專(zhuān)利名稱(chēng)：一種微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羊毛脂是由羊皮脂腺分泌且粘附于羊毛毛被中的酯類(lèi)物質(zhì)的多組份混合物，主要是由脂肪酸與大致等量的脂肪醇、固醇、三甲基留醇等所形成的酷。羊毛脂中約含有10%左右的膽固醇，膽固醇可作為ー種具有生物活性的多功能化妝品助劑，美國(guó)CTFA(化妝品香料香精協(xié)會(huì))化妝品原料手冊(cè)已經(jīng)將膽固醇列為可加入化妝品的天然活性物質(zhì)，膽固醇也是合成維生素D3的主要原材料。我國(guó)有大量的羊毛脂資源，研究從中提取膽固醇的技術(shù)很有意義。目前從羊毛脂中提取膽固醇的方法大致分為五類(lèi)色譜法、溴化法、分子蒸餾法、 超臨界萃取法、溶劑選擇結(jié)晶法和配合法。這些方法均為化學(xué)法，用到了多種有機(jī)溶劑，且反應(yīng)過(guò)程中易產(chǎn)生多種副產(chǎn)物，容易造成環(huán)境污染，若處理，則需消耗大量的人力物力，不符合生態(tài)環(huán)保的科學(xué)理念且增加了企業(yè)的生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了ー種微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，以生物方法制備有機(jī)物，純度較高，且科學(xué)環(huán)保。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是ー種微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，其特征是該方法完全通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化，以羊毛脂為原料生產(chǎn)膽固醇，步驟如下
1)將原料粉碎，加入碳源和氮源，制備種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基；
2)篩選菌種；
3)接入菌種，攪拌發(fā)酵；
4)分離提純結(jié)晶；
進(jìn)ー步，所制備的種子培養(yǎng)基為馬鈴薯汁1000ml，糖類(lèi)20g，瓊脂20g，羊毛脂30g ；進(jìn)ー步，所制備的發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯汁1000ml 2000 ml，糖類(lèi)90g 200 g，瓊脂60g 150g,羊毛脂 80g 150g ；
優(yōu)選的，所制備的發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯汁1000ml，麥芽糖90g，瓊脂60g，羊毛脂
80g ；
進(jìn)ー步，所述的菌種篩選方法為
1)在洗羊毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產(chǎn)エ廠分別采集土壤樣品；
2)取上述采集的土壤樣品I.0g，置消毒試管中，加入無(wú)菌水IOml后以渦旋振蕩器振蕩搖勻，靜置后取上層清液，滴于種子培養(yǎng)基上，以玻璃棒涂勻，置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
2-5d，待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑出單菌落于種子培養(yǎng)基上，根據(jù)形態(tài)特征判斷純的菌株，編號(hào)保存；
3)將分離得到的幾十個(gè)菌株分別接種在種子培養(yǎng)基中，待長(zhǎng)出單菌落后，取菌落下面的培養(yǎng)基I. Og放置于試管中，加三氯甲烷IOml并震蕩，使培養(yǎng)基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入硫酸IOml ;觀察，若三氯甲烷層顯血紅色，則此菌株具備轉(zhuǎn)化能力；若不顯血紅色，則不具備轉(zhuǎn)化能力；
4)將篩選獲得的菌株在種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落質(zhì)地致密、表面呈較緊密的絨狀或堅(jiān)實(shí)、干燥、多皺，可初步猜測(cè)菌株為放線(xiàn)菌。接著挑取細(xì)菌制作玻片，在顯微鏡下，細(xì)菌呈分枝絲狀，進(jìn)ー步確定菌株為放線(xiàn)菌。進(jìn)ー步，將篩選獲得的放線(xiàn)菌置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取菌落下的培養(yǎng)基于具塞試管中，加入50% 100%的こ醇，充分震蕩，然后加入こ醚，搖動(dòng)，再加入石油醚，充分震蕩后靜置使液層分離，取上層有機(jī)相用氮?dú)獯蹈?，并?0% 100%こ醇溶解反復(fù)結(jié)晶;
進(jìn)一歩，發(fā)酵過(guò)程條件為=PH為6. 0-8. 5，溫度20-50°C，發(fā)酵時(shí)間70— 160h ；
優(yōu)選的，發(fā)酵過(guò)程條件為 11為7.6，溫度30°C，發(fā)酵時(shí)間IlOh;
本發(fā)明的有益效果是微生物轉(zhuǎn)化法是利用微生物的酶系進(jìn)行催化的化學(xué)反應(yīng)，具有條件溫和、反應(yīng)專(zhuān)一、污染小等特點(diǎn)。更重要的是適當(dāng)?shù)奈⑸锖秃侠淼磨ㄋ囬_(kāi)發(fā)研究，可以使原料直接發(fā)酵，得到較高收率的目標(biāo)產(chǎn)物的同時(shí)起到了環(huán)保的作用。通過(guò)該方法制得的膽固醇的純度較高，且收率大，符合環(huán)保理念。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步的說(shuō)明
實(shí)施例I
ー種微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，該方法完全通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化，以羊毛脂為原料生產(chǎn)膽固醇，步驟如下
