增的DNA片段，然后用限制性酶BamHI和KpnI消化。通過瓊脂糖凝膠電泳展開(develop)獲得的反應(yīng)混合物,切下含有IysO基因的條帶，通過常規(guī)方法純化基因片段。大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的穿梭載體pVK7(參見美國(guó)專利N0.6，004, 773)按類似的方式單獨(dú)地用限制性酶BamHI和KpnI處理， 并連接到上述IysC*片段。根據(jù)廠家的規(guī)程用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo)的感受態(tài)細(xì)胞,選擇幾個(gè)卡那
霉素抗性菌落。通過將乳發(fā)酵短桿菌的隱蔽性質(zhì)粒(cryptic plasmid)pAM330連接到大腸桿菌的載體 pHSG299(Kmr,參見 Takeshita, S.等，Gene, 61，63-74，(1987))來構(gòu)建 pVK7 如下(參見特開平11-266881，國(guó)際專利公開W099/07853)。從乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869菌株制備PAM330。用Avail (Takara Shuzo)消化pHSG299，其已經(jīng)用T4DNA聚合酶平端化(blunt-ended),然后用HindIII (Takara Shuzo)消化,并連接到用T4DNA聚合酶平端化的PAM330。因而，獲得pVK7。pVK7可在大腸桿菌和乳發(fā)酵短桿菌的細(xì)胞中自主復(fù)制，并含有來自pHSG299的多克隆位點(diǎn)、lacZ’和卡那霉素抗性基因作為標(biāo)記物。按常規(guī)方式從如上所述獲得的卡那霉素抗性菌落提取質(zhì)粒DNA，將含有目標(biāo)IysC*基因的質(zhì)粒稱為pVK-C*。(2)獲取編碼賴氨酸分泌因子IysE的基因通過使用來自乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體DNA作為模板，通過PCR分離IysE基因(參見美國(guó)專利申請(qǐng)N0.2003113899)。已知IysE基因在棒桿菌屬細(xì)菌中起作用來促進(jìn)L-賴氨酸的分泌(國(guó)際專利公開9723597A2)。按與上述相同的方式制備菌株的染色體DNA。將LysE-F(SEQ ID NO:3)和 LysE-R(SEQ ID NO:4)用作引物。使用 Pyrobest(Takara Shuzo)用94°C的熱處理90秒并將以下循環(huán)重復(fù)30次來進(jìn)行PCR:94°C變性20秒，55°C退火30秒和72°C延伸反應(yīng)60秒。然后在72°C溫育反應(yīng)10分鐘。通過這個(gè)反應(yīng)獲得了預(yù)計(jì)大小的DNA片段。純化這個(gè)DNA片段，然后根據(jù)廠家的規(guī)程克隆到克隆載體pCR2.1 (Invitrogene)中。根據(jù)廠家的規(guī)程用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo)的感受態(tài)細(xì)胞,并選擇幾個(gè)氨節(jié)青霉素抗性菌落。從這些菌落提取質(zhì)粒DNA，并將具有期望結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒稱為pCRlysE。然后，用限制性酶BamHI和XbaI消化pCRlysE，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來獲得含有IysE基因的片段。將大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的穿梭載體pKC(參見美國(guó)專利申請(qǐng)N0.2003113899)按類似的方式單獨(dú)用限制性酶BamHI和XbaI處理，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來獲得含有氯霉素抗性基因的基因片段。純化這個(gè)基因，然后連接到上述IysE片段。通過使用這個(gè)連接反應(yīng)混合物，根據(jù)廠家的規(guī)程轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo)的感受態(tài)細(xì)胞，并選擇幾個(gè)氯霉素抗性菌落。從如上所述獲得的菌落制備質(zhì)粒以獲得LysE表達(dá)質(zhì)粒plysE。如下制備pKC4。具有源自已經(jīng)獲得的質(zhì)粒PHM1519的復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒pHK4(參見特開平5-7491)，該復(fù)制起點(diǎn)可在棒狀桿菌型細(xì)菌中自主復(fù)制(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903 (1984))，用限制性酶BamHI和KpnI消化來獲得含有復(fù)制起點(diǎn)的基因片段。用DNA Blunting試劑盒(Takara Shuzo)將獲得的片段平端化,通過使用KpnI接頭(Takara Shuzo)的連接來插入pHSG399 (Takara Shuzo)的KpnI位點(diǎn)。