專利名稱：高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑及其裂解方法、用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的裂菌制劑的制備方法，具體涉及一種高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑及其裂解方法、用途。
背景技術(shù)：
大腸桿菌主要寄生在人和動物的腸道內(nèi)，大多數(shù)是腸道的正常菌群，但在特定的條件下可成為致病菌，致腸道內(nèi)致病和腸道外致病，表現(xiàn)為腹瀉、出血性腸炎、敗血癥、禽類的氣囊炎、關(guān)節(jié)滑膜炎和肉芽腫等。其中腸道內(nèi)致病的典型血清型代表是0157，它是腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)的一個主要血清型，是食源性人獸共患病原菌，它可通過污染的食品而引起人的食物中毒，嚴(yán)重的可致人死亡，因此研制殺滅大腸桿菌的高效制劑在公共衛(wèi)生方面具有重要的意義。目前能夠殺滅細(xì)菌的主要包括多種消毒劑、防腐劑、抗生素、抗代謝物等。然而，隨著這些藥物的廣泛應(yīng)用，不但產(chǎn)生了大量的藥物殘留，細(xì)菌的多重耐藥、高劑量耐藥等也越來越嚴(yán)重，且細(xì)菌的耐藥菌株的傳播進(jìn)一步加劇，從而增加了對環(huán)境和人類的威脅。因此科學(xué)家們一直在探索新的殺滅細(xì)菌的制劑。噬菌體是侵害細(xì)菌的病毒，不但能夠介導(dǎo)宿主菌生物學(xué)特性的改變，還能夠影響宿主菌的繁殖周期，決定宿主菌的溶原和裂解狀態(tài)。裂解性噬菌體中裂解酶具有特異性水解宿主細(xì)菌細(xì)胞壁，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性，從而殺滅細(xì)菌。噬菌體編碼的裂解酶像噬菌體一樣只能攻擊特定的細(xì)菌，具有較高的特異性。而且裂解酶作用于細(xì)菌的速度極快，以致于細(xì)菌不會對該酶產(chǎn)生抗性，且噬菌體的裂解酶有比噬菌體更為廣泛的抗菌譜，因此從噬菌體裂解酶的角度來篩選殺滅細(xì)菌的制劑，是目前抗菌制劑中的新方向。迄今噬菌體裂解酶的研究主要集中在對革蘭氏陽性菌的裂菌作用，例如鏈球菌、炭疽桿菌、結(jié)核分枝桿菌等的裂解酶的研究相對較多，而對革蘭氏陰性菌，特別是大腸桿菌噬菌體裂解酶的研究尚未有報道。由于不同的噬菌體具有不同的裂解酶序列，即使是相同的基因序列在不同的噬菌體也會發(fā)揮不同的作用，且有的基因在體外表達(dá)還會受到很多條件的限制，從而阻礙了篩選真正具有裂菌作用的裂菌劑。本發(fā)明通過比較大腸桿菌0157噬菌體Min27的基因組系列，篩選多個特定的序列片段，通過修飾，進(jìn)行原核表達(dá)、誘導(dǎo)和純化，獲得了有活性的裂菌制劑，可對多種血清型的大腸桿菌具有裂解作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于篩選具有特定的裂菌作用的基因，通過構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，篩選到具有裂解活性的重組表達(dá)產(chǎn)物，確定影響表達(dá)產(chǎn)物活性的最優(yōu)裂解條件，提供一種能夠裂解多種血清型大腸桿菌的裂菌制劑及其裂解方法、用途。本發(fā)明的目的是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的 本發(fā)明涉及一種高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑，所述裂菌制劑是通過如下方法制備而得的
步驟一，通過噬菌體誘導(dǎo)的方法，誘導(dǎo)大腸桿菌溶原菌株，獲得裂解性噬菌體顆粒，純化得到噬菌體，提取噬菌體的DNA ；步驟二，設(shè)計引物，以步驟一所得DNA為模板，應(yīng)用PCR擴(kuò)增相應(yīng)的基因片段；步驟三，采用原核表達(dá)系統(tǒng)pET_28a ( + )，將步驟二擴(kuò)增所得DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒；步驟四，將步驟三的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL2KDE3)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定，獲得重組蛋白；步驟五，純化誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白，篩選具有裂解活性的重組表達(dá)蛋白，得到蛋白制劑，即高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑。優(yōu)選地，步驟二中所述引物的核苷酸序列為，上游CGCGGATCCATGAGCAGGAAACTCCG,下游CCCAAGCTTTTATCTGTCGATTCCCC。優(yōu)選地，步驟二中所述擴(kuò)增基因片段為534bp。優(yōu)選地，步驟四中獲得的重組蛋白為23kDa。優(yōu)選地，步驟五中所述篩選具有裂解活性的重組表達(dá)蛋白具體為將獲得的純化的重組蛋白、陽性轉(zhuǎn)化子的細(xì)菌裂解液進(jìn)行平板裂解實驗，比較裂菌效果，從而篩選具有裂解活性的重組表達(dá)蛋白。本發(fā)明還涉及一種前述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑的裂解方法，所述裂解方法采用的還原劑為質(zhì)量百分比濃度為0. 8%的P -巰基乙醇或IOmM的半胱氨酸，緩沖液為20mM pH5. 2醋酸鈉緩沖液，裂解菌液的pH值為8. 0，反應(yīng)溫度為37°C。本發(fā)明還涉及一種前述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑的用途，所述裂解制劑用作裂解不同血清型大腸桿菌菌株的裂解制劑。優(yōu)選地，所述血清型大腸桿菌菌株為大腸桿菌046、0118、0138、0157和MC1061菌株。本發(fā)明的原理在于通過序列比對，設(shè)計2對可能的引物，采用PCR擴(kuò)增溶原性大腸桿菌Min27中誘導(dǎo)的裂解性噬菌體Min27的可能的裂解酶基因，獲得目的片段，再將目的片段與pET-28a ( + )載體連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a ( + )，導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)，獲得陽性轉(zhuǎn)化子 BL21 (DE3) /pET-28a ( + )_P1 和 BL21 (DE3)/pET_28a ( + )_P2，通過誘導(dǎo)，表達(dá)重組的融合蛋白，經(jīng)過Ni柱純化和加入還原劑復(fù)性，獲得純化的重組蛋白，具有裂菌活性，命名為LysEC，該制劑可以裂解多種不同血清型的大腸桿菌，而不裂解其他腸道菌，且裂解活性高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明通過原核表達(dá)系統(tǒng)和平板裂菌實驗，篩選出具有裂菌活性的重組表達(dá)蛋白LysEC，可在體外高效、特異性裂解多種血清型的大腸桿菌。


圖I為采用SDS-PAGE鑒定純化的重組表達(dá)蛋白LysEC的示意圖；圖2為純化的重組蛋白LysEC平板裂解實驗示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。下面實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I、噬菌體的誘導(dǎo)和噬菌體DNA的制各通過噬菌體誘導(dǎo)的方法，誘導(dǎo)大腸桿菌溶原菌株，獲得裂解性噬菌體顆粒，純化得到噬菌體，提取噬菌體的DNA ;具體操作如下將大腸桿菌0157Min27株接種5mL LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩過夜后，以I : 4的體積比加入新鮮LB液體培養(yǎng)基中，再加入絲裂霉素C至終濃度I. 0 ii g/mL,繼續(xù)振搖14h后，加入0. 1%的氯仿后再振搖15min,4000g離心IOmin,上清液過濾除菌,濾液中即含Stx2曬菌。將MC1061加入LB培養(yǎng)基中進(jìn)行倍比稀釋lO'lO'lO—6，分別取200 ill噬菌體稀釋液% 200 u I宿主菌混勻，并加入lmol/L CaCl2至終濃度0. lmol/L，37。。孵育15min后，將混 合液加入與己熔化的頂層瓊脂中混勻，倒入含有底層瓊脂的平板上，待上層瓊脂凝固后，置于37°C溫箱培養(yǎng)10_12h，觀察噬菌斑形態(tài)。