土壤采集在洗毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產(chǎn)エ廠分別采集土壤樣品。種子培養(yǎng)基馬鈴薯汁1000ml，糖類(lèi)20g，瓊脂20g，羊毛脂30g。發(fā)酵培養(yǎng)基馬鈴薯汁IOOOml，麥芽糖90g，瓊脂60g，羊毛脂80g ；
篩選菌種
取上述采集的土壤樣品1.0 g，置消毒過(guò)的試管中，加人無(wú)菌水IOml后以渦旋振蕩器振蕩搖勻，靜置后取上層清液，滴于平板培養(yǎng)基上，以玻璃棒涂勻，置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 — 5d，待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑出單菌落于分離培養(yǎng)基上，根據(jù)形態(tài)特征判斷純的菌株，編號(hào)保存。將分離得到的幾十個(gè)菌株分別接種在培養(yǎng)基中，待長(zhǎng)出單菌落后，取菌落下面的培養(yǎng)基I. Og放置于試管中，加三氯甲烷IOml并震蕩，使培養(yǎng)基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入硫酸10ml。觀察，若三氯甲烷層顯血紅色，則推測(cè)此菌株具備轉(zhuǎn)化能力；若不顯血紅色，則不具備轉(zhuǎn)化能力。將篩選獲得的菌株在種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落質(zhì)地致密、表面呈較緊密的絨狀或堅(jiān)實(shí)、干燥、多皺，初步猜測(cè)菌株為放線(xiàn)菌。接著挑取細(xì)菌制作玻片，在顯微鏡下，細(xì)菌呈分枝絲狀，可進(jìn)ー步確定菌株為放線(xiàn)菌。
接入菌種，發(fā)酵培養(yǎng)
將篩選獲得的放線(xiàn)菌置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行半固體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程條件為屮11為7.6，溫度30°C，發(fā)酵時(shí)間IlOh ；
分離提純結(jié)晶
然后取菌落下的培養(yǎng)基于具塞試管中，加入95%的こ醇，充分震蕩，然后加入こ醚，搖動(dòng)，再加入石油醚，充分震蕩后靜置使液層分離，取上層有機(jī)相用氮?dú)獯蹈?，并?5%こ醇溶解反復(fù)結(jié)晶；
實(shí)施例2
ー種微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，該方法完全通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化，以羊毛脂為原料生產(chǎn)膽固醇，步驟如下
土壤采集在洗毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產(chǎn)エ廠分別采集土壤樣品。種子培養(yǎng)基馬鈴薯汁1000ml，糖類(lèi)20g，瓊脂20g，羊毛脂30g。發(fā)酵培養(yǎng)基馬鈴薯汁IOOOml，葡萄糖90g，瓊脂60g，羊毛脂80g ；
篩選菌種
取上述采集的土壤樣品1.0 g，置消毒過(guò)的試管中，加人無(wú)菌水IOml后以渦旋振蕩器振蕩搖勻，靜置后取上層清液，滴于平板培養(yǎng)基上，以玻璃棒涂勻，置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-5d，待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑出單菌落于種子培養(yǎng)基上，根據(jù)形態(tài)特征判斷純的菌株，編號(hào)保存。將分離得到的幾十個(gè)菌株分別接種在種子培養(yǎng)基中，待長(zhǎng)出單菌落后，取菌落下面的培養(yǎng)基I. Og放置于試管中，加三氯甲烷IOml并震蕩，使培養(yǎng)基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入硫酸10ml。觀察，若三氯甲烷層顯血紅色，則推測(cè)此菌株具備轉(zhuǎn)化能力；若不顯血紅色，則不具備轉(zhuǎn)化能力。將篩選獲得的菌株在種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落質(zhì)地致密、表面呈較緊密的絨狀或堅(jiān)實(shí)、干燥、多皺，初步猜測(cè)菌株為放線(xiàn)菌。接著挑取細(xì)菌制作玻片，在顯微鏡下，細(xì)菌呈分枝絲狀，可進(jìn)ー步確定菌株為放線(xiàn)菌。 接入菌種,發(fā)酵培養(yǎng)
將篩選獲得的放線(xiàn)菌置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程條件為PH為6.0，溫度20°C，發(fā)酵時(shí)間70h;
分離提純結(jié)晶
然后取菌落下的培養(yǎng)基于具塞試管中，加入50%的こ醇，充分震蕩，然后加入こ醚，搖動(dòng)，再加入石油醚，充分震蕩后靜置使液層分離，取上層有機(jī)相用氮?dú)獯蹈?，并?0%こ醇溶解反復(fù)結(jié)晶；
實(shí)施例3
ー種微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，該方法完全通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化，以羊毛脂為原料生產(chǎn)膽固醇，步驟如下
土壤采集在洗毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產(chǎn)エ廠分別采集土壤樣品。種子培養(yǎng)基馬鈴薯汁1000ml，糖類(lèi)20g，瓊脂20g，羊毛脂30g。發(fā)酵培養(yǎng)基馬鈴薯汁IOOOml，蔗糖90g，瓊脂60g，羊毛脂80g ；篩選菌種