根據(jù)廠家的規(guī)程用這個(gè)連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo)的感受態(tài)細(xì)胞,選擇幾個(gè)氯霉素抗性菌落。從如上所 述獲得的菌落制備質(zhì)粒來獲得PKC4。(3)構(gòu)建生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌以上描述的兩個(gè)質(zhì)粒pVK-C*和plysE通過電穿孔導(dǎo)入乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869菌株。通過使用Gene Pulser (BIO-RAD)進(jìn)行電穿孔。電轉(zhuǎn)杯中電極之間的距離是0.1cm,電脈沖施加條件是25 μ F、200 Ω和1.8kV。在含有5 μ g/1氯霉素和25 μ g/1卡那霉素的CM-Dex瓊脂平板(培養(yǎng)基的組成參見下文)上選擇含有質(zhì)粒的菌株。將含有質(zhì)粒的菌株在含有5 μ g/1氯霉素和25 μ g/1卡那霉素的CM-Dex液體培養(yǎng)基中在31.5°C搖動(dòng)培養(yǎng)過夜。在3ml培養(yǎng)基中在試管中搖動(dòng)進(jìn)行培養(yǎng)。如下制備CM-Dex培養(yǎng)基?；旌媳鞩中列出的所有成分，用KOH調(diào)節(jié)到pH 7.5，然后通過高壓蒸鍋在120°C滅菌20分鐘。在瓊脂培養(yǎng)基中，瓊脂添加到20g/L的終濃度。表1:CM-Dex培養(yǎng)基的成分(每1L)
權(quán)利要求
1.種通過發(fā)酵來生產(chǎn)堿性氨基酸的方法，包括在發(fā)酵罐中含有的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)所述堿性氨基酸的能力的微生物，從而在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累所述堿性氨基酸，其中在所述培養(yǎng)過程的總時(shí)期的至少一部分期間通過將所述培養(yǎng)基中所述總氨濃度調(diào)節(jié)到特定濃度范圍之內(nèi)，來降低用作所述堿性氨基酸的反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的量，其中所述總時(shí)期的至少一部分包括下列中的至少一個(gè):由于所述目標(biāo)堿性氨基酸的積累引起的反荷離子的不足而使所述培養(yǎng)基的PH值提高的時(shí)期，和由于向所述培養(yǎng)基添加陽離子而使所述PH值提高的時(shí)期。
2.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述總氨濃度的特定濃度范圍是滿足以下條件的范圍: (A)所述培養(yǎng)基中銨離子的濃度是這樣的水平，使得溶于所述培養(yǎng)基中的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子以及其他陰離子的離子當(dāng)量的總和大于所述培養(yǎng)基中積累的所述堿性氨基酸中電離的所述堿性氨基酸的離子當(dāng)量，以及 (B)所述培養(yǎng)基中所述總氨濃度是不抑制所述微生物的堿性氨基酸生產(chǎn)的水平，其是如下預(yù)先確定的: 在具有不同PH值和不同總氨濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，測(cè)量每個(gè)pH值和每個(gè)總氨濃度下的所述堿性氨基酸的生產(chǎn)力，確定各個(gè)PH值條件下提供最佳條件下的堿性氨基酸生產(chǎn)力的50%或更高的堿性氨基酸生產(chǎn)力的總氨濃度。
3.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述總氨濃度的特定濃度范圍是如下預(yù)先測(cè)定的: (A’ )在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有其量足以在pH 7.2或更低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子 作為所述目標(biāo)堿性氨基酸的反荷離子的來源，通過添加氨氣、氨水和尿素的至少一種來將所述培養(yǎng)基的PH值維持在6.5到7.2之間的范圍內(nèi)，并測(cè)量所述堿性氨基酸的生產(chǎn)力， (B’)在與步驟(A’)中使用的培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)，只是培養(yǎng)基成分的硫酸根離子和/或氯離子降低期望的量，在一定時(shí)期內(nèi)用不同的總氨濃度繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，在所述時(shí)期內(nèi)由于所述目標(biāo)堿性氨基酸的積累引起的作為堿性氨基酸反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的不足，維持所述培養(yǎng)基的PH值到7.2或更低變得不可能，以根據(jù)步驟(A’ )中測(cè)量的生產(chǎn)力來確定提供了 50%或更高生產(chǎn)力的總氨濃度范圍。
4.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)根據(jù)如下指標(biāo)所測(cè)定的所述微生物的活性降低或停止時(shí)，通過向所述培養(yǎng)基添加氨或尿素來調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基中的總氨濃度，所述指標(biāo)是:所述培養(yǎng)基中溶解的氧濃度、所述培養(yǎng)基中碳源的消耗率、所述培養(yǎng)基的混濁度、所述堿性氨基酸的生產(chǎn)力、和所述培養(yǎng)基中的pH值變化。
5.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將與含有其量足以在pH值7.2或更低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子作為所述堿性氨基酸的反荷離子來源的培養(yǎng)基具有相同組分、只是將硫酸根離子和/或氯離子降低期望的量的培養(yǎng)基用作培養(yǎng)基，以及 所述總時(shí)期的至少一部分是一個(gè)時(shí)期，在所述時(shí)期中由于所述培養(yǎng)基中積累的堿性氨基酸引起的反荷離子不足，所述培養(yǎng)基的PH值不能被維持在7.2或更低。
6.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述其他陰離子選自硫酸根離子、氯離子、磷酸根離子和電離的有機(jī)酸。
7.據(jù)權(quán)利要求2或6的方法，其中所述其他陰離子的總量是900meq/l或更低。
8.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中的所述總氨濃度被調(diào)節(jié)到300mM或更低。
9.據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述培養(yǎng)基中的所述總氨濃度被調(diào)節(jié)到200mM或更低。
10.據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其中所述培養(yǎng)基中的所述總氨濃度被調(diào)節(jié)到IOOmM或更低。
11.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括增殖所述微生物的步驟。
12.據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中在增殖所述微生物的所述步驟期間不調(diào)節(jié)所述總氨濃度。
13.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述堿性氨基酸選自L-賴氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸。
14.據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述堿性氨基酸是L-賴氨酸。
15.據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述堿性氨基酸是L-精氨酸。
16.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基或其處理物在發(fā)酵之后被加熱以除去碳酸氫根離子和碳酸根離子。
17.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是棒狀桿菌型細(xì)菌或大腸桿菌。
18.據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，所述發(fā)酵產(chǎn)物包括從發(fā)酵液獲得的濃縮物和干燥產(chǎn)物，和通過加工發(fā)酵液或其干燥產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。
19.有堿性氨基酸的發(fā)酵 液或發(fā)酵產(chǎn)物，其可以通過根據(jù)權(quán)利要求16的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過發(fā)酵來生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法，包括在發(fā)酵罐中含有的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)所述堿性物質(zhì)的能力的微生物，從而在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累所述堿性物質(zhì)，其中在培養(yǎng)過程的總時(shí)期的至少一部分期間通過將所述培養(yǎng)基中總氨濃度調(diào)節(jié)到特定濃度范圍之內(nèi)，來降低用作所述堿性物質(zhì)的反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的量。
文檔編號(hào)C12P13/10GK103088080SQ201210148568
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2005年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月7日
發(fā)明者竹下亮, 杉本慎一 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社