專利名稱：大豆生育期e1-as基因及其編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大豆生育期el-as基因及其編碼蛋白。
背景技術(shù)：
El基因位于著絲點附近，自Bernard (1971)年報道以來，人們一直沒有克隆出其功能基因。由于該基因位于近著絲點(pericentromeric region),遺傳重組率較低,不利于采用圖位克隆法克隆出該基因，在發(fā)明專利名稱一種大豆生育期El基因及其編碼蛋白，專利申請?zhí)枮?01210112662.9中，公布出El基因序列及其相應(yīng)的蛋白序列后，證明大豆生育期El基因具有強(qiáng)烈抑制大豆開花的生理功能。其蛋白質(zhì)序列雖然并不能鑒定出B3結(jié)構(gòu)域，但是與B3結(jié)構(gòu)域基因具有遠(yuǎn)緣的關(guān)系。B3結(jié)構(gòu)域基因是一類較為保守的植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，一般只有100-120氨基酸，常與其他結(jié)構(gòu)域共同起作用。B3結(jié)構(gòu)域中含有與DNA相結(jié)合的特殊位點，一般與DNA分子的大溝起作用。在含有B3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)對抗逆性反應(yīng)、植物的生長與發(fā)育等諸多方面起重要作用。同時，El基因具有一個核定位信號，其特征為親核蛋白一般都含有的能保證整個蛋白質(zhì)能夠通過核孔復(fù)合體被運到細(xì)胞核內(nèi)的特殊的短肽氨基酸序列。在大豆栽培品種中，其El基因的突變?nèi)绾斡绊懼蠖股?開花期及成熟期)是一個非常重要的科學(xué)問題，目前還沒有在分子水平上的相關(guān)研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供大豆生育期el-as基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的大ii生育期el-as基因的基因序列如序列表Seq ID No:l所不。本發(fā)明的大豆生育期el-as基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所示。本發(fā)明的大豆生育期el-as基因是大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9)的突變型基因。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明是在克隆出大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662.9)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對El基因序列進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。由于在大豆中具有典型的B3基因結(jié)構(gòu)域基因，本基因是代表一類新型的基因家族，我們已證實El基因可以代表著El位點的功能，即具有抑制大豆開花的功能。本發(fā)明對不同品種及近等基因系中El基因序列進(jìn)行了研究，并確定了 el-as基因，其對大豆生育期關(guān)系密切。el-as基因與大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9)相比，兩者的序列在DNA水平的僅有一個核苷酸(44號)差異，該核苷酸對核定位信號有很大的影響，el-as基因在氨基酸序列15從精氨酸到蘇氨酸的錯義突變，該區(qū)域為核定位信號的第一個結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列13 16上的KKRK)上(見序列表Seq ID No :1)。
el-as基因與大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9)相比，本發(fā)明的el-as基因在關(guān)鍵的核定位信號上有一個堿基差異，并改變了原來El基因的功能，使其抑制大豆開花的功能明顯減弱(見發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9公開內(nèi)容)，因此本發(fā)明的el-as基因較大豆生育期El基因具有促進(jìn)大豆開花的功能，即抑制開花不徹底，具有該功能的基因被稱為滲漏(leaky)基因型，即該基因型尚有部分抑制開花功能，并非功能全失。本發(fā)明的el-as基因具有對大豆光周期的不敏感性，使具有該基因的品種能在長日照條件下，開花期較為適中的特點，是我國大豆甚至世界大豆品種栽培中最為重要的一類基因，比如在Harosoy、William82及我國的合豐55等都為el_as基因型。