將單個噬菌斑擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集噬菌體懸液。噬菌體懸液中入加蛋白酶K至終濃度50 U g/ml，37°C溫育30分鐘，再加入SDS至終濃度0. 5%，混勻，56°C溫育I小時。用等體積Tris平衡酚(pH8. 0)進(jìn)行抽提，4000g離心10分鐘，收集上層水相。用等體積氯仿再次抽提，5000g離心10分鐘，收集上層水相，并轉(zhuǎn)移至另一個離心管中。在回收的水相中加入3mol/L乙酸鈉至終濃度0. 3mol/L，再加兩倍體積的無水乙醇輕輕洗滌，12000g離心10分鐘，棄上清，用適量TE溶解沉淀，獲得噬菌體DNA。實施例2，設(shè)計2對引物引物，PCR擴(kuò)增目的基因片段設(shè)計2對引物Pl和P2，以實施例I所得DNA為模板，應(yīng)用PCR擴(kuò)增相應(yīng)的基因片段，確定基因的擴(kuò)增片段為534bp和501bp ;具體操作如下根據(jù)GenBank中大腸桿菌0157Min27噬菌體的DNA序列(NC_010237)，設(shè)計2對引物引物，引物序列見表1，分別擴(kuò)增2個基因區(qū)段，引物I擴(kuò)增的位置在1-534，引物2擴(kuò)增的位置34-534位氨基酸處，在上下游引物的5’端分別引入BamH I和Hind III酶切位點。以噬菌體DNA為模板，按照常規(guī)方法進(jìn)行目的基因片段的擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，取5 u L產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。表IPCR引物序列
物名稱處物序列(5'-3 T傷巧川途
Pl CGCGG^CCATGAGCAGGAAACTCCG1-17擴(kuò) Jfl 片段 534bp
P2 CGCGGATCCGCCGTTCTGGCGCTGAT34-50纊增片段501 bp
h■游引物 CCCAAGCTTTTATCTGTCGATTCCCC526-534通丨Tl 卜—游實施例3,重組質(zhì)粒的構(gòu)津采用原核表達(dá)系統(tǒng)pET_28a ( + )，將實施例2擴(kuò)增所得DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，進(jìn)行序列分析和比對，確定獲得正確序列的重組質(zhì)粒pET-28a ( + )-Pl和pET-28a ( + )P2 ;具體操作如下
將實施例2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD-18T載體(Takara公司)上測序。所設(shè)計的引物上游包含BamH I限制性酶切位點，下游包含Hind III限制性酶切位點。將BamHI和Hind III酶切PCR產(chǎn)物和pET-28a ( + )，T4DNA連接酶(Takara公司)10 16°C過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 a中，37°C過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。用BamH I和Hind III酶切鑒定，鑒定的陽性重組質(zhì)粒測序，分別獲得陽性重組質(zhì)粒pET-28a ( + )-Pl和pET-28a ( + )_P2。實施例4，重組質(zhì)粒的原核表達(dá)將實施例3的重組質(zhì)粒pET_28a ( + ) -Pl和pET_28a ( + ) _P2轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21(DE3 )，篩選陽性轉(zhuǎn)化子 BL21 (DE3) /pET_28a (+ ) -PI 和 BL21 (DE3) /pET_28a (+ ) -P2 進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定，獲得的重組蛋白，確定其蛋白分子量分別為23kDa和22kDa ;具體操作如下提取陽性重組質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中。分別獲得陽性轉(zhuǎn)化子BL21 (DE3) /pET-28a ( + ) -Pl 和 BL21 (DE3) /pET_28a ( + ) -P2,分別挑取 I 個菌落接種 2ml 卡那霉素LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。