專利名稱：一個花特異表達(dá)啟動子kt631p的功能和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物工程和植物改良基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー個植物花特異表達(dá)啟動子KT631P的功能鑒定和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
外源DNA序列通過連接到特定的啟動子從而啟動在植物宿主中的表達(dá)，啟動子類型的選擇決定基因的表達(dá)時間和部位。目前在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的主要是ー些組成型的強啟動子，比如CaMV 35S啟動子和玉米Ubiquitin-I啟動子(Battraw and Hall,1990 ；Christensen et al. 1992),然而在利用這些啟動子誘導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)化水稻等作物以期改良作物的品質(zhì)時，往往會由于目的基因表達(dá)的時間(發(fā)育階段特異性)或空間(組織器官特異性)不能很好地控制而導(dǎo)致改良效果不明顯，或者由于這些組成型啟動子誘導(dǎo)基 因表達(dá)量太高而對植物的生長發(fā)育造成影響，這些都是目前利用組成型強啟動子結(jié)合功能基因來改良作物品質(zhì)時遇到的障礙。此外，在研究某些代謝過程或調(diào)節(jié)途徑時，常常需要將同一途徑上的兩個以上的基因轉(zhuǎn)化到同一個株系中去，采用轉(zhuǎn)化其中ー個基因得到轉(zhuǎn)基因植株后再轉(zhuǎn)化另外ー個基因，或者兩個基因分別轉(zhuǎn)化完成后再進行雜交，都需要等待較長的時間，為了提高效率縮短多個基因轉(zhuǎn)化的時間，最近有報道可以利用新的載體同時進行多個基因的轉(zhuǎn)化(Lin etal. 2003; Chen et al. 2006)，但是在多基因轉(zhuǎn)化時如果重復(fù)使用同一個啟動子，也會由于啟動子序列的高同源性可能導(dǎo)致基因沉默。因此，克服以上轉(zhuǎn)化技術(shù)上的困難，就很有必要克隆更多的組織器官特異性或者特定條件誘導(dǎo)型表達(dá)的啟動子，這樣可以根據(jù)需要選擇不同的啟動子誘導(dǎo)目的基因在適合的時間或空間表達(dá)。植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)。啟動子是重要的順式作用元件，是基因表達(dá)調(diào)控因子中最重要的因子，它基本決定ー個基因是否表達(dá)、何時表達(dá)和何處表達(dá)，它一般位于功能基因的5’側(cè)翼區(qū)域，能夠與RNA聚合酶以及其他蛋白輔助因子等反式元件相結(jié)合，從而控制基因轉(zhuǎn)錄的起始和速度。根據(jù)其驅(qū)動基因表達(dá)的不同特點，啟動子分為組成型啟動子和特異性啟動子。組成型啟動子能在所有細(xì)胞或組織中，不分時間和空間地啟動轉(zhuǎn)錄；特異性啟動子又可分為組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。組織特異性啟動子亦稱器官特異性啟動子，在這類啟動子的驅(qū)動下，基因的表達(dá)往往只限于某些特定的器官或組織部位，并表現(xiàn)發(fā)育調(diào)節(jié)等特性。組織特異性啟動子不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定器官或組織部位積累，増加區(qū)域表達(dá)量，同時也可以避免植物營養(yǎng)的不必要浪費。隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，這ー特性必然使組織特異性啟動子作為ー種重要的順式作用元件在生物反應(yīng)器、選育抗蟲、抗病、抗旱、抗高滲脅迫等抗逆特性的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)良品種等領(lǐng)域得到更加廣泛的應(yīng)用。植物花器官的形成與發(fā)育一直是研究的熱點問題之一。植物花的發(fā)育過程分為4個階段成花誘導(dǎo)、花分生組織形成、花器官原基產(chǎn)生和花器官成熟。分離這些過程中的花特異性表達(dá)基因啟動子，在控制植物育種和花卉培育過程中都有重要的作用。目前世界上已經(jīng)分離鑒定了ー些花器官特異的啟動子，例如，PAL價值的zb8啟動子驅(qū)動報告基因⑶S在轉(zhuǎn)基因水稻的花藥、花芽、花托和花絲中都表達(dá)[Zhu Q，et al.，1995，Plant Mol.Biol.