專利名稱：一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶(或稱裂解酶)及其作為抗菌物質(zhì)在預(yù)防奶牛乳房炎和食品污染控制中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎不僅給世界乳品工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還危害到公共衛(wèi)生和人類健康。研究資料顯示，金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌，由此引起的奶牛乳房炎病例達(dá)74%，在我國(guó)病例中該比例高達(dá)90 % -95 %，由此引起的奶產(chǎn)品的損失高達(dá)3. 5億。引起奶牛乳房炎的主要原因是病原微生物感染，其中以金黃色葡萄球菌{Staphyloccus鏈球菌和大腸桿菌為主,約占奶牛乳房炎病例的90%以上。其中SA則是引起乳房炎的最主要病原菌，也是臨床上最難治療造成經(jīng)濟(jì)損失最大的致病菌，可致人或動(dòng)物的各種化膿性疾病、乳腺炎、敗血癥等。奶牛乳房炎最直接的治療途徑是使用抗生素，但治療過程中乳汁會(huì)殘留抗生素，從而會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的危害，更為嚴(yán)重的是，病原會(huì)因抗生素的長(zhǎng)期攝入及高效量的濫用產(chǎn)生耐藥毒力株。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素不僅產(chǎn)生耐藥，且表現(xiàn)為多重耐藥，給臨床治療帶來了巨大困難。噬菌體是一類細(xì)菌依賴性的病毒，又稱細(xì)菌病毒。裂解性噬菌體感染細(xì)菌后，可在宿主菌內(nèi)快速增殖，并使之裂解，故又稱毒性噬菌體。溶壁酶是雙鏈DNA噬菌體所特有的，是在感染宿主晚期由噬菌體表達(dá)的一類肽糖水解酶，該酶通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽糖上糖與肽間的酰胺鍵或肽內(nèi)氨基酸殘基間的連鍵最終使宿主細(xì)胞裂解。溶壁酶不僅特異性作用于宿主，且作用時(shí)間短，作用譜較噬菌體廣。溶壁酶具有高效、特異且不產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，目前在食品及醫(yī)藥行業(yè)已有成功應(yīng)用的報(bào)道。金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶能夠特異性裂解李斯特菌，因而具有殺菌作用。在食品中，金黃色葡萄球菌溶壁酶能夠作為抗菌劑來控制細(xì)菌污染，具有潛在的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼金黃色葡萄球菌曬菌體溶壁酶。技術(shù)方案
一種金黃色葡萄菌噬菌體溶壁酶，其特征在于其氨基酸序列為Seq ID NO. 2。一種金黃色葡萄菌噬菌體溶壁酶的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列為Seq IDNO. I。一種表達(dá)金黃色葡萄菌噬菌體溶壁酶的制備方法，其特征在于步驟I)中采用引物5’ - ATT GGA TCC GGT AGG TGT TGA CCA ATG TTG -3’ 見 Seq ID NO. 3 和引物 5’ - CTTAAG CTTTAA ATC GTG CTA AAC TTA CC -3’見Seq ID NO. 4從金黃色葡萄球菌噬菌體基因組中擴(kuò)增李斯特菌噬菌體溶壁酶基因；
具體步驟如下
1)從金黃色葡萄球菌噬菌體基因組中擴(kuò)增金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶基因；
2)構(gòu)建表達(dá)金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶的重組表達(dá)載體；
3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到表達(dá)金黃色葡萄球噬菌體溶壁 酶的工程菌；
4)異丙基1-1硫代-P呋喃半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組基因表達(dá)產(chǎn)物；
5)將重組基因表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)鎳柱親和層析純化分離，得到重組的金黃色葡萄球噬菌體溶壁酶；
6)將純化的溶壁酶產(chǎn)物經(jīng)去毒素試劑盒進(jìn)行去毒處理即<0. 01 EU/Ug內(nèi)毒素。一種含有所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶的編碼基因的質(zhì)粒。一種含有所述的質(zhì)粒的重組菌
所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶在制備防治奶牛乳房炎藥物的應(yīng)用。所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶在制備抑制金黃色葡萄球菌污染或過度生長(zhǎng)藥物應(yīng)用。所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶在制備抑制金黃色葡萄球污染或過度生長(zhǎng)藥物應(yīng)用，其特征在于所述的食品為由肉類，或蛋類，或奶制品，或糧食，或蔬菜，或它們之間的組合加工的固體或液體類食品。所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶在制備抑制金黃色葡萄球污染或過度生長(zhǎng)藥物應(yīng)用，其特征在于重組表達(dá)的金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶產(chǎn)物制成抗菌劑。所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶在制備抑制金黃色葡萄球污染或過度生長(zhǎng)藥物應(yīng)用，其特征在于將純化的溶壁酶產(chǎn)物與賦形劑復(fù)配后，用來抑制食品中金黃色葡萄球菌的污染。所述原核細(xì)胞表達(dá)載體為pET_28a (+)。所述溶壁酶基因被插入pET_28a (+)的BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)。所述的工程菌為大腸桿菌BL21 (DE3)，培養(yǎng)溫度為37°C。所述誘導(dǎo)表達(dá)所用的誘導(dǎo)劑為IPTG，誘導(dǎo)濃度為0.5 1.0 ymol/L，誘導(dǎo)表達(dá)的溫度為28 30°C。所述的分離純化步驟包括鎳親和層析。有益效果
利用生物工程技術(shù)開發(fā)能夠高效殺滅金黃色葡萄球菌的酶制劑，該制劑可以單獨(dú)或復(fù)配使用，能夠特異性滅活金黃色葡萄球菌，為目前防治奶牛乳房炎及控制食品中金黃色葡萄球菌污染提供一種安全、無毒副作用的酶制劑來源。


圖I溶壁酶LysM9基因的構(gòu)建和鑒定
泳道I :重組質(zhì)粒pET-lysM9 BamHlIII雙酶切鑒定
泳道2 pET28a(+)載體及麗7 I酶切鑒定M: IKb DNA ladder
圖2重組溶壁酶LysM9表達(dá)產(chǎn)物的鑒定分析 泳道 I :誘導(dǎo)表達(dá) DE3(pET-lysM9) I. O mM IPTG 泳道 2 :未誘導(dǎo) DE3 (pET-lysM9)
M:蛋白分子質(zhì)量Maker
圖3重組溶壁酶LysM9對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌能力分析 圖4重組溶壁酶LysM9在食品的中殺菌效果分析
具體實(shí)施例方式本發(fā)明試驗(yàn)用曬菌體宿主菌金黃色葡萄球菌iStaphyloccus aureus, ATCC25923)購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心(ATCC)。\噬菌體基因組快速提取試劑盒(北京艾比根 生物技術(shù)有限公司，AB114)。實(shí)施例I噬菌體分離制備及基因組提取 噬菌體分離制備
本發(fā)明樣品采自江蘇南京西崗奶牛場(chǎng)牛奶樣品，在牛奶樣品中加入Iml金黃色葡萄球菌過夜培養(yǎng)物，再加入無菌CaCl2母液至終濃度I. 25mM混勻后，加入20ml TSB-YE培養(yǎng)基，室溫作用30min，再放置于30°C，待培養(yǎng)至6 8h后，取上述培養(yǎng)物以13000 X g. mirT1，4°C，離心30min，取上清；再用0. 22 y m濾膜過濾上清，形成噬菌體原液。取噬菌體原液0. 1ml，進(jìn)行10倍稀釋，取102、104和IO6稀釋液各0. Iml與過夜培養(yǎng)的宿主菌液0. Iml混勻，室溫作用15min后，加入約5ml 0. 7% LB培養(yǎng)基，混勻后迅速傾倒入TSA-YE平板上層，搖勻平置5min，待其凝固，置于30°C溫箱培養(yǎng)12h后觀察，獲得形成噬菌斑的雙層平板，并命名該噬菌體為BpM-9。噬菌體基因組DNA的提取
將制備的噬菌體原液用X噬菌體基因組快速提取試劑盒方法提取噬菌體基因組，具體按試劑盒說明進(jìn)行。實(shí)施例2 :溶壁酶LysM9基因(7pM9)的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建
a、根據(jù)LysM9基因編碼序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物
M9-1: 5，- ATT GGA TCC GGT AGG TGT TGA CCA ATG TTG -3，，見 SEQ ID NO. 3;
M9-2: 5，- CTT AAG CTTTAA ATC GTG CTA AAC TTA CC -3，，見SEQ ID NO. 4;以噬菌體基因組為模板用上述特異性引物擴(kuò)增LysM9基因全長(zhǎng)序列，1%瓊脂糖電泳，鑒定擴(kuò)增片段的大??；
b、切膠回收(I.5kb片段)擴(kuò)增正確的目的片段，膠回收試劑盒將片段純化回收，并將該片段與PMD18-T載體于16°C連接過夜，次日轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素(100 u g/ml)的平板，并將轉(zhuǎn)化的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，將其命名為溶壁酶LysM9基因，其核苷酸序列為Seq ID NO. I ；
c、將測(cè)序列正確的片段用限制性內(nèi)切酶及IWndIII進(jìn)行雙酶切，37°C，水浴孵育2 h，l%瓊脂糖電泳，膠回收試劑盒將片段純化回收，并將該片段與pET28a(+)載體于16°C連接過夜，次日轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的菌液涂布于含有卡那青霉素(100 U g/ml)的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜；d、陽性克隆的鑒定挑取陽性克隆接種于含卡那青霉素(100 u g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過夜后，堿裂法提取質(zhì)粒，用及_7 I和III進(jìn)行雙酶切鑒定，同時(shí)用BamH I單酶切的pET_28a(+)空質(zhì)粒作為對(duì)照。將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET_lysM9，重組菌命名為 DE3 (pET-lysM9)。
結(jié)果如圖I所示，重組質(zhì)粒pET_lysM9用BamH I和歷進(jìn)行雙酶切后，分別在5. 4kb和1.5 kb處出現(xiàn)pET28a(+)載體帶和7j^M9基因帶，大小與預(yù)期相符，表明構(gòu)建正確。實(shí)施例3 溶壁酶LysM9蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
將重組菌DE3(pET-lysM9)接種到含卡那青霉素(100 u g/mL)的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)；次日，按1:100比例轉(zhuǎn)接至IOOmL LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D_值約為0. 5時(shí)，加入IPTG至終濃度lmmol/L，28°C誘導(dǎo)5 h。收集菌體，超聲波破碎細(xì)胞，4°C，
10,000rpm/min離心IOmin,收集上清,并將上清經(jīng)0. 22 u m濾膜過濾,SDS-PAGE分析裂解上清中的蛋白表達(dá)情況。將過濾的裂解上清用His親和層析鎳柱(GE Healthcare, Sweden)純化，具體按試劑盒說明步聚進(jìn)行。獲得蛋白命名為溶壁酶lysM9，將純化的溶壁酶lysM9產(chǎn)物經(jīng)去毒素試劑盒(Novagen公司)進(jìn)行去毒處理(彡0.01 EU/u g內(nèi)毒素)。SDS-PAGE分析結(jié)果如圖2所示，重組菌DE3 (pET_lysM9)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其上清中在約60 kD (其中蛋白本身約為53. 8而與his融合表達(dá)后大小約為60kD)的位置有較粗的誘導(dǎo)蛋白條帶，與預(yù)期大小相符，從而表明，重組菌DE3(pET-lysM9)構(gòu)建正確，且表達(dá)的溶壁酶蛋白產(chǎn)物L(fēng)ysM9為可溶性蛋白。 實(shí)施例4 :重組溶壁酶LysM9特異性裂解金黃色葡萄球菌
將金黃色葡萄球菌ATCC 25923培養(yǎng)至OD6tltl=O. 8，用PBS洗滌后重懸，取900 yl，加入100 u I (50 u g)純化的溶壁酶產(chǎn)物，混勻，室溫下作用lh，用分光光度計(jì)動(dòng)態(tài)測(cè)定菌液的OD600值，OD600的下降表明細(xì)菌被裂解。結(jié)果如圖3所示，純化的溶壁酶LysM9產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好的裂解活性。實(shí)施例5 :溶壁酶LysM9在食品中的滅菌作用
將巴氏殺菌牛奶分裝為兩組，A組接種宿主菌IO5 cfu/mL，加入IOOyg的溶壁酶LysM9蛋白；B組中僅加入IO5 cfu/mL宿主菌作為對(duì)照，同時(shí)設(shè)PBS對(duì)照。將制備好的樣品分別置于25°C,分別于0min,30min和60min檢測(cè)宿主菌數(shù)量。結(jié)果如圖4所示，25 °C作用30min后，宿主菌數(shù)量有所下降；至60min后，宿主菌數(shù)量下降約4 Iogltl，與對(duì)照組呈顯著性差異，從而表明溶壁酶LysM9在食品中有良好的殺菌作用。實(shí)施例6溶壁酶LysM9在防治奶牛乳炎中的抗菌效果
選自某奶牛場(chǎng)已診斷為患乳牛乳房炎病牛15頭，隨機(jī)分為3組。A組為溶壁酶治療組先擠干奶，再將乳房洗凈擦干后用含有溶壁酶LysM9的溶液(500 u g/50ml)直接涂擦患病乳區(qū)。B組抗生素治療組將青霉素160萬單位和鏈霉素80萬單位直接乳房灌注。C組為對(duì)照組，僅洗凈擦干，不用任何藥物。A組及B組用藥均為每天早晚各2次，連用5天為一個(gè)療程。療效判定用藥I療程后，根據(jù)臨床癥、乳汁質(zhì)量以及體細(xì)胞數(shù)進(jìn)行判斷。(I)治愈乳房紅、腫、熱、痛消失，乳汁肉眼觀察正常，產(chǎn)奶量回升，體細(xì)胞數(shù)顯著降低；
(2)基本治愈乳房紅、腫、熱、痛明顯減輕，但剛開始擠出的乳汁中還有少許奶塊或絮狀物，產(chǎn)奶量逐漸回升，體細(xì)胞數(shù)下降；
治愈與基本治愈之和為總有效率；
(3)無效乳房紅、腫、熱、痛無明顯好轉(zhuǎn)，乳汁中仍有發(fā)黃或絮狀物存在，產(chǎn)奶量無回升甚至下降，體細(xì)胞數(shù)無顯著下降或有上升趨勢(shì)。由表I可以看出，經(jīng)溶壁酶治療的A組，體細(xì)胞數(shù)與初始數(shù)量比較顯著下降出組 與初始體細(xì)胞數(shù)比較，無顯著差異；而對(duì)照組中，體細(xì)胞數(shù)沒有顯著變化，且隨著乳房炎的發(fā)病而有所上升。通過臨床癥狀乳房紅、腫、熱、痛以及乳汁的觀察以及體細(xì)胞數(shù)的綜合判斷，治療效果見表2，A組中2頭治愈，2頭基本治愈，I頭治療無效，總有效率為80% ；B組中總有效率為40% ;對(duì)照組癥狀無明顯減輕且有加重。因此可見，溶壁酶LysM9能夠有防治奶乳牛乳房炎，而抗生素組由于病原的耐藥特性而不能有效治療奶牛乳房炎。表I不同藥物治療奶牛乳房炎病牛的體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)結(jié)果_
組別治療藥物治療前體細(xì)胞數(shù)(萬/ml) 治療后體細(xì)胞數(shù)(萬/ml)
A i容壁酶 T5l.0±35.148.5±35.1
B W鏈霉素巧.5±56. 784. 5±46. 7
C 丨對(duì)照無 |95.0±42.7丨105.0±39.4
表2不同藥物治療奶牛乳房炎病牛的療效___
I且別I治療藥物 I治療頭數(shù) I治愈頭數(shù) I基本治愈頭數(shù) I無效頭數(shù) I總有效率(％)—
A 溶壁酶 5 —2 —2I80~
B~青鏈霉素_ 5II— 340
c Imm Is|o|oIs|o
權(quán)利要求
1.一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶，其特征在于其氨基酸序列為Seq ID NO. 2。
2.一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列為Seq IDNO. I。
3.一種含有權(quán)利要求2所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶的編碼基因的質(zhì)粒。
4.一種含有權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒的重組菌。
5.—種表達(dá)李斯特菌噬菌體溶壁酶的制備方法，其特征在于步驟I)中采用引物5’ -ATT GGA TCC GGT AGG TGT TGA CCA ATG TTG _3，和引物 5，- CTT AAG CTTTAA ATC GTGCTA AAC TTA CC _3’從金黃色葡萄球菌噬菌體基因組DNA中擴(kuò)增金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶基因； 具體步驟如下 從金黃色葡萄球菌噬菌體基因組中擴(kuò)增金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶基因； 構(gòu)建表達(dá)金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶的重組表達(dá)載體； 將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到表達(dá)金黃色葡萄球噬菌體溶壁酶的工程菌； 異丙基1-1硫代-0呋喃半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組基因表達(dá)產(chǎn)物； 將重組基因表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)鎳柱親和層析純化分離，得到重組的金黃色葡萄球噬菌體溶壁酶； 將純化的溶壁酶產(chǎn)物經(jīng)去毒素試劑盒進(jìn)行去毒處理即< 0. 01 EU/Ug內(nèi)毒素。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶在制備防治奶牛乳房炎藥物的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶在制備抑制金黃色葡萄球菌污染或過度生長(zhǎng)藥物的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶在制備抑制金黃色葡萄球污染或過度生長(zhǎng)藥物應(yīng)用，其特征在于所述的食品為由肉類，或蛋類，或奶制品，或糧食，或蔬菜，或它們之間的組合加工的固體或液體類食品。
全文摘要
本發(fā)明涉及屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶(或稱裂解酶)及其作為抗菌物質(zhì)在奶牛乳房炎防治和食品污染控制中的應(yīng)用；一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶，其特征在于其氨基酸序列為SeqIDNO2。利用生物工程技術(shù)開發(fā)能夠高效殺滅金黃色葡萄球菌的酶制劑，該制劑可以單獨(dú)或復(fù)配使用，能夠特異性的滅活金黃色葡萄球菌，為目前防治奶牛乳房炎和控制食品中金黃色葡萄球菌污染提供一種安全、無毒副作用的酶制劑來源。
文檔編號(hào)C12N9/88GK102676490SQ20121015789
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者包紅朵, 張輝, 王冉 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院