專利名稱：大豆生育期e1-fs基因及其編碼蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及大豆生育期el-fs基因及其編碼蛋白。
背景技術：
El基因位于著絲 點附近，自Bernard (1971)年報道以來，人們一直沒有克隆出其功能基因。由于該基因位于近著絲點(pericentromeric region),遺傳重組率較低，不利于采用圖位克隆法克隆出該基因，在發(fā)明專利(一種大豆生育期El基因及其編碼蛋白，專利申請?zhí)枮?01210112662. 9)中，公布出El基因序列及其相應的蛋白序列后，證明大豆生育期El基因具有強烈抑制大豆開花的生理功能。其蛋白質序列雖然并不能鑒定出B3結構域，但是與B3結構域基因具有遠緣的關系。B3結構域基因是一類較為保守的植物特有的轉錄因子，一般只有100-120氨基酸，常與其他結構域共同起作用。B3結構域中含有與DNA相結合的特殊位點，一般與DNA分子的大溝起作用。在含有B3結構域的蛋白質對抗逆性反應、植物的生長與發(fā)育等諸多方面起重要作用。同時，El基因具有一個核定位信號，其特征為親核蛋白一般都含有的能保證整個蛋白質能夠通過核孔復合體被運到細胞核內的特殊的短肽氨基酸序列。在大豆栽培品種中，其El基因的突變如何影響著大豆生育期(開花期及成熟期)是一個非常重要的科學問題，目前還沒有在分子水平上的相關研究報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供大豆生育期el-fs基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的大ii生育期el-fs基因的基因序列如序列表Seq ID No:l所不。本發(fā)明的大豆生育期el-fs基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所示。本發(fā)明的大豆生育期el-fs基因是大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9)的突變型基因。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明是在克隆出大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662.9)的基礎上，進一步對El基因序列進行深入系統(tǒng)的研究。由于在大豆中具有典型的B3基因結構域基因，本基因是代表一類新型的基因家族，我們已證實El基因可以代表著El位點的功能，即具有抑制大豆開花的功能。本發(fā)明對不同品種及近等基因系中El基因序列進行了研究，并確定了 el-fs基因，其對大豆生育期關系密切。el-fs基因是在大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9)核苷酸序列48bp處發(fā)生了單堿基缺失,在AA 16至41之間形成移碼(frameshift),在第42位形成了終止子(見序列表Seq ID No 2)0細胞定位研究發(fā)現(xiàn)，該基因因移碼而造成了沒有任何信號出現(xiàn)在細胞核或細胞質中。具有el-fs基因的品種表現(xiàn)為開花特早，在長日照條件下具有el-fs基因的品種或品系與短日照條件下的開花天數相當，大約為30天左右，說明具有el-fs品種幾乎喪失了對光周期的敏感性。坂本早生(Sakamotowase)及其衍生品種是具有el-fs基因型的典型品種。


圖I為el-fs基因電泳圖，其中，I號為鐵莢四粒丑，2號為長農14,3號為Kariyutaka, 4號為鐵莢子，5號為長農18,6號為坂本早生(Sakamotowase), 7號為小金黃，8號為長農4 ；圖2為GFP未融合el-fs基因的瞬時表達載體結構示意圖；圖3為GFP融合el-fs基因的瞬時表達載體結構示意圖；圖4為GFP未融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡GFP通道下的亞細胞定位影像圖；圖5為GFP未融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡chlorophyll通道下的亞細胞定位影像圖；圖6為GFP未融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡明視野下的亞細胞定影像位圖；圖7為GFP未融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡GFP通道、chlorophyll通道與明視野融合后的亞細胞定位影像圖；圖8為GFP融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡GFP通道下的亞細胞定位影像圖；圖9為GFP融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡chlorophyll通道下的亞細胞定位影像圖；圖10為GFP融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡明視野下的亞細胞定位影像圖；圖11為GFP融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡GFP通道、chlorophyll通道與明視野融合后的亞細胞定位影像圖；圖12 :大豆品種坂本早生(Sakamotowase)在長日照16小時光照/8小時黑暗條件下，出苗后32天照片，其中，箭頭所指的是已開放的大豆花朵；圖13具大豆生育期El基因的大豆品種Harosoy-El在長日照16小時光照/8小時黑暗條件下，出苗后32天的照片。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式的大豆生育期el-fs基因的基因序列如序列表SeqID No 1 所示。本實施方式是在克隆出大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662.9)的基礎上，進一步對El基因序列進行深入系統(tǒng)的研究。由于在大中具有典型的B3基因結構域基因，本基因是代表一類新型的基因家族，我們已證實EI基因可以代表著EI位點的功能，即具有抑制大豆開花的功能。本實施方式對不同品種及近等基因系中El基因序列進行了研究，并確定了 el-fs基因，其對大豆生育期關系密切。el-fs基因是在大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9)核苷酸序列48bp處發(fā)生了單堿基缺失,在AA 16至41之間形成移碼(frameshift),在第42位形成了終止子(見序列表Seq ID No 2)0細胞定位研究發(fā)現(xiàn)，該基因因移碼而造成了沒有任何、信號出現(xiàn)在細胞核或細胞質中。具有el-fs基因的品種表現(xiàn)為開花特早，在長日照條件下具有el-fs基因的品種或品系與短日照條件下的開花天數相當，大約為30天左右，說明具有el-fs品種幾乎喪失了對光周期的敏感性。坂本早生(Sakamotowase)及其衍生品種是具有el-fs基因型的典型品種。
具體實施方式
二 本實施方式的大豆生育期el-fs基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No :2所示。本實施方式是在克隆出大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662.9)的基礎上，進一步對El基因序列進行深入系統(tǒng)的研究。由于在大中具有典型的B3基因結構域基因，本基因是代表一類新型的基因家族，我們已證實EI基因可以代表著EI位點的功能，即具有抑制大豆開花的功能。本實施方式對不同品種及近等基因系中El基因序列進行了研究，并確定了 el-fs基因，其對大豆生育期關系密切。el-fs基因是在大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9)核苷酸序 列48bp處發(fā)生了單堿基缺失,在AA 16至41之間形成移碼(frameshift),在第42位形成了終止子(見序列表Seq ID No 2)0細胞定位研究發(fā)現(xiàn)，該基因因移碼而造成了沒有任何信號出現(xiàn)在細胞核或細胞質中。具有el-fs基因的品種表現(xiàn)為開花特早，在長日照條件下具有el-fs基因的品種或品系與短日照條件下的開花天數相當，大約為30天左右，說明具有el-fs品種幾乎喪失了對光周期的敏感性。坂本早生(Sakamotowase)及其衍生品種是具有el-fs基因型的典型品種。通過以下試驗驗證本發(fā)明的效果(I)基因el-fs序列的獲得取長至三葉真葉期的待測品種坂本早生(Sakamotowase)葉片,采用CTAB法提取葉片基因組DNA ；以提取的DNA為模板通過Kl與K2引物，采用購買自Takara公司的高保真酶primerSTAR HS擴增el-fs基因，PCR反應條件如下94°C預變性10min，94°C變性30s，60°C退火15s，72°C延伸lmin，共30循環(huán)，再72°C延伸7min，將PCR產物在ABI3130測序儀(ABI公司)上進行測序。測序結果表明大豆生育期el-fs基因具有序列表中Seq ID No 1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No 1由524個堿基組成，并編碼具有序列表中Seq ID No 2的氨基酸序列的蛋白質。(2) el-fs基因的鑒定一、取長至三葉真葉期的待測品種葉片，采用CTAB法提取葉片基因組DNA ;二、以步驟一提取的50ng基因組DNA為模板，以Fl和F2為引物采用購買自Takara公司的HinfI酶進行擴增，PCR反應條件如下95°C預變性3min ;95°C變性20s，58°C退火30s，72°C延伸40s，共32個循環(huán)，再72°C延伸7min ;三、取經步驟二 PCR的產物約8 yl (濃度為300ng/U I)，用滅菌水稀釋I倍后，經HinfI限制性內切酶(購買自Takara公司)，在37° C溫度下，消化3h ;四、然后將步驟三酶切后的產物，采用13%非變性PAGE膠電泳進行檢測；其中，步驟一所述的待測品種I至8號分別為鐵莢四粒豆，長農14，Kariyutaka，鐵莢子，長農18，坂本早生(Sakamotowase),小金黃,長農4。電泳結果如圖I所示，由圖I可知，其中1、2、3、4、5、7和8品種僅出現(xiàn)三條條帶(A，B與C表示，即只有二個酶切位點),為大豆生育期El基因；而6號坂本早生(Sakamotowase)品種出現(xiàn)四條帶型(A，B，D，E表示，即有三個酶切位點)即可為HinfI消化的el-fs基因型。(3) el-fs基因的功能分析一、大豆品種帶有el-fs基因的表型分析為進一步驗證el-fs基因型的功能， 將帶有el-fs基因的坂本早生(Sakamotowase)品種與帶有大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662.9)的Harosoy-El品種，種植在人工培養(yǎng)箱中(人工控制日照長度長日照為16小時光照/8小時黑暗，中等長照為13. 5小時/9. 5小時，短日照條件為12小時光照/12小時黑暗)，光源為熒光燈與白熾燈，其光強為235 270iimol s—1 m_2，同時，在自然光照的田間種植，觀察品種從出苗到開花的天數。結果如表I所示，從表I中可以看出，在短日照(12小時光照/12小時黑暗)條件下，含有大豆生育期El基因的Harosoy-El品種與含有el_fs基因的坂本早生(Sakamotowase)品種開花天數(從播種到開花)相當，大約30天左右；而在長日照條件(16小時光照/8小時黑暗)下,含有el-fs基因的坂本早生(Sakamotowase)品種為30天左右(圖12)，而Harosoy-El品種為73天(圖13)，在中等長照強度(13. 5小時光照/9. 5小時黑暗)及田間的效果，坂本早生(Sakamotowase)品種開花期與短日照相當，說明el_fs品種缺失了對大豆不同光周期長度的敏感性。表I不同El基因型品種的開花期
從出苗至開花期
品種名基因型人工氣候箱# 田間(自然光照條 __12L/12D 14.5U9.5D 16U8D件)_
__E1______
ff黃豆
(Aokimame)__E±__31^0__nj.__106.0__S96_
「00411北兄小懲豆
(Peking)__El____65,0__98,0__55.2
Bay__E±__29,5__ird,__75,0__60.0
Harosoy-E/__E±__3^0__51^__73,0__46.4
Enrei__E1___ad,__510__7^,0__49.0
__e1-fs_____
坂木早4:
(Sakamotowase)__e1-fs__29.0__31.0__30.0__29.7_
_9E_ e1-fs29.0n.d.32.0n.d.注n. d. (not done)沒有進行相應的試驗；L=Light (光照長度)；D=Dark (黑暗長度)二、大豆生育期El基因核定位研究一、提取大ii Sakamoto品種(從日本生物資源研究所基因庫購頭得到)的DNA,并以其為模板，以Kl與K2為引物，采用購買自Takara公司的高保真酶primerSTARHS擴增el-fs基因，PCR反應條件如下94°C預變性10min，94°C變性30s，60°C退火15s，72°C延伸Imin，共30循環(huán)，再72°C延伸7min ;二、將步驟一獲得的產物采用ClaI酶SpeI酶進行酶切，然后將酶切片段克隆到PBSK質粒中，形成一個CaMV 35S啟動子驅動的el-fs與eGFP融合體質粒(即 CaMV 35S el-fs :eGFP);三、制備擬南芥原生質體(Arabidopsis protoplasts)；四、將步驟三得到CaMV 35S el-fs :eGFP質粒通過氯化鈣聚乙二醇法轉染擬南芥原生質體(Arabidopsis protoplasts),同時，將不含有 el-fs 的 pBSK (CaMV 35S :eGFP)質粒作為對照組，通過氯化鈣聚乙二醇法轉染擬南芥原生質體，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察；其中，pBSK質粒購買自Stratagene公司；擬南芥原生質體(Arabidopsis protoplasts)制備方法如下一、配制纖維素酶消化液，消化液各組分的配比1. 25%(w/v)的纖維素酶R10，0. 3%(w/v)的離析酶R10，0. 4M/L的甘露醇，20mM/L的KCl，20mM/L的MES (pH=5. 7)，混合均勻后在55°C溫度下加熱lOmin，再加入終濃度為10mM/L CaCl2溶液，5mM/L的P -巰基乙醇和0. 1% (w/v) BSA ;二、取三至四周齡未抽苔的擬南芥蓮座葉片，切成約0. 5mmXO. 5mm的形狀，然后浸沒于步驟一制得的消化液中，然后在黑暗放置3h，再用200目篩網過濾，收集濾過液并置于離心管中以IOOg/min的速度離心2min,去上清,用預冷的W5的溶液重懸清洗,再次以100g/min的速度離心后，收集沉淀用W5重懸并于冰上放置30min，再次以100g/min的速度離心，收集沉淀，用 ImL MMg溶液重懸，即得擬南芥原生質體(Arabidopsis protoplasts);其中，W5的組成為154mM/L 的 NaCl, 125mM/L 的 CaCl2, 5mM/L 的 KCl 和 2mM/L 的 MES 緩沖液(pH=5. 7) ;MMg 的配比為0. 4M/L的甘露醇，15mM/MgCl2溶液和4mM/L的MES。氯化鈣聚乙二醇法方法具體步驟如下一、分別取10 ill的質粒(CaMV35S: el-fs: eGFP與CaMV 35S: eGFP，質粒濃度約為lyg/yL)加入IOOyl的制備好的擬南芥原生質體中，再加入110 ill的PEG-CaCl2溶液，吹吸混勻，轉化20min ;二、轉化完后，加入440 ill的W5溶液混勻后，然后以100g/min的速度離心3min，去上清后加入ImL的W5溶液過夜培養(yǎng)16h,即完成;其中，PEG-CaCl2是由4g的PEG4000,3mL的H2O, 2. 5mL的0. 8M/L甘露醇，ImL的1M/L CaCl2溶液制成；W5的組成為154mM/L的NaCl溶液，125mM/L的CaCl2溶液，5mM/L的KCl溶液和2mM/L的MES緩沖液(pH=5. 7)。在激光共聚焦顯微鏡下觀察擬南芥原生質體不同器官中大豆生育期el-fs基因的分布，從圖4至圖7中可見，不帶有el-fs基因的對照載體，在細胞的細胞核及細胞質中均有分布，從圖8至11中可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的el-fs基因，在細胞核內未觀察到任何信號，說明el-fs基因并不具有核定位功能。說明el-fs基因的突變改變了原有大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662.9)的核定位功能，使本發(fā)明的el-fs基因較大豆生育期El基因具有不完全抑制大豆開花的功能。在上述試驗中所述的Harosoy-El和Harosoy-el來源于美國農業(yè)部基因種質庫(the USDA-ARS National Plant Germplasm System)的統(tǒng)一入庫編號，分別為 PI547707 和 PI547676 ；Harosoy-EU Harosoy-el、Williams 82、Bay、Enrei、9E、坂本早生(Sakamotowase)和Kariyutaka等從日本生物資源研究所基因庫購買得到。其他品種長農14,鐵莢子,長農18,小金黃,長農4,小粒秣食S 和中黃39從吉林省農業(yè)科學院大S 研究中心是購買得到。
權利要求
1.大豆生育期el-fS基因，其特征在于大豆生育期el-fs基因的基因序列如序列表SeqID No 1 所示。
2.如權利要求I所述的大豆生育期el-fs基因的編碼蛋白，其特征在于大豆生育期el-fs基因編碼蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
全文摘要
大豆生育期e1-fs基因及其編碼蛋白，它涉及一種大豆生育期e1-fs基因。本發(fā)明提供了大豆生育期e1-fs基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的大豆生育期e1-fs基因的基因序列如序列表Seq ID No1所示。本發(fā)明的大豆生育期e1-fs基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No2所示。本發(fā)明通過品種的相關的遺傳及分子功能驗證，e1-fs基因與E1基因相比，具有顯著的促進開花的功能。
文檔編號C12N15/29GK102732529SQ201210162188
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月23日 優(yōu)先權日2012年5月23日
發(fā)明者劉寶輝, 呂世翔, 吳紅艷, 夏正俊, 孔凡江, 翟紅 申請人:中國科學院東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所