，29:535-550]，而另ー些花特異啟動子則具有花器官某特定組織的特異性，如ー些水稻花藥特異性啟動子[Tsuchiya T等，1994，Plant Mol. Biol. , 20:1189-1193]、番茄花粉特異性啟動子LAT52[Twell D等，1989，Mol GenGenet, 217:240-245]和煙草花藥絨氈層特異性啟動子 TA29 [Koltunow AM 等，1990，Plant cell，2:1201-1224]等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種能在植物花器官驅(qū)動特異性轉(zhuǎn)錄的啟動子核苷酸序列，及克隆并應(yīng)用該啟動子的方法。本發(fā)明還提供了用于在植物中表達(dá)核苷酸序列的方法。在ー些實施方式中，方法包括(a)將核苷酸序列可操作地連接于包括SEQ ID No :1的啟動子，以產(chǎn)生表達(dá)盒；和(b)生成包括表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物，由此在植物中，更具體地說，是在植物花器官表達(dá)所述核苷酸。在一些實施方式中，所述“生成”包括用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并從所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生出植物。 本發(fā)明所提供的植物花特異性表達(dá)啟動子，含有序列表中SEQ ID No 1所示的核苷酸序列，還包含與SEQ ID No :1中所列核苷酸序列至少具有95%相似性的核苷酸序列，可以驅(qū)動操作性連接的核苷酸序列在植物花器官的特異性表達(dá)。實施方案中的啟動子核苷酸序列可用于從其它生物中分離相應(yīng)序列，如其它植物(單子葉或雙子葉植物等)。根據(jù)這些相應(yīng)序列與本文所列序列間的序列同源性，使用如PCR、雜交等技術(shù)來鑒別分離這些相應(yīng)序列。因此，根據(jù)它們與本文所列的完整KT631P啟動子序列(或其片段)間的序列相似性而分離的相應(yīng)片段，也包括在實施方案中。實施方案的啟動子區(qū)域可從任何植物中分離，包括(但不限干)水稻、蕓苔屬、玉米、小麥、高粱、兩節(jié)薺屬、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、大豆、擬南芥屬、菜豆屬、花生、苜蓿、燕麥、油菜籽、大麥、燕麥、黒麥(Rye)、粟、蜀黍、小黒麥、單粒小麥、斯佩爾特小麥(Spelt)、雙粒小麥、亞麻、格蘭馬草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麥草、甘鹿、紅莓苔子、番木瓜、香蕉、紅花、油棕、香瓜、蘋果、黃瓜、石斛、劍蘭、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、蕓苔、甜菜、咖_、薯蕷、觀賞植物和松類等。本文中“啟動子” ー詞指DNA調(diào)控序列，其中通常含有ー個TATA盒，該序列能夠指導(dǎo)RNA聚合酶II在合適的轉(zhuǎn)錄起始位點上起始特定編碼序列的轉(zhuǎn)錄。啟動子也可另外含有其他識別序列，它們通常位于TATA盒的上游或5’端，被稱作上游啟動子元件，這些元件能夠影響轉(zhuǎn)錄速率。應(yīng)認(rèn)識到當(dāng)鑒別了本文所公開的啟動子區(qū)域的核苷酸序列后，分離并鑒定位于本文所鑒別的特定啟動子區(qū)域上游的其它調(diào)控元件就屬于現(xiàn)有技術(shù)范圍了。因此，本文公開的啟動子區(qū)域可另外包含上游調(diào)控元件，如負(fù)責(zé)組織特異性和時間特異性表達(dá)的元件、調(diào)控組成型表達(dá)的元件和增強子等。本文中的“特異性表達(dá)”是指目的基因在特定的時間或特定組織器官中表達(dá)。“組織特異性啟動子”又稱“器官特異性啟動子”，在這類啟動子的調(diào)控下，基因往往只在某特定的組織或器官中表達(dá)。本文中所述植物花器官特異性表達(dá)啟動子指在植物花器官特異表達(dá)的啟動子。
通常，如果在某組織或器官中某特定基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的量比在其它組織或器官中高至少5倍，優(yōu)選至少高10倍，更優(yōu)選至少高100倍，最優(yōu)選至少高1000倍水平，則驅(qū)動其表達(dá)的啟動子被認(rèn)為具有組織或器官特異性。啟動子的活性和強度可以根據(jù)其驅(qū)動基因的mRNA或蛋白質(zhì)的含量來測定。本發(fā)明的實施案例中也包括DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有操作性連接于異源核苷酸序列上的啟動子，該啟動子含有本發(fā)明公開的序列，并可在植物細(xì)胞中驅(qū)動上述異源核苷酸序列進行表達(dá)。本發(fā)明的實施方案還提供了表達(dá)載體，以及在基因組中穩(wěn)定包含上述DNA構(gòu)建體的植物或植物細(xì)胞?！安僮餍赃B接”指使異源核苷酸序列處于啟動子作用下的連接方式，也指將兩個核苷酸序列連接起來從而使每個DNA片段的編碼序列都保持在適當(dāng)?shù)拈喿x框內(nèi)?！