專利名稱：：GmPGIP3蛋白及其編碼基因在培育抗根腐病和抗全蝕病植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及GmPGIP3蛋白及其編碼基因在培育抗根腐病和抗全蝕病植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：小麥根腐病是小麥生產(chǎn)上ー種難以防治的世界性小麥土傳病害。近年來(lái)，在ー些地區(qū)小麥根腐病害已經(jīng)由次要病害上升為主要病害，如我國(guó)華北麥區(qū)、黃淮麥區(qū)和東北麥區(qū)許多麥田均發(fā)現(xiàn)因根腐病造成的枯白穂。小麥根腐病是多元性復(fù)合侵染的病害，主要病原菌為禾旋孢腔菌[無(wú)性態(tài)為Bipolarissorokiniana(Sacc.ExSorok.)Shoem.，有性態(tài)為Cochliobolussativus(ItoetKurib.)Drechsl]。小麥根腐病是全生育期典型的多階段性病害，從苗期到抽穗結(jié)實(shí)期都能發(fā)生。一般減產(chǎn)10%30%，嚴(yán)重地塊減產(chǎn)超過(guò)50%。不僅如此，受害小麥的品質(zhì)和商品價(jià)值也有很大損失。目前，生產(chǎn)上缺乏對(duì)小麥根腐病有效的化學(xué)藥劑，化學(xué)防治效果較差。小麥根腐病的抗性遺傳背景復(fù)雜，抗病種質(zhì)資源較少且至今未找到免疫品種，抗根腐病小麥常規(guī)育種進(jìn)展緩慢。因此，發(fā)掘、利用重要的抗病相關(guān)基因，開(kāi)展抗根腐病的小麥基因工程育種非常重要。小麥全蝕病又稱立枯病、黑腳病，是由子囊真菌--禾頂囊殼禾谷變種Gaeumannomycesgraminisvar.graminis(Sacc.ノWalkerJ和禾頂囊J=C小麥變種Gaeumannomycesgraminis(Sacc.MrxetOlivervar.tritici(Sacc.)Walker弓丨起的典型根部病害，是小麥的毀滅性病害，引起植株成簇或大片枯死，降低有效穗數(shù)、穗粒數(shù)及千粒重，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。該病在小麥苗期和成株期均可發(fā)生，以快成熟時(shí)病株癥狀最為明顯，表現(xiàn)點(diǎn)片麥芒和麥穗發(fā)白。該病與小麥其他根腐型病害區(qū)別在于種子根和次生根變黑腐敗，莖基部生有黑膏藥狀的菌絲體。該病原菌寄主范圍較廣，能侵染10多種栽培或野生的禾本科植物，如小麥、大麥、黒麥、燕麥、水稻等。目前，生產(chǎn)上缺乏對(duì)小麥全蝕病有效的化學(xué)藥劑，化學(xué)防治效果較差。由于小麥根腐病和全蝕病屬于土傳病害,培育和利用抗病品種是防治小麥根腐病和全蝕病最經(jīng)濟(jì)有效的措施之一。目前，生產(chǎn)上大面積推廣品種和育種材料對(duì)根腐病、全蝕病的抗性普遍較差，常規(guī)抗病育種進(jìn)展緩慢，一方面是由于這些土傳病害的抗性鑒定和選擇比較困難，單株選擇很不可靠；另一方面是缺乏高抗根腐病、全蝕病的小麥種質(zhì)資源。因此，通過(guò)常規(guī)育種手段很難有效進(jìn)行小麥根腐病、全蝕病的抗性育種。多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibitingprotein,PGIP)是ー種富含亮氨酸重復(fù)區(qū)域的細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，能特異性結(jié)合和抑制真菌內(nèi)切多聚半乳糖醒酶(endopolygalacturonases,PGs)活性。大豆的PGIP蛋白分為四個(gè)家族,分別命名為GmPGIPト
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供GmPGIP3蛋白及其編碼基因在培育抗根腐病和抗全蝕病植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了ー種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將GmPGIP3蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到抗病性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述GmPGIP3蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。所述抗病可為抗根腐病和/或抗全蝕病。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為小麥，如小麥品種揚(yáng)麥18。所述根腐病致病菌具體可為為平臍螺孢菌(Bipolarissorokiniana)。所述全蝕病致病菌具體可為Gaeumannomycesgramimsvar.tritici(Ggt)。所述GmPGIP3蛋白的編碼基因具體可為如下I)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在0.IXSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。所述編碼基因具體可通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。所述重組表達(dá)載體可為將所述GmPGIP3蛋白的編碼基因插入單子葉植物表達(dá)載體PAHC25的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體具體可為將所述GmPGIP3蛋白的編碼基因插入單子葉植物表達(dá)載體PAHC25的SmaI和SacI酶切位點(diǎn)間得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)所述GmPGIP3蛋白或所述GmPGIP3蛋白的編碼基因在培育抗病植物中的應(yīng)用。