取5mL過夜培養(yǎng)菌液接種IL卡那霉素LB培養(yǎng)基，37°C 140rpm振蕩培養(yǎng)3至4小時，至OD6tltl約為I. O。加入1000mmol/L的異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG) 100 u L至終濃度為lmmol/L, 27°C 80rpm振蕩培養(yǎng)4h。取Iml菌液12000rpm離心Imin,棄上清，沉淀加入20 ii L蒸餾水重懸，再加入20 y L 2 X SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，100°C沸水浴IOmin后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，通過SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白表達(dá)情況。誘導(dǎo)的含pET-28a空載體菌做如上處理后作為對照進(jìn)行SDS-PAGE電泳，獲得的融合重組蛋白分別為23kDa和22kDa。實施例5,融合蛋白的純化純化誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白，得到蛋白制劑；具體操作如下IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌IL溶于25mL預(yù)冷的裂解緩沖液(含50mM磷酸鈉緩沖液，pH8. 0)，超聲破碎。8000g離心取上清。以8個柱體積的裂解緩沖液洗Ni柱，將樣品上至柱內(nèi)，再用預(yù)冷的裂解緩沖液洗柱，直至OD28tl < 0. I。用預(yù)冷的清洗緩沖液A (裂解緩沖液加5mM咪唑)洗柱，直至OD28tl < 0. I。用預(yù)冷的清洗緩沖液B (裂解緩沖液加20mM咪唑)洗柱，直至OD280 < 0. I。最后用溶出液(裂解緩沖液加250mM咪唑)洗柱，收集洗脫液，即為純化的重組蛋白。圖I為采用SDS-PAGE鑒定純化的重組表達(dá)蛋白LysEC的示意圖，由圖I可知1是誘導(dǎo)的細(xì)菌的表達(dá)產(chǎn)物；2是標(biāo)準(zhǔn)Marker蛋白；3是未誘導(dǎo)的細(xì)菌產(chǎn)物；4是細(xì)菌誘導(dǎo)產(chǎn)物的純化獲得重組蛋白，由圖可以看出陽性轉(zhuǎn)化子BL21 (DE3)/pET-28a ( + )P1的誘導(dǎo)產(chǎn)物純化后可以得到純度很高的純化重組蛋白。實施例6,平板裂菌實驗將實施例5獲得的純化的重組蛋白、陽性轉(zhuǎn)化子BL21 (DE3)/pET_28a ( + )P1和BL21 (DE3)/pET-28a ( + )_P2的細(xì)菌裂解液進(jìn)行平板裂解實驗，比較裂菌效果，篩選具有裂解活性的重組表達(dá)蛋白，確定BL21 (DE3)/pET-28a ( + )_P1的表達(dá)產(chǎn)物具有裂菌活性，將其命名為LysEC ;具體操作如下200ml 表達(dá)菌 BL21/pET28a-Pl、BL21/pET28aP2 以及空載體菌 BL21/pET28a 在27°C誘導(dǎo)4小時后離心，用5ml IOmM的無菌PBS緩沖液(pH 7. 2)重懸后超聲破碎。超聲功率為300-400W，工作5s，間隔15s，120個循環(huán)。獲得裂解液做平板裂解試驗。將新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌MC1061菌清洗后的細(xì)菌加入0. 65%融化的瓊脂糖中混勻，混合物倒入平皿中，冷卻后在平皿上打孔，每孔直徑10mm。分別滴加50iU空載體裂解液、50 引物I的細(xì)菌裂解液、引物2的細(xì)菌裂解液，37°C溫箱培養(yǎng)直至觀察到培養(yǎng)基上出現(xiàn)的透明抑菌圈。結(jié)果顯示BL21 (DE3)/pET-28a ( + )-Pl的原核表達(dá)產(chǎn)物顯示有裂菌效果，而BL21 (DE3)/pET-28a ( + )_P2的原核表達(dá)沒有裂菌效果，將BL21 (DE3)/pET_28a ( + )-Pl的重組表達(dá)產(chǎn)物命名為LysEC，即為裂菌制劑。圖2為純化的重組蛋白LysEC平板裂解實驗示意圖，由圖2可知A BL21 (DE3)/pET-28a ( + )-P2的細(xì)菌裂解液對大腸桿菌指示劑菌沒有裂解作用；B BL21 (DE3)/pET_28a( + )-Pl的細(xì)菌裂解液對大腸桿菌指示劑菌有裂解作用；B:BL21 (DE3)/pET-28a ( + )_P1的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的純化物對大腸桿菌指示劑菌的裂解作用最強(qiáng)。實施例7，裂菌制劑LysEC最佳裂解條件的確定探索實施例5獲得的純化重組蛋白LysEC發(fā)揮活性的最佳條件；具體操作如下 最佳裂解條件的測定包括還原劑濃度、緩沖液成分、pH值、裂解溫度等測定方法采用池度遞減試驗，確定最佳裂解條件。lmg/ml LysEC純化蛋白，分別加入0. 5%、0. 8%、
I.0%、3. 0% 和 5. 0% (V/V) ^ -巰基乙醇；lmg/ml LysEC 純化蛋白分別加入 lmM、2mM、4mM、5mM、8mM、10mM、15mM 半胱氨酸；或用 20mM/L 為 pH4. O、pH6. O、pH8. O、pH10. O、pH12. 0 和PH14. 0磷酸鈉緩沖液進(jìn)行重懸菌液，并調(diào)成OD6tltl約為I. 0 ;或用20mMpH5. 2醋酸鈉緩沖液、IOmM pH6. 8磷酸鹽緩沖液、IOmM pH7. 2磷酸鹽緩沖液、20mM pH8. 5Tris-Cl緩沖液重懸菌液；或?qū)⒓?xì)菌懸液IOOiU與100 ill純化后的裂解劑混合，分別放置在4°C、18°C、25°C、37°C、42°C。每個實驗各做3個重復(fù)，裂解緩沖液作為空白對照。室溫下反應(yīng)30min后，在600nm處讀取吸光度。取吸光度減少最大的作為最佳裂解最佳條件。P _巰基乙醇濃度為0. 8% ;半胱氨酸最佳濃度為IOmM ;最佳反應(yīng)緩沖液為20mM pH5. 2醋酸鈉緩沖液；最佳裂解效果的為裂解菌液的PH值為8. 0 ;裂解酶最佳反應(yīng)溫度為37°C。實施例8,裂菌制劑LysEC裂解活件測定實施例5獲得的純化重組蛋白LysEC的酶活性；具體操作如下以新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌12000rmp離心2min,棄上清,預(yù)冷的IOmM PBS (pH7. 2)洗兩遍后重懸，調(diào)OD6tltl為I. O。純化重組蛋白的濃度為lmg/ml的LysEC，用IOmM PBS(pH7. 2)在96孔板中進(jìn)行倍比稀釋，終體積為100 yl，每個稀釋孔中加入IOOiU細(xì)菌懸液，每個稀釋度3個重復(fù)，細(xì)菌懸液加IOmM PBS (pH7. 2)作為空白對照，在600nm處讀取吸光度，記錄初始值。96孔板置37°C，放置50min，600nm處讀取吸光度，記錄反應(yīng)后的吸光值，計算濁度下降，可使細(xì)菌濁度下降50%的酶的最高稀釋度的倒數(shù)即定義為該蛋白酶的活性(unit/mg)。在37°C條件下，當(dāng)原濃度為lmg/ml的LysEC稀釋倍數(shù)為I :3200時，大腸桿菌0157的0D600值下降50%，因此，LysEC的活性為3200u/mg，每單位所含的LysEC量為0. 31 y g。實施例9,裂菌制劑LysEC裂菌譜測定實施例5獲得的純化重組蛋白LysEC的裂菌譜的范圍；具體操作如下將生長至對數(shù)生長期的沙門氏菌、金黃色葡萄球、鏈球菌、大腸桿菌046、0118、0138、0157和MC1061等菌株離心后分別用20mM pH7. 2PBS (磷酸鈉)緩沖液重懸，調(diào)節(jié)成OD600為I. O。稀釋后的細(xì)菌懸液分別加入96孔板中，每孔100 iil，做四個重復(fù)。將終濃度為I. 25 ii g/ml的LysEC裂菌制劑100 U I加入細(xì)菌混懸液中。每株細(xì)菌各做3個重復(fù)，剩下一孔加入20mM pH7. 2磷酸鈉緩沖液IOOul作為空白對照。37°C下震蕩反應(yīng)50min后，在吸光波長600nm處讀取吸光度值。以細(xì)菌濁度下降50%為裂解陽性標(biāo)準(zhǔn)，檢測LysEC對沙門氏菌、金黃色葡萄球、鏈球菌、大腸桿菌046、0118、0138、0157和MC1061等菌株的裂解作用。結(jié)果裂解酶LysECl只對不同血清型的大腸桿菌菌株具有裂解作用，對革蘭氏陰性菌如沙門氏菌、3種革蘭氏陽性菌包括金黃色葡萄球和鏈球菌均無裂解活性(見表2)。LysEC對6株大腸桿菌的裂解效率可以達(dá)到51% 73%，而對于其它菌株裂解效率均不高于10%。表2LysEC的裂菌譜測定

權(quán)利要求
1.一種高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑，其特征在于，所述裂菌制劑是通過如下方法制備而得的 步驟一，通過噬菌體誘導(dǎo)的方法，誘導(dǎo)大腸桿菌溶原菌株，獲得裂解性噬菌體顆粒，純化得到噬菌體，提取噬菌體的DNA ； 步驟二，設(shè)計引物，以步驟一所得DNA為模板，應(yīng)用PCR擴(kuò)增相應(yīng)的基因片段； 步驟三，采用原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28a ( + )，將步驟二擴(kuò)增所得DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒； 步驟四，將步驟三的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL2KDE3)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定，獲得重組蛋白； 步驟五，純化誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白，篩選具有裂解活性的重組表達(dá)蛋白，得到蛋白制齊U，即高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑，其特征在于，步驟二中所述引物的核苷酸序列為，上游CGCGGATCCATGAGCAGGAAACTCCG，下游CCCAAGCTTTTATCTGTCGATTCCCC。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑，其特征在于，步驟二中所述擴(kuò)增基因片段為534bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求I和2所述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑，其特征在于，步驟四中獲得的重組蛋白為23kDa。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑，其特征在于，步驟五中所述篩選具有裂解活性的重組表達(dá)蛋白具體為將獲得的純化的重組蛋白、陽性轉(zhuǎn)化子的細(xì)菌裂解液進(jìn)行平板裂解實驗，比較裂菌效果，從而篩選具有裂解活性的重組表達(dá)蛋白。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑的裂解方法，其特征在于，所述裂解方法采用的還原劑為質(zhì)量百分比濃度為0. 8%的P -巰基乙醇或IOmM的半胱氨酸，緩沖液為20mM pH5. 2醋酸鈉緩沖液，裂解菌液的pH值為8. 0，反應(yīng)溫度為37°C。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑的用途，其特征在于，所述裂解制劑用作裂解不同血清型大腸桿菌菌株的裂解制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述血清型大腸桿菌菌株為大腸桿菌·046、0118、0138、0157 和 MC1061 菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑及其裂解方法、用途。設(shè)計引物，采用PCR擴(kuò)增溶原性大腸桿菌中誘導(dǎo)的裂解性噬菌體的裂解酶基因，獲得目的片段，再將目的片段與pET-28a(+)載體連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，通過誘導(dǎo)，表達(dá)重組的融合蛋白，純化誘導(dǎo)得純化的重組蛋白，篩選具有裂解活性的重組表達(dá)蛋白，即得所述裂菌制劑。所述裂解方法為pH 8.0，37℃，采用的還原劑為質(zhì)量百分比濃度為0.8%的β-巰基乙醇或10mM的半胱氨酸，緩沖液為20mM pH5.2醋酸鈉緩沖液。本發(fā)明獲得的裂菌制劑對多種血清型大腸桿菌的裂解特異性強(qiáng)、裂解效率高，可有效殺滅大腸桿菌。
文檔編號C12N15/70GK102703491SQ201210162640
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者嚴(yán)亞賢, 孫建和, 楊曦 申請人:上海交通大學(xué)