取上述采集的土壤樣品1.0 g，置消毒過(guò)的試管中，加人無(wú)菌水IOml后以渦旋振蕩器振蕩搖勻，靜置后取上層清液，滴于平板培養(yǎng)基上，以玻璃棒涂勻，置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-5d，待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑出單菌落于分離培養(yǎng)基上，根據(jù)形態(tài)特征判斷純的菌株，編號(hào)保存。將分離得到的幾十個(gè)菌株分別接種在種子培養(yǎng)基中，待長(zhǎng)出單菌落后，取菌落下面的培養(yǎng)基I. Og放置于試管中，加三氯甲烷IOml并震蕩，使培養(yǎng)基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入硫酸10ml。觀察，若三氯甲烷層顯血紅色，則推測(cè)此菌株具備轉(zhuǎn)化能力；若不顯血紅色，則不具備轉(zhuǎn)化能力。將篩選獲得的菌株在種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落質(zhì)地致密、表面呈較緊密的絨狀或堅(jiān)實(shí)、干燥、多皺，初步猜測(cè)菌株為放線(xiàn)菌。
接著挑取細(xì)菌制作玻片，在顯微鏡下，細(xì)菌呈分枝絲狀，可進(jìn)ー步確定菌株為放線(xiàn)菌。接入菌種,發(fā)酵培養(yǎng)
將篩選獲得的放線(xiàn)菌置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程條件為PH*8.5，溫度50°C，發(fā)酵時(shí)間160h ；
分離提純結(jié)晶
然后取菌落下的培養(yǎng)基于具塞試管中，加入95%的こ醇，充分震蕩，然后加入こ醚，搖動(dòng)，再加入石油醚，充分震蕩后靜置使液層分離，取上層有機(jī)相用氮?dú)獯蹈?，并?5%こ醇溶解反復(fù)結(jié)晶；
實(shí)施例4
ー種微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，該方法完全通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化，以羊毛脂為原料生產(chǎn)膽固醇，步驟如下
土壤采集在洗毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產(chǎn)エ廠分別采集土壤樣品。種子培養(yǎng)基馬鈴薯汁1000ml，糖類(lèi)20g，瓊脂20g，羊毛脂30g。發(fā)酵培養(yǎng)基馬鈴薯汁IOOOml，麥芽糖90g，瓊脂60g，羊毛脂80g ；
篩選菌種
取上述采集的土壤樣品1.0 g，置消毒過(guò)的試管中，加人無(wú)菌水IOml后以渦旋振蕩器振蕩搖勻，靜置后取上層清液，滴于平板培養(yǎng)基上，以玻璃棒涂勻，置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-5d，待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑出單菌落于種子培養(yǎng)基上，根據(jù)形態(tài)特征判斷純的菌株，編號(hào)保存。將分離得到的幾十個(gè)菌株分別接種在種子培養(yǎng)基中，待長(zhǎng)出單菌落后，取菌落下面的培養(yǎng)基I. Og放置于試管中，加三氯甲烷IOml并震蕩，使培養(yǎng)基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入硫酸10ml。觀察，若三氯甲烷層顯血紅色，則推測(cè)此菌株具備轉(zhuǎn)化能力；若不顯血紅色，則不具備轉(zhuǎn)化能力。將篩選獲得的菌株在種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落質(zhì)地致密、表面呈較緊密的絨狀或堅(jiān)實(shí)、干燥、多皺，初步猜測(cè)菌株為放線(xiàn)菌。接著挑取細(xì)菌制作玻片，在顯微鏡下，細(xì)菌呈分枝絲狀，可進(jìn)ー步確定菌株為放線(xiàn)菌。
接入菌種,發(fā)酵培養(yǎng)
將篩選獲得的放線(xiàn)菌置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程條件為PH為7.0，溫度35°C，發(fā)酵時(shí)間120h ；
分離提純結(jié)晶 然后取菌落下的培養(yǎng)基于具塞試管中，加入75%的こ醇，充分震蕩，然后加入こ醚，搖動(dòng)，再加入石油醚，充分震蕩后靜置使液層分離，取上層有機(jī)相用氮?dú)獯蹈?，并?5%こ醇溶解反復(fù)結(jié)晶；
凡在不脫離本發(fā)明核心的情況下做出的簡(jiǎn)單的變形或修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.ー種微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，其特征是該方法完全通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化，以羊毛脂為原料生產(chǎn)膽固醇，步驟如下 1)將原料粉碎，加入碳源和氮源，制備種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基； 2)篩選菌種； 3)接入菌種，攪拌發(fā)酵； 4)分離提純結(jié)晶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，其特征是所制備的種子培養(yǎng)基為馬鈴薯汁1000ml，糖類(lèi)20g，瓊脂20g，羊毛脂30g。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，其特征是所制備的發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯汁IOOOml 2000 ml，糖類(lèi)90g 200 g，瓊脂60g 150g，羊毛脂80g 150go
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，其特征是所制備的發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯汁1000ml，麥芽糖90g，瓊脂60g，羊毛脂80g。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，其特征是所述的菌種篩選方法為 1)在洗羊毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產(chