專利名稱：HGF基因的Poly A重復單元數目突變多態(tài)性檢測用探針及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測HGF(hepatocyte growth factor :肝細胞生長因子)基因的啟動子區(qū)域中的poly A重復單元數目的突變的多態(tài)性的探針及其用 途。
背景技術：
乳腺癌是發(fā)生于乳房組織的癌。是世界上常見的癌癥，在西方國家中大約10%的女性一生中有罹患乳腺癌的機會。另外，大約20%的乳腺癌女性患者由于該疾病而死亡。因此，為了實現腫瘤的早期發(fā)現方法以及有效的治療方法而耗費著巨大的勞動力。近年，已知乳腺癌的發(fā)病風險與HGF基因的啟動子區(qū)域中的poly A重復單元數目的突變相關聯。具體地，在HGF基因的啟動子區(qū)域的polyA重復單元數目為正常型30時與poly A重復單元數目發(fā)生縮短突變(例如，變?yōu)?5或25以下)吋，乳腺癌的發(fā)病風險不同(Jihong Ma,et ai. ，2009，bomatic mutation and functional polymorphism oi a novelregulatoryelement in the HGF gene promoter causes its aberrant expression inhumanbreast cancer. 、The Journal of Clinical Investigation Volume 119Number 3.，478-491)o作為HGF基因的poly A重復單元數目的突變檢測方法的示例，有直接測序法(direct sequencing)以及用電泳檢測的方法。但是,例如,在判別poly A重復單元數目為30和25以下時的A的重復數的差異時，直接測序法中測定相同堿基的連續(xù)序列時波形雜舌し難以確定正確的堿基序列。另外，即使使用電泳，也難以判別多個堿基(例如，30和25以下)的差別，難以正確判斷是正常型還是突變型。另ー方面，近年來的基因多態(tài)性的檢測方法中，使用著利用了熔解曲線分析(Tm分析)的檢測方法。該方法為如下方法使用與含有檢測目標基因多態(tài)性的檢測靶標序列互補的探針，形成檢測試樣的靶標單鏈DNA與該探針的雜交體(雙鏈DNA)，對該雜交體實施加熱處理，通過吸光度或熒光強度等的信號測定來檢測隨著溫度上升的雜交體解離(熔解)，基于該檢測結果確定Tm值(°C)，從而判斷目標多態(tài)性的有無。雜交體的同源性的越高則Tm值越高，同源性越低則Tm值越低。因此，對含有目標多態(tài)性的檢測靶標序列和與其互補的探針的雜交體預先求得Tm值CC )(評價標準值)，測定檢測試樣的靶標單鏈DNA和該探針的Tm值(°C )，若該測定值與評價標準值相同，則可以判斷為完全匹配，即靶標DNA中存在目標多態(tài)性，若該測定值低于評價基準值，則可以判斷為錯配，即靶標DNA中不存在目標多態(tài)性。此外，日本專利文獻特表2007-510154號公報中，記載了以下所示的E. coli 16SrRNA-特異性補充(補足)探針、以及E. coli 16S rRNA-特異性檢測補充探針(序列編號I和序列編號2)。但是，這些探針只有最多14個A。另外，A重復的部分必須位于探針的序列的端部。因此，不僅不能檢測poly A重復單元數目為15個以上的突變型的情況，也不能檢測其他的堿基夾著的HGF基因的啟動子區(qū)域的poly A重復單元的突變型的情況。
序列編號I5’ -GCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTCAAAAAAAAAAAAAA-3，序列編號25， -AAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3，

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，提供能夠正確地判別HGF基因的啟動子區(qū)域的poly A重復單元數目突變的多態(tài)性檢測用探針、使用該多態(tài)性檢測用探針的HGF基因的多態(tài)性檢測方法、利用該多態(tài)性檢測方法的藥劑的評價方法、以及含有該多態(tài)性檢測用探針的HGF基因的多態(tài)性檢測用試劑盒。 本發(fā)明人發(fā)現通過設計能夠正確地判別HGF基因的啟動子區(qū)域的poly A重復單元數目突變的多態(tài)性檢測用探針，并使用該多態(tài)性檢測用探針進行Tm分析，能夠更準確地檢測該poly A重復單元數目突變的多態(tài)性，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明如下所述。〈I〉. 一種多態(tài)性檢測用探針，其是用于檢測HGF基因的多態(tài)性的探針，其特征在于，其由從下述(Pl-I)、(Pl-2)、(P1’ -I)、(P1’ -2)、(P2-1)、(P2-2)、(P2，-I)、(P2，-2)、(P3-1)、(P3-2)、(P3’ -I)和(P3’ -2)中選擇的至少ー種熒光標記寡核苷酸構成(Pl-I)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95 100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號95 100的3’末端和所述堿基編號132之間的I 31個堿基中任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為8 94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于與序列編號3互補的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述與堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記；(P1-2)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95 100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號95 100的3’末端和所述堿基編號132之間的I 31個堿基中任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為8 94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，與序列編號3的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述與堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記；(P1’ -I)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95 100以及由夾在所述堿基編號95 100的3’末端和堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為7 55個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于與序列編號3互補的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述與堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記；(P1’ -2)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95 100以及由夾在所述堿基編號95 100的3’末端和堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為7 55個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，與序列編號3的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述與堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記；(P2-1)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號92 100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號92 100的3’末端和所述堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為11 94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于與序列編號3互補的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述與喊基編號92對應的喊基用熒光染料標記；(P2-2)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號92 100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號92 100的3’末端和所述堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為11 94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶的條件下、與序列編號3的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述與堿基編號92對應的堿基用熒光染料標記；(P2’ -I)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號92 100以及由夾在所述堿基編號92 100的3’末端和堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為10 55個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶的條件下、相對于與序列編號3互補的 堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述與堿基編號92對應的堿基用熒光染料標記；(P2’ -2)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號92 100以及由夾在所述堿基編號92 100的3’末端和堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為10 55個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶的條件下，與序列編號3的堿基序列在嚴謹條件下雜交，與所述堿基編號92對應的堿基用熒光染料標記；(P3-1)熒光標記寡核苷酸，其為8 120個堿基長的堿基序列，且含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號100、堿基編號132 134、以及由夾在所述堿基編號100和所述堿基編號132 134的5’末端之間的4 31之間任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列，其在堿基編號134的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于序列編號3的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述堿基編號134的堿基用熒光染料標記；(P3-2)熒光標記寡核苷酸，其為8 120個堿基長的堿基序列，且含有序列編號3所不的喊基序列的喊基編號100、喊基編號132 134、以及由夾在所述喊基編號100和所述堿基編號132 134的5’末端之間的4 31之間任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列其，其在堿基編號134的堿基為胞嘧啶的條件下，和與序列編號3互補的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述堿基編號134的堿基用熒光染料標記；(P3’ -I)熒光標記寡核苷酸，其為8 56個堿基長的堿基序列，且含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號132 134以及由夾在堿基編號100和所述堿基編號132 134的5’末端之間的5 31之間任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列，其在堿基編號134的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于序列編號3的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述堿基編號134的堿基用熒光染料標記；(P3’ -2)熒光標記寡核苷酸，其為8 56個堿基長的堿基序列，且含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號132 134以及由夾在堿基編號100和所述堿基編號132 134的5’末端之間的5 31之間任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列，其在堿基編號134的堿基為胞嘧啶的條件下，和與序列編號3互補的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述堿基編號134的堿基用熒光染料標記?！?〉.根據〈1>所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在干，所述(Pl-I)、所述(P1-2)、所述(Pr -I)和所述(Pr -2)熒光標記寡核苷酸在從3’末端起數第I 3位的位置具有用熒光染料標記的、所述與堿基編號95對應的堿基；所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’ -I)和所述(P2’ _2)熒光標記寡核苷酸在從3’末端起數第I 3位的位置具有用熒光染料標記的、所述與堿基編號92對應的堿基；所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’ -I)和所述(P3’ _2)熒光標記寡核苷酸在從3’末端起數第I 3位的位置具有用熒光染料標記的、所述堿基編號134的堿基?！?〉.根據〈1>所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，所述(Pl-I)、所述(P1-2)、所述(pr -D和所述(Pr -2)熒光標記寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標記的、所述與堿基編號95對應的堿基；所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’_l)和所述(P2’_2)熒光標記寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標記的、所述與堿基編號92對應的堿基；所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’_l)和所述(P3’_2)熒光標記寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標記的、所述堿基編號134的堿基?！?〉.根據〈1> 〈3>中任意一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，所述熒光 標記寡核苷酸在未與靶標序列雜交時發(fā)出熒光，并且在與所述靶標序列雜交時熒光強度減少或增加?！?〉.根據〈4>所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在干，所述熒光標記寡核苷酸在未與靶標序列雜交時發(fā)出熒光，并且在與所述靶標序列雜交時熒光強度減少?！?〉.根據〈1> 〈5>中任意一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，所述(Pl-I)或所述(P1-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為27 57 ;所述(P1’ -I)或所述(P1’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為22 52 ;所述(P2-1)或所述(P2-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為32 62 ;所述(P2’ -I)或所述(P2’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為22 52 ;所述(P3-1)或所述(P3-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為30 60 ;所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為19 49?！?〉.根據〈1> 〈6>中任意一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在干，所述(Pl-I)或所述(P1-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為32 52 ;所述(P1’ -I)或所述(P1’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為27 47 ;所述(P2-1)或所述(P2-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為37 57 ;所述(P2’ -I)或所述(P2’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為27 47 ;所述(P3-1)或所述(P3-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為35 55 ;所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為24 44。〈8〉.根據〈1> 〈7>中任意一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，所述(Pl-I)或所述(P1-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為37 47 ;所述(P1’ -I)或所述(Pr -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為32 42 ;所述(P2-1)或所述(P2-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為42 52 ;