所述抗病可為抗根腐病和/或抗全蝕病。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為小麥，如小麥品種揚(yáng)麥18。所述根腐病致病菌具體可為為平臍婦抱菌(Bipolarissorokiniana)。所述全蝕病致病菌具體可為Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggtノ。本發(fā)明還保護(hù)ー種重組表達(dá)載體，為將所述GmPGIP3蛋白的編碼基因插入單子葉植物表達(dá)載體PAHC25的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體具體可為將所述GmPGIP3蛋白的編碼基因插入單子葉植物表達(dá)載體PAHC25的SmaI和SacI酶切位點(diǎn)間得到的重組質(zhì)粒。發(fā)明人構(gòu)建了GmPGIP3蛋白的編碼基因的單子葉高效表達(dá)載體，將其導(dǎo)入小麥后，可以得到抗根腐病、全蝕病的轉(zhuǎn)基因小麥。本發(fā)明對(duì)于抗病植物的育種均有重大價(jià)值。圖I為單子葉植物表達(dá)載體pAHC25的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為重組質(zhì)粒pA25_GmPGIP3的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為轉(zhuǎn)GmPGIP3基因株系T2代植株的基因水平PCR鑒定電泳圖。圖4為轉(zhuǎn)GmPGIP3基因株系T2代植株的基因水平Southern雜交鑒定結(jié)果。圖5為轉(zhuǎn)GmPGIP3基因株系T2代植株的轉(zhuǎn)錄水平鑒定結(jié)果。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。小麥品種揚(yáng)麥18:購(gòu)自江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。實(shí)施例中所用的小麥根腐病致病菌為平臍螺孢菌(Bipolarissorokiniana),購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所。實(shí)施例中所用的小麥全蝕病致病菌為Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt),購(gòu)自西北農(nóng)林科技大學(xué)。單子葉植物表達(dá)載體pAHC25(pAHC25由pUC8改造而成，含有2個(gè)表達(dá)盒，第I個(gè)表達(dá)盒具有玉米Ubiquitin啟動(dòng)子、Exon、Intron、⑶S、Nos終止子，⑶S兩端具有SmaI和SacI酶切位點(diǎn)，第2個(gè)表達(dá)盒具有玉米Ubiquitin啟動(dòng)子、Exon、Intron、Bar、Nos終止子；又稱pAHC25質(zhì)粒；結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖I):參考文獻(xiàn)ChristensenandQuail,1996;Uoiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionoiselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,5,213-218;由作者之ー贈(zèng)送，公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。大豆品種中黃13:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。實(shí)施例I、轉(zhuǎn)GmPGIP3基因植物的獲得一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建I、根據(jù)GmPGIP3基因cDNA序列設(shè)計(jì)ー對(duì)引物如下GmPGIP3-F:5/-ATGTCAAAGTTAAGCATTCT-3'；GmPGIP3-R:5/-TTAAGTGCATGGTGGAAGAG-3'。2、提取大豆品種中黃13葉片的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。3、以步驟2的cDNA為模板，用GmPGIP3_F和GmPGIP3_R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果如序列表的序列2所示。4、以步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用GmPGIP3_SMAF和GmPGIP3_SACR組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。GmPGIP3-SMAF:5/-ATCCCGGGATGTCAAAGTTAAGCATTCT-3;；GmPGIP3-SACR:5/-GTGAGCTCTTAAGTGCATGGTGGAAGAG-3'。5、用限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI雙酶切步驟4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。6、用限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI雙酶切單子葉植物表達(dá)載體pAHC25，回收載體骨架(約7700bp)。7、將步驟5的酶切產(chǎn)物和步驟6的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pA25-GmPGIP3。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pA25-GmPGIP3進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下將單子葉植物表達(dá)載體pAHC25的SmaI和SacI酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列2所示的GmPGIP3基因)。重組質(zhì)粒pA25-GmPGIP3的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2。重組質(zhì)粒pA25_GmPGIP3中，GmPGIP3基因表達(dá)受Ubi啟動(dòng)子(組成性啟動(dòng)子)控制,另外還具有I個(gè)受Ubi啟動(dòng)子控制的Bar基因表達(dá)盒，可為后續(xù)選擇利用雙丙胺膦(Bialaphos)篩選轉(zhuǎn)化再生植株提供抗性。ニ、轉(zhuǎn)GmPGIP3基因小麥的獲得I、將1200塊揚(yáng)麥18的幼胚愈傷組織作為基因槍轟擊的受體，用基因槍將重組質(zhì)粒pA25-GmPGIP3轟擊到愈傷組織。(I)將愈傷組織在高滲透培養(yǎng)基(SD2培養(yǎng)基+0.2mol/L甘露醇+0.2mol/L山梨醇)上進(jìn)行滲透處理4-6h(25°C，暗培養(yǎng))將愈傷組織放置在培養(yǎng)皿中央直徑約2.5cm范圍內(nèi)，每盤培養(yǎng)皿50塊愈傷組織。(2)用重組質(zhì)粒pA25-GmPGIP3包裹直徑IlOiim金粉，采用PDS-1000/He基因槍(Bio-Red公司生產(chǎn))，選擇IlOOPsi的可裂膜,載樣距祀材料6cm進(jìn)行轟擊。(3)轟擊后的愈傷組織繼續(xù)在原培養(yǎng)基上培養(yǎng)16_18h(25°C，暗培養(yǎng))。2、將愈傷組織轉(zhuǎn)移到SD2培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+lmg/LVBl+150mg/L天冬門酰胺+2mg/L2,4-D)上，恢復(fù)培養(yǎng)2周(25°C，暗培養(yǎng))。3、將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化篩選培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+lmg/La_萘こ酸+lmg/L激動(dòng)素+4mg/L雙丙胺膦)中，24-26°C光照培養(yǎng)14_21d。4、將愈傷組織分化小苗后轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)篩選培養(yǎng)基中(1/2MS培養(yǎng)基+2mg/L雙丙胺膦)，24-26°C光照培養(yǎng)14-28天，獲得了100株生根的再生植株。5、將再生植株轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+0.5mg/La_萘こ酸)上，24_26°C光照培養(yǎng)約21天。6、將苗高7-8cm且根系發(fā)達(dá)的植株移栽到花盆，在移栽到溫室3周以后，有95株植株成活(Ttl代)。7、將Ttl代植株自交并收獲種子(T1代種子)，將T1代種子培育為T1代植株，將T1代植株自交并收獲T2代種子，將T2代種子培育為T2代植株。8、基因水平的PCR鑒定分別將T1代植株、T2代植株和揚(yáng)麥18(WT)進(jìn)行如下鑒定在4葉期，每株植株取I個(gè)葉片提取基因組DNA，將基因組DNA作為模板，采用巢式PCR鑒定GmPGIP3基因。第一次PCR擴(kuò)增的引物對(duì)如下PUBI-1910U:5'-GCTCTGCCTTCATACGCTA-3'(位于載體啟動(dòng)子3'端)；TN0S-TR4:5'-ATGTATAATTGCGGGACTCTAAT-3'(位于TNOS終止序列)。第一次PCR擴(kuò)增的參數(shù)如下94°C3min；94°C45s、58°C45s,72°C90s，30個(gè)循環(huán)；72°C5min。第二次PCR擴(kuò)增的引物對(duì)如下GMPG-OU:5'-CCTAATCGGTCAAATCCCCT-3'；GMPG-OL:5'-GACAAGTCCACGAACGCCA-3'。第二次PCR擴(kuò)增的參數(shù)如下94°C3min；94°C40s、58°C40s、72°C35s，35個(gè)循環(huán)；72°C5min。巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I.8%瓊脂糖凝膠電泳，顯示約351bp條帶的為陽(yáng)性植株。其中T2代植株P(guān)CR鑒定均為陽(yáng)性的T1代植株為純合的轉(zhuǎn)GmPGIP3基因植株，共得到5個(gè)純合的轉(zhuǎn)GmPGIP3基因株系(分別命名為T908株系、T909株系、T910株系、T912株系和T913株系)。5個(gè)轉(zhuǎn)GmPGIP3基因株系T2代植株的PCR鑒定電泳圖為見(jiàn)圖3。圖3中M=IOObpDNAladder；CK:水；P:重組質(zhì)粒pA25_GmPGIP3；WT:揚(yáng)麥18；1:T908株系；2Τ909株系；3Τ910株系；4Τ912株系；5Τ913株系。9、基因水平的Southern雜交鑒定將4個(gè)轉(zhuǎn)GmPGIP3基因株系的T2代植株和揚(yáng)麥18(WT)分別進(jìn)行如下鑒定(I)提取植株的基因組DNA；(2)用限制性內(nèi)切酶DraI消化30μg步驟(I)得到的基因組DNA;(3)將步驟(2)的產(chǎn)物進(jìn)行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行Southern雜交(采用的探針為a-32P-dCTP標(biāo)記的序列表的序列2所示的GmPGIP3基因)。結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4中=WT:揚(yáng)麥18;1:T908株系；2:Τ909株系；3:Τ912株系；4:Τ913株系；Ρ:重組質(zhì)粒pA25-GmPGIP3；Μ:λDNA/HindIIImarker。結(jié)果顯示，T908株系、T909株系、T912株系和T913株系為4個(gè)不同轉(zhuǎn)基因事件產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因后代。以上結(jié)果表明GmPGIP3基因在轉(zhuǎn)基因小麥中可以遺傳，并整合到轉(zhuǎn)基因小麥基因組的不同部位。10、轉(zhuǎn)錄水平鑒定將5個(gè)轉(zhuǎn)GmPGIP3基因株系的T2代植株和揚(yáng)麥18(WT)分別進(jìn)行如下鑒定(I)提取植株的總RNA；(2)將步驟(I)的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用Actin基因特異引物對(duì)(ACT_A:5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3，;ACT-B:5，-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3，)調(diào)整各樣本cDNA模板量均一化。(3)以步驟(2)的cDNA為模板，用GmPGIP3基因特異引物對(duì)(GMPG_QF:5’-CCTAATCGGTCAAATCCCCT-3’;GMPG-QR:5’-GACAAGTCCACGAACGCCA-3’)進(jìn)行半定量RT-PCR表達(dá)分析。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min；94V30s、50°C30s、72°C30s,共35個(gè)循環(huán)；72°C延イ申5min。結(jié)果見(jiàn)圖5A。在5個(gè)株系中，GmPGIP3基因均得到了表達(dá)。(4)以步驟(2)的cDNA為模板，用GmPGIP3基因特異引物對(duì)(GMPG_QF:5，-CCTAATCGGTCAAATCCCCT-3’；GMPG-QR:5’-GACAAGTCCACGAACGCCA_3’)在ABIPRISMR7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析。以Actin基因?yàn)閮?nèi)參(ACT-A:5，-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3，；ACT_B:5，-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3，)。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性Imin;94°C變性15s、60°C退火31s、45個(gè)循環(huán)。結(jié)果見(jiàn)圖5B。在5個(gè)株系中，GmPGIP3基因均得到了高效表達(dá)。以上結(jié)果表明，5個(gè)抗根腐病的轉(zhuǎn)基因小麥株系均可在RNA水平超量表達(dá)GmPGIP3基因。三、轉(zhuǎn)空載體小麥的獲得按照步驟ニ的方法，用單子葉植物表達(dá)載體pAHC25代替重組質(zhì)粒pA25_GmPGIP3，得到轉(zhuǎn)空載體小麥。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)GmPGIP3基因植物的根腐病抗性鑒定將實(shí)施例I得到的轉(zhuǎn)GmPGIP3基因小麥的T2代植株(每個(gè)株系10株)、實(shí)施例I得到的轉(zhuǎn)GmPGIP3基因小麥的T1代植株(每個(gè)株系20株)、實(shí)施例I得到的轉(zhuǎn)空載體小麥的T2代植株(姆個(gè)株系10株)、實(shí)施例I得到的空載體小麥的T1代植株(姆個(gè)株系20株)和揚(yáng)麥18(WT)(20株)分別進(jìn)行如下鑒定在小麥分蘗盛期，將ー根布滿小麥根腐病致病菌的牙簽和一粒布滿小麥根腐病致病菌的麥粒一起嵌入到小麥基部第1-2葉鞘之間，接種時(shí)盡量保持葉鞘的自然抱莖狀態(tài)；接種后噴水保濕5-7天，于蠟熟期進(jìn)行病情調(diào)查。按照0-4級(jí)標(biāo)準(zhǔn)劃分小麥根腐病的病級(jí)(IT)0級(jí)(IT0):全株無(wú)??；I級(jí)(ITI):葉鞘有少量病斑，MK1/4；M1=葉鞘上的病斑面積/葉鞘的表面積；2級(jí)(IT2):病菌侵入莖桿，1/4^M2C1/2；M2=莖桿上的病斑面積/莖桿的表面積；3級(jí)(IT3):病菌侵入莖桿，1/2含M2<3/4；M2=莖桿上的病斑面積/莖桿的表面積；4級(jí)(IT4):病菌侵入莖桿，M2^3/4，莖桿已軟腐；M2=莖桿上的病斑面積/莖桿的表面積。病情指數(shù)Pi(0Z70)=(Oxxc^ixxjsxxjsxxjaxx4)/[(X0+X1+X2+X3+X4)]X4}XlOO；式中，XpXpXpXpXA分別表示0級(jí)、I級(jí)、2級(jí)、3級(jí)、4級(jí)莖桿數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表I。表I轉(zhuǎn)GmPGIP3基因小麥、轉(zhuǎn)空載體小麥和揚(yáng)麥18的根腐病病情指數(shù)(平均值)代數(shù)SI[itrWm,T908~T909l~T910IT912T913揚(yáng)麥18_轉(zhuǎn)空載體小麥T12520222022.34240T2222H.6!H.B2015.5■44.8"結(jié)果表明，揚(yáng)麥18和轉(zhuǎn)空載體小麥的病情指數(shù)沒(méi)有顯著差異，與揚(yáng)麥18相比,轉(zhuǎn)GmPGIP3基因小麥株系的群體對(duì)根腐病抗性顯著提高。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)GmPGIP3基因植物的全蝕病抗性鑒定將實(shí)施例I得到的轉(zhuǎn)GmPGIP3基因小麥的T2代種子(每個(gè)株系20粒)、實(shí)施例I得到的轉(zhuǎn)空載體小麥的T2代種子(每個(gè)株系20粒)和揚(yáng)麥18(WT)種子(20粒)分別進(jìn)行如下鑒定將種子消毒、催芽后，移至已放入小麥全蝕病致病菌菌餅的花盆中(每粒種子ー個(gè)花盆，基質(zhì)為I質(zhì)量分河沙和2質(zhì)量分營(yíng)養(yǎng)土的混合物)，培養(yǎng)3個(gè)星期后拍照并對(duì)如下指標(biāo)進(jìn)行鑒定測(cè)量單株的總根長(zhǎng)和黑(病)根長(zhǎng)，計(jì)算黑根面積占總根面積的百分率(病根百分比)，據(jù)此將全蝕病嚴(yán)重度劃分為五級(jí)(0-4級(jí))0=0%,1=0-10%,2=10-30%,3=30-60%,4=60-100%。全蝕病情指數(shù)(TAI)WOXno+lOXni+SOXr^+eOXr^+lOOXr^)/(+!^+++)，其中Iii為病級(jí)為i的株數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2。表2轉(zhuǎn)GmPGIP3基因小麥、轉(zhuǎn)空載體小麥和揚(yáng)麥18的全蝕病病情指數(shù)(平均值)權(quán)利要求1.ー種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將GmPGIP3蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到抗病性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述GmPGIP3蛋白是如下(a)或(b)Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述抗病為抗根腐病和/或抗全蝕病。3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述GmPGIP3蛋白的編碼基因是如下I)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2所不的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述編碼基因通過(guò)含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。5.如權(quán)利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為小麥。6.GmPGIP3蛋白或所述GmPGIP3蛋白的編碼基因在培育抗病植物中的應(yīng)用；所述GmPGIP3蛋白是如下(a)或(b)Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗病為抗根腐病和/或抗全蝕病。8.如權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述GmPGIP3蛋白的編碼基因是如下I)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2所不的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子。9.如權(quán)利要求6至8中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為小麥。10.一種重組表達(dá)載體，為將GmPGIP3蛋白的編碼基因插入單子葉植物表達(dá)載體PAHC25的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒；所述GmPGIP3蛋白是如下(a)或(b)Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了GmPGIP3蛋白及其編碼基因在培育抗根腐病和抗全蝕病植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的方法，是將GmPGIP3蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到抗病性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述GmPGIP3蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。發(fā)明人構(gòu)建了GmPGIP3蛋白的編碼基因的單子葉高效表達(dá)載體，將其導(dǎo)入小麥后，可以得到抗根腐病、全蝕病的轉(zhuǎn)基因小麥。本發(fā)明對(duì)于抗病植物的育種均有重大價(jià)值。文檔編號(hào)C12N15/82GK102649813SQ20121015060公開(kāi)日2012年8月29日申請(qǐng)日期2012年5月15日優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日發(fā)明者黨良,張?jiān)銎G,徐慧君,杜麗璞申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所