爱愒春塑账嵝蛄小敝柑烊粻顟B(tài)下沒有與本文所述啟動子序列KT631P操作性連接的序列，對于植物宿主來說可以是同源的，或是 異源的。本文所公開的KT631P花器官特異啟動子及其變異體和片段可用于植物基因エ程，例如制備轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)基因植物，以產(chǎn)生目的表型?！稗D(zhuǎn)化植物”或“轉(zhuǎn)基因植物”指在基因組內(nèi)含有異源核苷酸序列的植物。通常轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)基因植物基因組穩(wěn)定含有這些異源核苷酸序列，可將該異源核苷酸序列穩(wěn)定地遺傳給下一代。這些異源核苷酸序列可単獨或與重組DNA構(gòu)建體一起存在于基因組中。這里所述的“轉(zhuǎn)基因事件”包括任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物體部分或完整植物體，只要它們的基因型被外源核酸的存在而改變，包括通過轉(zhuǎn)基因操作而改變的起始宿主，以及通過這些起始宿主進行有性或無性繁殖所得的后代。這里所用的“轉(zhuǎn)基因事件”并不包括通過傳統(tǒng)植物種植方法或天然事件(例如隨機雜交、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變)改變了基因組(染色體或染色體外)的植物。“轉(zhuǎn)基因事件”通過以下步驟獲得，使用外源DNA構(gòu)建體(含有核酸表達(dá)盒，其中又含有目的基因)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，用基因組插入了外源DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞再培養(yǎng)獲得大量植物體，根據(jù)插入的外源基因進行篩選獲得所需的陽性轉(zhuǎn)基因系。轉(zhuǎn)基因事件的典型表型特征是目的基因的表達(dá)。在遺傳水平上，“目的基因”是植物基因組成的一部分。“轉(zhuǎn)基因事件”也指轉(zhuǎn)基因植物體與其它植物體進行雜交所得的含有外源DNA的后代。本文的“植物”包括整株植物、植物組織器官(如葉、根、莖等)、種子、植物細(xì)胞，以及它們的后代。實施方案中轉(zhuǎn)基因植物的部分植株應(yīng)理解為包括轉(zhuǎn)基因植物或其后代的植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、組織、愈傷組織、胚，及從轉(zhuǎn)基因植物或其后代長出的花、莖、果實、胚珠、葉或根等。這里所用的“植物細(xì)胞”包括但不限于種子懸浮培養(yǎng)物、胚芽、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子、花粉、孢子體和小孢子?？捎糜诒疚乃_方法的植物種類包括所有可進行轉(zhuǎn)化的高等植物，包括單子葉植物和雙子葉植物。本文所公開的啟動子序列可在宿主植物中調(diào)控任何異源核苷酸序列的表達(dá)。因此，所述的異源核苷酸序列可以是操作性連接于本文所公開的啟動子之上的結(jié)構(gòu)基因(編碼目的蛋白)。實施方案中的目的基因包括參與信號傳導(dǎo)調(diào)控的基因如轉(zhuǎn)錄因子、激酶等，持家基因如熱休克蛋白基因。更具體地說，轉(zhuǎn)基因的種類包括如，所編碼蛋白賦予植物耐受非生物逆境的抗性基因，所述非生物逆境包括干旱、溫度、鹽和毒素(殺蟲劑和除草剤)等?；蚴撬幋a蛋白賦予植物耐受生物逆境的抗性基因，如真菌、病毒、細(xì)菌、昆蟲和線蟲的侵害，以及由這些脅迫引起的疾病。表型的編碼包括改變植物中某個基因的表達(dá)，從而改變植物對病原體或昆蟲等的防御機制，或是提高植物對除草劑的抗性，根據(jù)環(huán)境改變植物的生長發(fā)育過程等。這些改變可通過在植物體內(nèi)表達(dá)外源基因或提高內(nèi)源特定基因的表達(dá)來獲得?；蛘呤峭ㄟ^降低植物體內(nèi)一個或多個內(nèi)源基因的表達(dá)產(chǎn)物，如酶、轉(zhuǎn)運蛋白、輔因子等，通過影響植物的代謝機制來獲得相應(yīng)的表型。由上可見，可將任何目的基因操作性連接到實施方案中的啟動子序列上，并在植物體中進行表達(dá)，優(yōu)選在植物花器官系中表達(dá)。根據(jù)RNA干擾技術(shù)(RNA interference, RNAi),操作性連接于本文所公開的KT631P花器官特異性表達(dá)啟動子上的異源核苷酸序列，可以是某些靶基因的反義序列?！胺戳x核苷酸序列”指一段與靶基因核苷酸序列互補的雙鏈RNA分子。當(dāng)導(dǎo)入到植物細(xì)胞中后，反義DNA序列的轉(zhuǎn)錄能阻止靶基因DNA序列的正常表達(dá)。反義核苷酸序列編碼的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可與靶基因轉(zhuǎn)錄生成的內(nèi)源mRNA互補，并可與其雜交，由此，靶基因編碼的天然蛋白的合成就受到限制，從而獲得相應(yīng)的表型。 下面通過具體實施方式
，結(jié)合附圖對本發(fā)明做進ー步詳細(xì)描述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。


圖I是表達(dá)載體pHPG的T-DNA區(qū)圖譜。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界；hpt表不潮霉素抗性基因；Pnos表不nos基因的啟動子；Tnos表不nos基因的終止子；⑶S表示gus蛋白基因；T35s表示35s基因的終止子；HindIII和BamHI分別表示限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI的酶切位點；花特異啟動子即為本發(fā)明所分離鑒定的花器官特異表達(dá)啟動子。圖2是KT631P轉(zhuǎn)基因水稻的組織器官⑶S染色。A為葉片；B為莖；C為根；D為花器官；E為種子。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海英駿生物技術(shù)公司合成,測序由北京華大基因完成，PCR試劑盒、載體構(gòu)建過程中的核酸內(nèi)切酶購自寶生物工程有限公司，pEASY-ΤΙ連接試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)公司，T4 DNA連接酶購自PiOmega公司，方法均參照試劑盒提供的方法進行。實驗中所用的載體pHPG由本實驗改造所得，基本骨架來自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。I.啟動子KT631P的分離和鑒定 設(shè)計克隆啟動子KT631P所需引物
引物 I :5，_ aagcttTTAATAGAATATTACCCCATCGTC _3，
引物 2 :5’- ggatccGCCCACCCCCTCCTCCTCG _3’
弓丨物I中序列aagctt為HindIII的酶切位點，弓丨物2中序列g(shù)gatcc為BamHI的酶切位點。利用啟動子的正反向引物(其中帶下劃線部分的序列為啟動子序列，如Seq IDNO: I所示)，以植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取的水稻(中花11)基因組DNA作為模板，進行擴增，反應(yīng)條件是95°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸I分鐘；30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，產(chǎn)物連入pEASY-Tl，篩選陽性克隆并進行測序驗證，結(jié)果表明所擴增序列為預(yù)期的KT631P啟動子序列。2.構(gòu)建表達(dá)載體
將測序驗證已經(jīng)插入KT631P啟動子序列的質(zhì)粒用HindIII和BamHI雙酶切，連入同樣用HindIII和BamHI雙酶切的載體pHPG，挑取菌落PCR結(jié)果為陽性的菌落進行測序，測序驗證正確后，提取相應(yīng)陽性克隆質(zhì)粒，命名為pHPG-KT631P。菌落PCR檢測所需引物
引物 3 :5，- TCTCCGCTCATGACGATAAT -3，
引物 4:5，- GACGTAACATGGTGAAGGGG -3，
引物3和引物4為pHPG載體上引物，位于所克隆的啟動子片段兩側(cè)，擴增片段約為啟動子的長度，以菌液為模板，擴增檢測，PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸I分鐘；34個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。所構(gòu)建的表達(dá)載體的T-DNA區(qū)的圖譜如圖I所示，其中LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界；hpt表不潮霉素抗性基因；Pnos表不nos基因的啟動子；Tnos表不nos基因的終止子AUS表示gus蛋白基因；T35S表示35S基因的終止子；HindIII和BamHI分別表示內(nèi)切HindIII和BamHI的酶切位點；花特異啟動子即為本發(fā)明通過PCR克隆出的花器官特異表達(dá)啟動子。3.農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化
利用熱激法將質(zhì)粒PHPG-KT631P轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGLO菌株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對水稻進行共轉(zhuǎn)化。4.功能鑒定