所述(P2’ -I)或所述(P2’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為32 42 ;所述(P3-1)或所述(P3-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為40 50 ;所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為29 39?！?〉.根據〈1> 〈8>中任意一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，所述多態(tài)性檢測用探針為用于熔解曲線分析的探針?！?0〉. ー種HGF基因的多態(tài)性檢測方法，其特征在于，使用〈1> 〈9>中任意ー項所述的多態(tài)性檢測用探針。〈11〉.根據〈10>所述的HGF基因 的多態(tài)性檢測方法，其特征在于，包括(I)使〈1>至〈9>中任意一項所述的多態(tài)性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，獲得所述熒光標記寡核苷酸和所述單鏈核酸的雜交體的步驟；(II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度，使所述雜交體解離，測定基于所述雜交體的解離的熒光信號的變動的步驟；(III)基于所述熒光信號的變動，評價所述雜交體的解離溫度即Tm值的步驟；以及(IV)基于所述Tm值，檢測HGF基因中的多態(tài)性的存在的步驟?！?2〉.根據〈11>所述的HGF基因的多態(tài)性檢測方法，其特征在于，還包括在所述(I)的獲得雜交體之前或者與所述(I)的獲得雜交體同時擴增核酸的步驟?！?3〉. 一種藥劑的評價方法，其特征在于，包括(I)通過〈10>至〈12>中任意一項所述的HGF基因的多態(tài)性檢測方法，來檢測HGF基因的多態(tài)性的步驟；(II)基于檢測到的多態(tài)性的有無，來評價針對藥劑的耐受性或藥劑的藥效的步驟?！?4〉. HGF基因的多態(tài)性檢測用試劑盒，其特征在于，包括〈1> 〈9>中任意ー項所述的多態(tài)性檢測用探針?！?5〉.根據〈14>所述的HGF基因的多態(tài)性檢測用試劑盒，其特征在于，還包括能夠以含有與所述(pi-i)、所述(pi-2)、所述(Pr -I)、所述(pr -2)、所述(P2-i)、所述(P2-2)、所述(P2’ -I)、所述(P2’ -2)、所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)熒光標記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域為模板進行擴增的引物。


圖I為示出實施例I涉及的通過3T-HGF-WT-F1探針進行的Tm分析的結果的圖。圖2為示出實施例2涉及的通過3T-HGF-WT-F3探針進行的Tm分析的結果的圖。圖3為示出實施例3涉及的通過3T-HGF-WT-R1探針進行的Tm分析的結果的圖。圖4為示出比較例涉及的通過3T-HGF-WT-F2探針進行的Tm分析的結果的圖。圖5為示出實施例4涉及的通過3T-HGF-WT-R1探針進行的Tm分析的結果的圖。
具體實施例方式在本發(fā)明中，檢測的目標的多態(tài)性基本上是指HGF基因中的啟動子區(qū)域的poly A重復單元數目突變。在美國國立生物技術信息中心(National Center for BiotechnologyInformation (NCBI))登錄號 NT_007933. 15 (Homo sapiens chromosome 7genomic contig,GRCh37. p2reference primary assembly)中作為部分序列登錄了本發(fā)明中的HGF基因的細節(jié)。本發(fā)明中的“堿基編號”是指作為該部分序列的序列編號3所示的堿基序列的、從5’末端起向3’末端方向數的對應堿基的編號，即堿基編號I 堿基編號249。此外，該堿基編號I 堿基編號249的堿基序列對應于前述的登錄號NT_007933. 15中登錄的77412220bp的全堿基序列的第1943861位的堿基 第19433101位的堿基的部分序列。人的HGF基因中的啟動子區(qū)域的poly A重復單元數目若為正常型則是30 (31)，若為突變型則是0(1) 29 (30)。本發(fā)明中的“ poly A重復單元數目突變”是指基因處于這樣的突變型的情況。本發(fā)明的poly A重復單元數目中，例如在表示為30(31)的情況下，“30”’表示序列編號3的堿基序列所示的HGF基因中的啟動子區(qū)域的poly A重復單元數目、即堿基編號102 131的T(或與T互補的A)的數目，“(31)”是指序列編號3所示的堿基序列中，將前述啟動子區(qū)域的poly A重復序列的5’末端側上連接的T也包括在內的、堿基編號101 131的T(或與T互補的A)的數目。
在本發(fā)明中，作為檢測對象的試樣中的單鏈核酸、多態(tài)性檢測用探針或引物的每個的序列，基于這些序列的互補關系的事項，只要不特別指出，也適用于和該各序列互補的序列。在將本發(fā)明的事項適用干與各序列互補的對應序列吋，由該互補的序列識別的序列，視為將說明書全體替換為與對應的本說明書中記載的序列互補的序列。該適用是在本領域技術人員的技術常識的范圍內進行替換。在本發(fā)明中，“Tm值”是指雙鏈核酸解離的溫度(解離溫度Tm)，一般定義為260nm處的吸光度達到吸光度總上升量的50%時的溫度。例如，當加熱含有雙鏈DNA的溶液吋，260nm處的吸光度上升。這是因為雙鏈DNA中的兩條鏈之間的氫鍵由于加熱而斷裂，解離成單鏈DNA(DNA的熔解)。并且，全部雙鏈DNA解離成單鏈DNA時，其吸光度顯示為加熱開始時的吸光度(僅雙鏈DNA的吸光度)的約I. 5倍左右，由此可以判斷熔解完成。Tm值基于該現象而設定。本發(fā)明中的Tm值只要不特別指出，均是指吸光度達到吸光度總上升量的50%時的溫度。本說明書中“步驟” ー詞，不僅包含獨立的步驟，而且例如在不能與其他的步驟明確區(qū)別的情況下，只要達到了本步驟預期的效果，則也包含在本術語之內。另外，在本發(fā)明中，使用“ ”表示的數值范圍表示分別包含“ ”的前后記載的數值作為最小值和最大值的范圍。另外，在本發(fā)明中，組成物中的各成分的量，在所述組成物中存在多種相當于各成分的物質的情況下，只要不特別指出，是指組成物中存在的該多種物質的合計量。在本發(fā)明中，關于寡核苷酸的序列，當稱為“從3’末端起數第I 3位”時是以寡核苷酸鏈的3’末端為第I位起數的。本發(fā)明中的“靶標序列”是指為了檢測多態(tài)性(poly A重復單元數目突變)而與對應探針雜交的核酸序列。下面說明本發(fā)明涉及的多態(tài)性檢測用探針。此外，本發(fā)明中的“含有”和“具有”也包含“由……組成”以及“由……構成”的意思。本發(fā)明中的“至少80%以上的同一性”是指，從檢測靈敏度的觀點來說，可以顯示85%以上的同一性、90%以上的同一性、95%以上的同一性、96%以上的同一性、97%以上的同一性、98%以上的同一性或99%以上的同一性。雜交可以根據公知的方法或者基于公知方法的方法，例如按照MolecularCloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中記載的方法等來進行。該文獻通過參考被并入本說明書中。本發(fā)明的“在嚴謹條件下”是指形成特異性雜交體但不形成非特異性雜交體的條件。典型的嚴謹條件例如可以舉出在鉀濃度約25mM 約50mM以及鎂濃度約I. OmM 約
5.OmM中進行雜交的條件。作為詳細的示例，可以舉出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mM的KCl以及I. 5mM的MgC12中進行雜交的條件,但不限于此。此外，嚴謹條件被記載在MolecularCloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中。該文獻通過參考被并入本說明書中。本領域技術人員可以通過改變雜交反應、雜交反應液的鹽濃度等來容易地選擇上述條件?！炊鄳B(tài)性檢測用探針〉
本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針為用于檢測HGF基因的多態(tài)性的探針，其特征在干，其由從下述(Pl-I)、(P1-2)、(Pr -I)、(P1’ -2)、(P2-1)、(P2-2)、(P2’-l)、(P2’-2)、(P3-1)、(P3-2)、(P3’ -I)和(P3’ -2)的組中選擇的至少ー種熒光標記寡核苷酸構成。(Pl-I)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95 100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號95 100的3’末端和所述堿基編號132之間的I 31個堿基中任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為8 94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于與序列編號3互補的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述與堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記；(P1-2)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95 100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號95 100的3’末端和所述堿基編號132之間的I 31個堿基中任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為8 94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，與序列編號3的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述與堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記；(P1’ -I)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95 100以及由夾在所述堿基編號95 100的3’末端和堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為7 55個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于與序列編號3互補的堿基序列具有至少80%以上的同一性，與所述堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記；(P1’ -2)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95 100以及由夾在所述堿基編號95 100的3’末端和堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為7 55個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，與序列編號3的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述與堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記；(P2-1)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號92 100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號92 100的3’末端和所述堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為11 94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于與序列編號3互補的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述與喊基編號92對應的喊基用熒光染料標記；(P2-2)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號92 100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號92 100的3’末端和所述堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為11 94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶的條件下、與序列編號3的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述與堿基編號92對應的堿基用熒光染料標記；(P2’ -I)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號92 100以及由夾在所述堿基編號92 100的3’末端和堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為10 55個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶的條件下、相對于與序列編號3互補的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述與堿基編號92對應的堿基用熒光染料標記；
(P2’ -2)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號92 100以及由夾在所述堿基編號92 100的3’末端和堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為10 55個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶的條件下，與序列編號3的堿基序列在嚴謹條件下雜交，與所述堿基編號92對應的堿基用熒光染料標記；(P3-1)熒光標記寡核苷酸，其為8 120個堿基長的堿基序列，且含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號100、堿基編號132 134、以及由夾在所述堿基編號100和所述堿基編號132 134的5’末端之間的4 31之間任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列，其在堿基編號134的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于序列編號3的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述堿基編號134的堿基用熒光染料標記；(P3-2)熒光標記寡核苷酸，其為8 120個堿基長的堿基序列，且含有序列編號3所不的喊基序列的喊基編號100、喊基編號132 134、以及由夾在所述喊基編號100和所述堿基編號132 134的5’末端之間的4 31之間任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列，其在堿基編號134的堿基為胞嘧啶的條件下，和與序列編號3互補的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述堿基編號134的堿基用熒光染料標記；(P3’ -I)熒光標記寡核苷酸，其為8 56個堿基長的堿基序列，且含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號132 134以及由夾在堿基編號100和所述堿基編號132 134的5’末端之間的5 31之間任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列，其在堿基編號134的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于序列編號3的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述堿基編號134的堿基用熒光染料標記；(P3’ -2)熒光標記寡核苷酸，其為8 56個堿基長的堿基序列，且含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號132 134以及由夾在堿基編號100和所述堿基編號132 134的5’末端之間的5 31之間任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列，其在堿基編號134的堿基為胞嘧啶的條件下，和與序列編號3互補的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述堿基編號134的堿基用熒光染料標記。本發(fā)明的所述熒光標記寡核苷酸可以為與互補鏈雜交時的熒光強度比未與互補鏈雜交時的熒光強度減少(淬滅)或増加的熒光標記寡核苷酸。其中，可以為與互補鏈雜交時的突光強度比未與互補鏈雜交時的突光強度減少的突光標記寡核苷酸。
利用了這種突光淬滅現象(Quenching phenomenon)的探針一般稱為鳥嘌呤淬滅探針，已知為所謂的Q Probe(注冊商標)。其中可以舉出如下寡核苷酸，其被設計成3’末端或5’末端為胞嘧啶(C)，并且被熒光染料標記以使該末端的C靠近鳥嘌呤(G)時發(fā)光變弱。若使用這樣的探針，則可以根據信號的變動來容易地確認雜交和解離。此外，除了使用Q Probe(注冊商標)的檢測方法之外，也可以應用其它公知的檢測方式。作為這種檢測方式，可舉出Taq-man探針法、雜交探針(Hybridization Probe)法、分子信標(Molecular Beacon)法或MGB探針法等。所述熒光染料無特別限制，例如可以舉出熒光素、磷光體、羅丹明、聚甲炔染料衍生物等。這些熒光染料的市售產品例如可舉出Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM> Cy3 和 Cy5、TAMRA 等。熒光標記寡核苷酸的檢測條件無特別限制，可以根據使用的所述熒光染料適當確 定。例如Pacific Blue能夠在檢測波長445 480nm下檢測，TAMRA能夠在波長585 700nm下檢測，BODIPY FL能夠在波長520 555nm下檢測。如果使用具有這樣的熒光染料的探針，則能夠根據各個熒光信號的變動來容易地確認雜交和解離。可以按照通常的方法，例如日本專利文獻特開2002-119291號公報等中記載的方法，來將所述熒光染料結合至寡核苷酸。此外，在與具有和熒光標記寡核苷酸互補的堿基序列的DNA雜交的情況下的Tm值、和具有僅有I個堿基為非互補的堿基序列的DNA雜交時的Tm值之差例如可舉出2. (TC以上、3. (TC以上、5. (TC以上或7. (TC以上等。另外，本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針例如可以在3’末端添加磷酸基。如后文所述，革巴標序列可以通過PCR (Polymerase Chain Reaction :聚合酶鏈式反應)法等基因擴增法來制備。此時，可以將本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針共存于基因擴增反應的反應液中。這種情況下，如果在多態(tài)性檢測用探針的3’末端添加磷酸基，則能夠充分防止探針該多態(tài)性檢測用探針自身由于基因擴增反應而延長。另外，通過在3’末端添加前述那樣的標記物質也能夠獲得同樣的效果。以下，作為本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針的代表，詳細敘述(Pl-I)、(PI’ -I)、(P2-1)、(P2’ -I)、(P3-1)和(P3’ -I)熒光標記寡核苷酸。此外，由于(P1-2)為與(Pl-I)類似的堿基序列的熒光標記寡核苷酸，(P1’ -2)為與(P1’ -I)類似的堿基序列的熒光標記寡核苷酸，(P2-2)為與(P2-1)類似的堿基序列的熒光標記寡核苷酸，(P2’ -2)為與(P2’ -I)類似的堿基序列的熒光標記寡核苷酸，(P3-2)為與(P3-1)類似的堿基序列的熒光標記寡核苷酸，(P3’ -2)為與(P3’ -I)類似的堿基序列的熒光標記寡核苷酸，因此特征相同，省略其詳細說明。首先，所述(Pl-I)和所述(Pl’-l)熒光標記寡核苷酸的“與堿基編號95對應的堿基”是指與序列編號3所示的堿基序列中作為堿基編號95的堿基“G(鳥嘌呤)”對應的互補堿基“C(胞嘧啶)”。S卩，(Pl-I)和(Pl’-l)熒光標記寡核苷酸相對于與序列編號3所示的喊基序列互補的喊基序列具有至少80%以上的同一性，但是該同一性的條件為與喊基編號95對應的堿基為胞嘧啶。在(pi-i)和(pr -D熒光標記寡核苷酸中，用熒光染料標記的C的位點不一定非要是3’末端，如下述的具體的變化實施方式所示，可以在從3’末端起數第I 3位的位置具有該C，通過該C存在于3’末端，例如具有檢測靈敏度變高等的傾向。該(Pl-I)熒光標記寡核苷酸的長度可以為27 57堿基長、32 52堿基長、或37 47堿基長。另外，該(Pl’-l)熒光標記寡核苷酸的長度可以為22 52堿基長、27 47堿基長、或32 42堿基長。例如，作為具體的(Pl-I)的變化實施方式，可以舉出以下的熒光標記寡核苷酸。在(pr -D的情況下，與以下所示的(pi-i)不同，(pr -D成為僅在作為poiy a重復序列的部分的序列的3’末端附屬有含其他種類的堿基的堿基序列的狀態(tài)。poly A重復單元數目30 (31)、46mer、序列編號45，-CAGTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-(熒光標記)-3，poly A重復單元數目30 (31)、42mer、序列編號55，-TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-(熒光標記)-3，poly A重復單元數目0(l)、12mer、序列編號6
5，-TTGTGAGCTGCC-(熒光標記)~3 ’接下來，所述(P2-1)和所述(P2’ -I)熒光標記寡核苷酸的“與堿基編號92對應的堿基”是指與序列編號3所示的堿基序列中作為堿基編號92的堿基“G(鳥嘌呤)”對應的互補堿基“C (胞嘧啶)”。S卩，(P2-1)和(P2’ -I)熒光標記寡核苷酸相對于與序列編號3所示的堿基序列互補的堿基序列具有至少80%以上的同一性，但是該同一性的條件為與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶。如下述的具體的變化實施方式所示，該C不一定是3’末端，可以在從3’末端起數第I 3位的位置具有該C，通過該C存在于3’末端，例如具有檢測靈敏度變高等的傾向。該(P2-1)熒光標記寡核苷酸的長度可以為32 62堿基長、37 57堿基長、或42 52堿基長。另外，該(P2’-l)熒光標記寡核苷酸的長度可以為22 52堿基長、27 47堿基長、或32 42堿基長。例如，作為具體的(P2-1)的變化實施方式，可以舉出如以下的熒光標記寡核苷酸。在(P2’ -I)的情況下，與如以下所示的(P2-1)不同，(P2’ -I)成為僅在作為poly A重復序列的部分的序列的3’末端附屬有含其他種類的堿基的堿基序列的狀態(tài)。poly A重復單元數目30(31)、46mer、序列編號75 ’ -TTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC-(熒光標記)~3，poly A重復單元數目30(31)、42mer、序列編號85，-TGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC-(熒光標記)-3，poly A重復單元數目0(1)、llmer、序列編號95 ’ -GAGCTGCCTGC-(熒光標記)~3 ’最后，所述(P3-1)和所述(P3’ -I)熒光標記寡核苷酸的“堿基編號134的堿基”是指序列編號3所示的堿基序列中作為堿基編號134的堿基“C (胞嘧啶)”。S卩，(P3-1)和(P3’ -I)突光標記寡核苷酸相對于序列編號3所不的堿基序列具有至少80%以上的同一性，但是該同一性的條件為堿基編號134的堿基為胞嘧啶。如下述的具體的變化實施方式所示，該C并不一定要是3’末端，而是可以在從3’末端起數第I 3位的位置具有該C，通過該C存在于3’末端，例如有檢測靈敏度變高等的傾向。該(P3-1)熒光標記寡核苷酸的長度可以為30 60堿基長、35 55堿基長、或40 50堿基長。另外，該(P3’ -I)熒光標記寡核苷酸的長度可以為19 49堿基長、24 44堿基長、或29 39堿基長。例如，作為具體的(P3-1)的變化實施方式，可以舉出以下所示的熒光標記寡核苷酸。在(P3’ -I)的情況下，與以下所示的(P3-1)不同，(P3’ -I)成為僅在作為poly A重復序列的部分的序列的3’末端附屬有含其他種類的堿基的堿基序列的狀態(tài)。
poly A重復單元數目30(31)、46mer、序列編號105，-AGAGCAGGCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC-(熒光標記)~3，poly A重復單元數目30(31)、36mer、序列編號115，-GCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC-(熒光標記)~3，poly A重復單元數目2(3)、8mer、序列編號125 ’ -GCTTTCAC-(熒光標記)~3 ’如上述(Pl-I)、(Pr-I)、(P2-1)、(P2，-I)、(P3-1)或(P3，-I)(也包括特征類似的(Pl-2)、(P1’ -2)、(P2-2)、(P2’ -2)、(P3-2)或(P3’ -2))熒光標記寡核苷酸所示的本發(fā)明涉及的多態(tài)性檢測用探針能夠用于HGF基因的poly A重復單元數目突變的檢測。檢測方法無任何限制，只要是利用靶標序列和這些多態(tài)性檢測用探針的雜交的方法即可。例如，可以僅使用(Pl-I)、(PI，-D、(P2-1)、(P2，-I)、(P3-1)或(P3，-I)的 poly A 重復單元數目30(31)的多態(tài)性檢測用探針(正常型探針)，來檢測HGF基因的poly A重復序列突變。另外，也可以使用(Pl-I)、(P1，-I)、(P2-1)、(P2，-I)、(P3-1)或(P3，-I)的 poly A 重復單元數目30(31)之外的各種poly A重復單元數目重復 數的多態(tài)性檢測用探針(突變型探針)，來檢測HGF基因的polyA重復單元數目突變。另外，本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針的特征在于其為用于熔解曲線分析的探針。以下敘述HGF基因的多態(tài)性檢測方法的詳細(也包括利用這樣的熔解曲線分析的方法)。〈HGF基因的多態(tài)性檢測方法>本發(fā)明的HGF基因的多態(tài)性檢測方法(HGF基因的poly A重復單元數目突變的檢測方法)特征在于使用前述的多態(tài)性檢測用探針。即，本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法的特征在于使用前述的本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，其他的構成或條件等不限于以下的記載。本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法例如包括下述步驟(I)、步驟(II)、步驟(III)和步驟
(IV)。(I)使所述多態(tài)性檢測探針和試樣中的單鏈核酸接觸，來獲得熒光標記寡核苷酸和單鏈核酸的雜交體的步驟。(II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度來使所述雜交體解離，并測定基于所述雜交體的解離的熒光信號的變動的步驟。(III)基于所述熒光信號的變動來評價所述雜交體的解離溫度、即Tm值的步驟。(IV)基于所述Tm值來檢測HGF基因中的多態(tài)性的存在的步驟。此外，上述步驟(III)中，“評價Tm值”可以是僅僅包括評價(確定)Tm值下的溫度，也可以包含評價(確定)Tm分析中的峰的高度，即評價(確定)每單位時間的熒光強度的變化量的峰。通過評價該峰的高度，能夠確認具有poly A重復單元數目突變的堿基序列的豐度比。更具體地說，例如，在僅使用正常型探針來實行這樣的多態(tài)性檢測方法的情況下，預先測定使用正常型單鏈核酸的情況下的Tm值。正常型單鏈核酸例如從全血等中使用市售的基因組DNA分離盒來分離基因組DNA并使用。之后，通過比較該正常型的Tm值和試樣的Tm值，能夠評價試樣HGF基因是否具有poly A重復單元數目突變。S卩，當Tm值為與正常型時完全相同的值時，判斷為試樣poly A重復序列與正常型探針完全匹配。但是，Tm值小于正常型時，表示試樣單鏈核酸和正常型探針的解離溫度低，因此這種情況下，可知試樣單鏈核酸的poly A重復單元數目少于正常型的30 (31)。另外，即使不是正常型探針，而是0 (I) 29 (30)的任意poly A重復單元數目的突變型探針，也能夠使用這樣的方法來評價是完全匹配還是錯配，并正確地檢測試樣的polyA重復單元數目突變。另外，至少使用一種這樣的各種多態(tài)性檢測用探針即可，也可以ー起使用兩種以上。通過一起使用兩種以上的多態(tài)性檢測用探針，并評價每單位時間的熒光強度的變化量(熒光信號)的峰，能夠一次性地評價與各個多態(tài)性檢測用探針完全匹配的poly A重復單元數目的靶標序列的豐度比。反應體系中本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針的添加濃度無特別限制，對于每一種多態(tài)性檢測用探針例如可以舉出10 lOOOnmol/L或20 500nmol/L。本發(fā)明涉及的HGF基因的多態(tài)性檢測方法，也可以含有在前述(I)的獲得雜交體之前，或者與獲得雜交體的同時擴增核酸的步驟。作為核酸的擴增法無特別限制，例如可以舉出 PCR 法、NASBA(Nucleic AcidSequence Based Amplification :基于核酸序列的擴增)法、TMA (Transcription-Mediated Amplification :轉錄介導擴增)法、或SDA(Strand Displacement Amplification :鏈置換擴增)法等。其中可以為PCR法。核酸的擴增法的條件無特別限制，可以通過以往公知的方法來進行?；谧鳛槟０宓暮怂醽砩蓴U增產物中，例如可以舉出使用用于擴增含有該檢測目標的poly A重復単元數目突變的序列的引物。該引物的擴增區(qū)域無特別限制，可以根據檢測目標的poly A重復單元數目突變來適當設定。例如，可以舉出含有與前述的(Pl-1)、(P1’-I)、(P2-1)、(P2’ -I)、(P3-1)或(P3’ -I)熒光標記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域。另外，該引物的序列無特別限制，例如，只要能夠擴增檢測目標的poly A重復單元數目突變的序列即可，可以根據該檢測序列和其周邊序列等來通過現有公知的方法而適當設定。另外，該引物的長度無特別限制，可以設定為一般的長度，例如可以舉出10 50堿基長。作為這樣的引物，例如可以使用擴增正義鏈的正向引物(F引物)和擴增反義鏈的反義引物(R引物)中的任何一者，例如可以舉出使用將兩者作為ー對的引物對。在使用該引物的反應體系中，引物的添加濃度無特別限制，例如對于ー種引物可以舉出0. I 4iimol/L、0. 25 I. 5 y mol/L或0. 5 I y mol/L。另外，在使用F引物和R引物的情況下，F引物和R引物的添加比例無特別限制，例如，按照以摩爾比的F引物R引物，可以舉出I : 0. I I : 10 或 I : 0. 5 I : 5。適用本發(fā)明的HGF基因的多態(tài)性檢測方法的試樣無特別限制，例如可以舉出生物試樣。作為該生物試樣的具體示例，例如可以舉出全血、白血球細胞等血細胞、骨髄、口腔粘膜等口腔內細胞、指甲或毛發(fā)等體細胞、生殖細胞、吐出的痰液、羊水、石蠟包埋組織、尿、洗胃液等。在本發(fā)明中，該試樣的采集方法以及由該試樣制備被檢核酸的方法等無特別限制，可采用現有的公知方法。在該生物試樣為全血時，本發(fā)明的反應體系中該全血的濃度例如可以舉出0. 01 2體積％、0. 05 I. 5體積％或0. I I體積％。另外，在該生物試樣為血清時，本發(fā)明的反應體系中該血清的濃度例如可以舉出0. I 20體積％、0. 25 15體積％或0. 5 10體積％。<藥劑的評價方法>本發(fā)明的藥劑的評價方法以通過利用前述的HGF基因的多態(tài)性檢測方法、來評價能夠用于與HGF基因相關的疾病的藥劑的耐受性或藥效為特征。即，本發(fā)明的藥劑的評價方法的特征在于使用前述HGF基因的多態(tài)性檢測方法進行評價，其他的構成或條件等不限于以下的記載。本發(fā)明的藥劑的評價方法例如包括下述步驟(I)和步驟(II)。(I)通過前述的HGF基因的多態(tài)性檢測方法，來檢測HGF基因的多態(tài)性的步驟。(II)基于檢測到的多態(tài)性的有無，來評價針對藥劑的耐受性或藥劑的藥效的步驟。具體的詳情與前述HGF基因的多態(tài)性檢測方法相同。(II)中的“基于檢測到的多態(tài)性的有無，來評價針對藥劑的耐受性或藥劑的藥效”例如是指，基于突變型和正常型的豐度比或有無等來對針對乳腺癌等藥劑的耐受性或藥劑的藥效進行評價。如此的藥劑的評價方法在確定由于該poly A重復單元數目突變導致的疾病的治療方針(如增減藥劑的施與量、或改變?yōu)槠渌闹委熕幍?中有用。 〈HGF基因的多態(tài)性檢測用試劑盒>本發(fā)明的HGF基因的多態(tài)性檢測用試劑盒以含有前述的多態(tài)性檢測用探針為特征。即，本發(fā)明的HGF基因的多態(tài)性檢測用試劑盒的特征在于含有前述的多態(tài)性檢測用探針，其他的構成或條件等不限于以下的記載。此外，還可以含有能夠以含有與前述的多態(tài)性檢測用探針即(Pl-I)、(Pr -I)、(P2-1)、(P2’ -I)、(P3-1)或(P3’ -I)(也包括特征類似的(Pl-2)、(Pl，-2)、(P2-2)、(P2，-2)、(P3-2)或(P3，-2))熒光標記寡核苷酸雜交的堿基序列的區(qū)域為模板進行擴增的引物。下面敘述本發(fā)明的HGF基因的多態(tài)性檢測用試劑盒的示例。例如，本發(fā)明的HGF基因的多態(tài)性檢測用試劑盒為在HGF基因的poly A重復單元數目突變的檢測中使用的試劑盒。試劑盒中也可以含有ー種或兩種以上的前述的多態(tài)性檢測用探針。在后者的情況下，兩種以上的多態(tài)性檢測用探針可以以混合狀態(tài)被包含，也可以作為単獨的試劑被包含。另外，在兩種以上的本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針以混合的狀態(tài)包含在本發(fā)明的HGF基因的多態(tài)性檢測用試劑盒中的情況下，或者雖然作為單獨的試劑被包含，但是例如使用時在相同的反應體系中進行各多態(tài)性檢測用探針和各靶標序列的Tm解離分析的情況下，各多態(tài)性檢測用探針可以用不同的熒光染料進行標記。通過如此改變熒光染料的種類，使得即使相同的反應體系中，也能夠進行針對各個多態(tài)性檢測用探針的檢測。作為所述熒光染料，例如，可以舉出檢測波長不同的物質。如前所述，近年，據稱HGF基因的poly A重復單元數目突變與乳腺癌的發(fā)病風險有夫。因此，通過本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針、HGF基因的多態(tài)性檢測方法以及HGF基因的多態(tài)性檢測用試劑盒等，能夠正確地檢測poly A重復單元數目的多個堿基単位的突變，因此使得能夠預先檢查乳腺癌的發(fā)病風險，很有可能能夠與乳腺癌的早期發(fā)現等相關聯。接下來說明本發(fā)明的實施例。但是，本發(fā)明不限于下述實施例。下面敘述如下實施例，所述實施例中使用本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針評價了作為HGF基因的啟動子區(qū)域的部分序列的、從第19432961位的堿基到第19432991位的堿基的poly A重復單元數目突變。(實施例I)實施例I中，利用本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，對HGF基因的啟動子區(qū)域的polyA重復單元數目突變，使用全自動SNPs檢查裝置(商品名i-denSy(IS-5310)、愛科來公司制)進行了 Tm分析。添加到i-densy(IS-5310)中的探針等溶液、試劑的處方如下表所示。表I
權利要求
1.一種多態(tài)性檢測用探針，其是用于檢測HGF基因的多態(tài)性的探針，其特征在于，其由從下述(Pl-I)、(Pl-2)、(Pl，-I)、(Pl，-2)、(P2-1)、(P2-2)、(P2，-I)、(P2，-2)、(P3-1)、(P3-2)、(P3，-I)和(P3’ -2)的組中選擇的至少ー種熒光標記寡核苷酸構成 (Pl-I)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95 100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號95 100的3’末端和所述堿基編號132之間的I 31個堿基中任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為8 94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于與序列編號3互補的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述與堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記； (P1-2)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95 100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號95 100的3’末端和所述堿基編號132之間的I 31個堿基中任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為8 94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，與序列編號3的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述與堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記； (pr -D熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95 100以及由夾在所述堿基編號95 100的3’末端和堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為7 55個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于與序列編號3互補的堿基序列具有至少80%以上的同一性，與所述堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記； (P1’ -2)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95 100以及由夾在所述堿基編號95 100的3’末端和堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為7 55個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，與序列編號3的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述與堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記； (P2-1)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號92 100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號92 100的3’末端和所述堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為11 94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于與序列編號3互補的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述與堿基編號92對應的堿基用熒光染料標記； (P2-2)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號92 100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號92 100的3’末端和所述堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為11 94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶的條件下、與序列編號3的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述與堿基編號92對應的堿基用熒光染料標記； (P2’ -I)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號92 100以及由夾在所述堿基編號92 100的3’末端和堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為10 55個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶的條件下、相對于與序列編號3互補的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述與堿基編號92對應的堿基用熒光染料標記；(P2’ -2)熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號92 100以及由夾在所述堿基編號92 100的3’末端和堿基編號132之間的I 31個堿基中的任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為10 55個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號92對應的堿基為胞嘧啶的條件下，與序列編號3的堿基序列在嚴謹條件下雜 交，與所述堿基編號92對應的堿基用熒光染料標記； (P3-1)熒光標記寡核苷酸，其為8 120個堿基長的堿基序列，且含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號100、堿基編號132 134、以及由夾在所述堿基編號100和所述堿基編號132 134的5’末端之間的4 31之間任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列，其在堿基編號134的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于序列編號3的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述堿基編號134的堿基用熒光染料標記； (P3-2)熒光標記寡核苷酸，其為8 120個堿基長的堿基序列，且含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號100、堿基編號132 134、以及由夾在所述堿基編號100和所述堿基編號132 134的5’末端之間的4 31之間任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列，其在堿基編號134的堿基為胞嘧啶的條件下，和與序列編號3互補的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述堿基編號134的堿基用熒光染料標記； (P3’ -I)熒光標記寡核苷酸，其為8 56個堿基長的堿基序列，且含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號132 134以及由夾在堿基編號100和所述堿基編號132 134的5’末端之間的5 31之間任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列，其在堿基編號134的喊基為胞B密唳的條件下,相對于序列編號3的喊基序列具有至少80 以上的同一性，并且所述堿基編號134的堿基用熒光染料標記； (P3’ -2)熒光標記寡核苷酸，其為8 56個堿基長的堿基序列，且含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號132 134以及由夾在堿基編號100和所述堿基編號132 134的5’末端之間的5 31之間任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列，其在堿基編號134的堿基為胞嘧啶的條件下，和與序列編號3互補的堿基序列在嚴謹條件下雜交，并且所述堿基編號134的堿基用熒光染料標記。
2.根據權利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在干， 所述(Pl-I)、所述(P1-2)、所述(P1’ -I)和所述(P1’ -2)熒光標記寡核苷酸在從3’末端起數第I 3位的位置具有用熒光染料標記的、所述與堿基編號95對應的堿基； 所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’ -I)和所述(P2’ -2)熒光標記寡核苷酸在從3’末端起數第I 3位的位置具有用熒光染料標記的、所述與堿基編號92對應的堿基； 所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’ -I)和所述(P3’ -2)熒光標記寡核苷酸在從3’末端起數第I 3位的位置具有用熒光染料標記的、所述堿基編號134的堿基。
3.根據權利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，所述(Pl-I)、所述(P1-2)、所述(pr -D和所述(Pr -2)熒光標記寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標記的、所述與堿基編號95對應的堿基； 所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’ -I)和所述(P2’ -2)熒光標記寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標記的、所述與堿基編號92對應的堿基； 所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’ -I)和所述(P3’ -2)熒光標記寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標記的、所述堿基編號134的堿基。
4.根據權利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，所述熒光標記寡核苷酸在未與靶標序列雜交時發(fā)出熒光，并且在與所述靶標序列雜交時熒光強度減少或増加。
5.根據權利要求4所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，所述熒光標記寡核苷酸在未與靶標序列雜交時發(fā)出熒光，并且在與所述靶標序列雜交時熒光強度減少。
6.根據權利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，所述(Pl-I)或所述(P1-2)突光標記寡核苷酸的堿基長為27 57 ; 所述(Pr -I)或所述(Pr -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為22 52 ; 所述(P2-1)或所述(P2-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為32 62 ; 所述(P2’ -I)或所述(P2’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為22 52 ; 所述(P3-1)或所述(P3-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為30 60 ; 所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為19 49。
7.根據權利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，所述(Pl-I)或所述(P1-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為32 52 ; 所述(Pr -I)或所述(Pr -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為27 47 ; 所述(P2-1)或所述(P2-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為37 57 ; 所述(P2’ -I)或所述(P2’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為27 47 ; 所述(P3-1)或所述(P3-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為35 55 ; 所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為24 44。
8.根據權利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，所述(Pl-I)或所述(P1-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為37 47 ; 所述(PI’ -D或所述(P1’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為32 42 ; 所述(P2-1)或所述(P2-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為42 52 ; 所述(P2’ -I)或所述(P2’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為32 42 ; 所述(P3-1)或所述(P3-2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為40 50 ; 所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)熒光標記寡核苷酸的堿基長為29 39。
9.根據權利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，所述多態(tài)性檢測用探針為用于熔解曲線分析的探針。
10.ー種HGF基因的多態(tài)性檢測方法，其特征在于，使用權利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針。
11.根據權利要求10所述的HGF基因的多態(tài)性檢測方法，其特征在于，包括 (I)使權利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，獲得所述熒光標記寡核苷酸和所述單鏈核酸的雜交體的步驟； (II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度，使所述雜交體解離，測定基于所述雜交體的解離的熒光信號的變動的步驟； (III)基于所述熒光信號的變動，評價所述雜交體的解離溫度即Tm值的步驟；以及 (IV)基于所述Tm值，檢測HGF基因中的多態(tài)性的存在的步驟。
12.根據權利要求11所述的HGF基因的多態(tài)性檢測方法，其特征在于，還包括在所述(I)的獲得雜交體之前或者與所述(I)的獲得雜交體同時擴增核酸的步驟。
13.—種藥劑的評價方法，其特征在于，包括 (I)通過權利要求10所述的HGF基因的多態(tài)性檢測方法，來檢測HGF基因的多態(tài)性的步驟； (II)基于檢測到的多態(tài)性的有無，來評價針對藥劑的耐受性或藥劑的藥效的步驟。
14.HGF基因的多態(tài)性檢測用試劑盒，其特征在于，包括權利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針。
15.根據權利要求14所述的HGF基因的多態(tài)性檢測用試劑盒，其特征在于，還包括能夠以含有與所述(Pl-I)、所述(P1-2)、所述(P1’ -I)、所述(P1’ _2)、所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’ -I)、所述(P2’ -2)、所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)熒光標記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域為模板進行擴增的引物。
全文摘要
本發(fā)明提供HGF基因的poly A重復單元數目突變多態(tài)性檢測用探針及其用途。所述多態(tài)性檢測用探針為用于檢測HGF基因的多態(tài)性的探針，其由(P1-1)、(P1-2)、(P1’-1)、(P1’-2)、(P2-1)、(P2-2)、(P2’-1)、(P2’-2)、(P3-1)、(P3-2)、(P3’-1)和(P3’-2)中的至少一種熒光標記寡核苷酸構成。例如(P1-1)為如下熒光標記寡核苷酸，其堿基序列與含有序列編號3所示的堿基序列的堿基編號95～100、堿基編號132、以及由夾在所述堿基編號95～100的3’末端和所述堿基編號132之間的1～31個堿基中任意個數的連續(xù)的T構成的子堿基序列且長度為8～94個堿基長的堿基序列互補，其在與堿基編號95對應的堿基為胞嘧啶的條件下，相對于與序列編號3互補的堿基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述與堿基編號95對應的堿基用熒光染料標記。
文檔編號C12N15/11GK102776277SQ20121015014
公開日2012年11月14日 申請日期2012年5月9日 優(yōu)先權日2011年5月9日
發(fā)明者井口亞希, 平井光春 申請人:愛科來株式會社