圖lel-as基因酶切后電泳結(jié)果圖片,其中I號為中黃13,2號為合豐55,3號為淮ii4 號，4 號為徐 14,5 號為 Harosoy-El, 6 號為 Sakamotowase, 7 號為中黃 39 ;M 為 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品(0X174 -HaeIII)；圖2為GFP未融合el-as基因的瞬時表達(dá)載體結(jié)構(gòu)不意圖；圖3為GFP融合el-as基因的瞬時表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為GFP未融合el-as基因的激光共聚焦顯微鏡GFP通道下的亞細(xì)胞定位影像圖；圖5為GFP未融合el-as基因的激光共聚焦顯微鏡chlorophyll通道下的亞細(xì)胞定位影像圖；圖6為GFP未融合el-as基因的激光共聚焦顯微鏡明視野下的亞細(xì)胞定影像位圖； 圖7為GFP未融合el-as基因的激光共聚焦顯微鏡GFP通道、chlorophyll通道與明視野融合后的亞細(xì)胞定位影像圖；圖8為GFP融合el-as基因的激光共聚焦顯微鏡GFP通道下的亞細(xì)胞定位影像圖；圖9為GFP融合el-as基因的激光共聚焦顯微鏡chlorophyll通道下的亞細(xì)胞定位影像圖；圖10為GFP融合el-as基因的激光共聚焦顯微鏡明視野下的亞細(xì)胞定位影像圖；圖11為GFP融合el-as基因的激光共聚焦顯微鏡GFP通道、chlorophyll通道與明視野融合后的亞細(xì)胞定位影像圖；圖12 :大豆品種Harosoy在長日照16小時光照/8小時黑暗條件下，出苗后55天照片，其中，箭頭所指的是已開放的大豆花朵；圖13具大豆生育期El基因的大豆品種Harosoy-El在長日照16小時光照/8小時黑暗條件下，出苗后55天的照片。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式的大豆生育期el-as基因的突變基因序列如序列表Seq ID No 1 所示。本實施方式是在克隆出大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662.9)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對El基因序列進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。由于在大中具有典型的B3基因結(jié)構(gòu)域基因，本基因是代表一類新型的基因家族，我們已證實EI基因可以代表著EI位點的功能，即具有抑制大豆開花的功能。本實施方式對不同品種及近等基因系中El基因序列進(jìn)行了研究，并確定了 el-as基因，其對大豆生育期關(guān)系密切。el-as基因與大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9)相比，兩者的序列在DNA水平的僅有一個核苷酸(44號)差異，該核苷酸對核定位信號有很大的影響，在氨基酸序列15從精氨酸到蘇氨酸的錯義突變，該區(qū)域為核定位信號的第一個結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列13 16上的KKRK)上(見序列表Seq ID No :1)。el-as基因與大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9)相比，本實施方式的el-as基因在關(guān)鍵的核定位信號上有一個堿基差異，并影響改變了原來El基因的 功能，使其抑制大豆開花的功能明顯減弱(見發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9公開內(nèi)容)，因此本實施方式的el-as基因較大豆生育期El基因具有促進(jìn)大豆開花的功能，即抑制開花不徹底，具有該功能的基因被稱為滲漏(leaky)基因型，即該基因型尚有部分抑制開花功能，并非功能全失。本實施方式的el-as基因具有對大豆光周期的不敏感性，使具有該基因的品種能在長日照條件下，開花期較為適中的特點，是我國大豆甚至世界大豆品種栽培中最為重要的一類基因，比如在Harosoy、William82及我國的合豐55等都為el_as基因型。
具體實施方式
二 本實施方式的大豆生育期el-as基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No :2所示。本實施方式是在克隆出大豆生育期基因El (發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對El基因序列進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。由于在大中具有典型的B3基因結(jié)構(gòu)域基因，本基因是代表一類新型的基因家族，我們已證實EI基因可以代表著EI位點的功能，即具有抑制大豆開花的功能。本實施方式對不同品種及近等基因系中El基因序列進(jìn)行了研究，并確定了 el-as基因，其對大豆生育期關(guān)系密切。el-as基因與大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9)相比，兩者的序列在DNA水平的僅有一個核苷酸(44號)差異，該核苷酸對核定位信號有很大的影響，在氨基酸序列15從精氨酸到蘇氨酸的錯義突變，該區(qū)域為核定位信號的第一個結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列13 16上的KKRK)上(見序列表Seq ID No :1)。el-as基因與大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9)相比，本實施方式的el-as基因在關(guān)鍵的核定位信號上有一個堿基差異，并影響改變了原來El基因的功能，使其抑制大豆開花的功能明顯減弱(見發(fā)明專利申請?zhí)?01210112662. 9公開內(nèi)容)，因此本實施方式的el-as基因較大豆生育期El基因具有促進(jìn)大豆開花的功能，即抑制開花不徹底，具有該功能的基因被稱為滲漏(leaky)基因型，即該基因型尚有部分抑制開花功能，并非功能全失。本實施方式的el-as基因具有對大豆光周期的不敏感性，使具有該基因的品種能在長日照條件下，開花期較為適中的特點，是我國大豆甚至世界大豆品種栽培中最為重要的一類基因，比如在Harosoy、William82及我國的合豐55等都為el_as基因型。通過以下試驗驗證本發(fā)明的效果(I)基因el-as序列的獲得—、取長至三葉真葉期的待測大豆Harosoy品種的葉片，采用CTAB法提取葉片基因組DNA ;以提取的DNA為模板通過Kl與K2引物，采用購買自Takara公司的高保真酶primerSTARHS擴(kuò)增El基因，PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性10min，94°C變性30s，60°C退火15s，72°C延伸lmin，共30循環(huán)，再72°C延伸7min，將PCR產(chǎn)物在ABI3130測序儀(ABI公司)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明大豆生育期el-as基因具有序列表中Seq ID No 1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No 1由525個堿基組成，并編碼具有序列表中Seq ID No 2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。(2) el-as基因的鑒定大豆El基因中el-as基因的鑒定方法一、取長至三葉真葉期的待測品種葉片，采用CTAB法提取葉片基因組DNA ;二、以步驟一提取的基因組DNA為模板，F(xiàn)l和F2為引物，采用購買自Takara公司的ExTaq酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下95°C預(yù)變性3min ；95°C變性20s，58°C退火30s，72°C延伸40s，共32個循環(huán)，再72°C延伸7min ;三、取經(jīng)步驟二PCR的產(chǎn)物8iU(濃度為300ng/iil)，稀釋I倍后，經(jīng)TaqI限制性內(nèi)切酶(Takara公司)，在65° C溫度下，消化3h ;四、然后將步驟三酶切后的產(chǎn)物，采用13%非變性PAGE膠電泳進(jìn)行檢測；其中，步驟一所述的待測品種為中黃13，合豐55，淮豆4號，徐豆14，Harosoy-El, Sakamotowase 和中黃 39。電泳結(jié)果如圖I所示，由圖I可知，圖I中1、3、4、5、6和7品種僅出現(xiàn)A號帶，即沒有被TaqI消化的一條帶(444bp)為大豆生育期El基因；而2號合豐55品種出現(xiàn)二條帶型(圖I中B與C所示)，即為可以被TaqI消化成二條帶(414bp與31bp)的為el_as基因。(3) El基因el-as基因的功能分析一、在 2004 年，將大豆的兩個近等位基因系 Harosoy-El (L68-694, Ele2E3E4e5, PI547707)和Harosoy-el (L58-266, ele2E3E4e5, PI 547676)進(jìn)行雜交；二、對雜交后的 13761個F2:5代大豆群體通過圖位克隆法對el-as基因進(jìn)行篩查，篩選出10個重組體，并采用弓I物Cl、C2與Dl、D2對獲得的10個重組體自交后代進(jìn)行鑒定。自交后代開花期的分離情況如表I所示，表I中開花期為品種出苗至開花(第一朵花開放)的天數(shù)，el-as基因與大豆的開花期提前有極顯著的相關(guān)性，與大豆生育期El基因相比，有顯著促進(jìn)開花的功能，含有el-as基因的株系113和株系337其開花期的天數(shù)平均為37. I與36. 4，顯著地早于帶有El基因的株系177、株系268和株系427的51. 6,50. 2和51. 3，之間存在著極顯著差異。同時，在上代為雜合體的株系241、株系306、株系378和株系446，其下一代分離的群體中，含有el-as基因的個體其開花期顯著早于含有El基因的個體。在株系378中，其后代為純合的el/el基因型，其開花期為37. 5，顯著地早于其El/El基因型的50. 8，同時雜合基因型(El/el-as)的開花期46. 7，接近于E1/E1的基因型，說明El基因?qū)l-as基因有部分顯性作用。其中，表中株系為Harosoy-El與Harosoy雜交篩選得到的含有10個重組體的子一代；平均值為開花的天數(shù)；E1基因型中，el/el為純合的el-as基因型，El/el為雜合的El/el-as基因型，E1/E1為純合的El基因型；顯著性測定是用 SigmaPlot (V12. I)中的 ANOVA 進(jìn)行。表I開花期與El基因的關(guān)聯(lián)分析
權(quán)利要求
1.大豆生育期el-as基因，其特征在于大豆生育期el-as基因的基因序列如序列表SeqID No 1 所示。
2.如權(quán)利要求I所述的大豆生育期el-as基因的編碼蛋白，其特征在于大豆生育期el_as基因編碼蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
全文摘要
大豆生育期e1-as基因及其編碼蛋白，它涉及大豆生育期e1-as基因及其編碼蛋白。本發(fā)明提供了大豆生育期e1-as基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的大豆生育期e1-as基因的基因序列如序列表Seq ID No1所示。本發(fā)明的大豆生育期e1-as基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SeqID No2所示。本發(fā)明通過品種的相關(guān)的遺傳及分子功能驗證，e1-as基因與E1基因相比，具有促進(jìn)開花的功能。
文檔編號C12N15/29GK102676543SQ20121016226
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者呂世翔, 吳紅艷, 夏正俊, 翟紅, 陳受宜 申請人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所