從轉(zhuǎn)基因植株中分離各組織器官，進行⑶S活性檢測，將各組織器官置于含有⑶S染色緩沖液的EP管中，放于37°C溫箱溫育過夜，然后室溫條件下在無水こ醇中脫色保存。4. I轉(zhuǎn)基因水稻苗的組織器官染色
將水稻KT631P轉(zhuǎn)基因水稻苗的組織器官，如葉片、莖、根和花分別進行⑶S染色，結(jié)果如圖2所示，⑶S基因只在植株的花器官(圖2D)中有很強的表達(dá)，顯現(xiàn)出很強的藍(lán)色，在其它各組織器官中基本沒有檢測到GUS基因的表達(dá)。權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其特征是含有一種啟動子核酸分子，所述啟動子核酸分子具有選自SEQ ID NO :1，或其互補鏈的核酸序列。
2.權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所含的啟動子核酸分子可與異源核苷酸序列操作性相連。
3.權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所含的異源核苷酸序列指天然狀態(tài)下沒有與所述啟動子序列操作性連接的序列，對于植物宿主來說可以是同源或是異源的。
4.權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所含的異源核苷酸序列編碼的基因產(chǎn)物可賦予植物對除草剤、鹽、低溫、干旱、病原體或昆蟲的抗性，或是調(diào)控植物的生長發(fā)育、雄性不育。
5.權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所含的異源核苷酸序列為靶基因的部分同源序列，以RNA干擾技術(shù)的方式抑制植物內(nèi)源或外源基因的表達(dá)。
6.權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞來自單子葉植物。
7.權(quán)利要求6所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述單子葉植物細(xì)胞來自禾本科植物，優(yōu)選為水稻。
8.權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞來自雙子葉植物。
9.權(quán)利要求8所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述雙子葉植物細(xì)胞來自十字花科，優(yōu)選為擬南芥。
10.ー種在植物中表達(dá)核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物體導(dǎo)入DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體含有啟動子及操作性連接于所述啟動子的目的異源核苷酸序列，其中所述啟動子含有的核苷酸序列選自 a)含有SEQID NO : I所示的啟動子核苷酸序列； b)包含的序列與SEQID NO 1所示序列至少有95%序列相似性的啟動子核苷酸序列，其中所述啟動子核苷酸序列可以在植物花器官啟動異源核苷酸序列的特異轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
11.ー種核酸分子，包含選自SEQ ID NO 1的分離的啟動子。
12.—種載體，它含有權(quán)利要求11所述的核酸分子。
13.—種細(xì)胞，它含有權(quán)利要求12所述的載體。
14.權(quán)利要求13所述細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞，或真菌細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14所述細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞來自根瘤土壤桿菌或大腸桿菌。
16.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞為水稻細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物生物工程和植物改良基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個植物花特異表達(dá)啟動子KT631P的功能鑒定和應(yīng)用。本發(fā)明公開了一種在植物體中調(diào)控異源核苷酸序列表達(dá)的方法和DNA構(gòu)建體。該DNA構(gòu)建體包含一個新的植物花特異性表達(dá)啟動子的核苷酸序列，提供了使用本文所公開的花特異啟動子序列在植物花器官優(yōu)先表達(dá)異源核苷酸序列的方法。
文檔編號C12N1/19GK102676457SQ20121015099
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月17日
發(fā)明者吳潔芳, 周君莉, 李早霞 申請人:北京未名凱拓作物設(shè)計中心有限公司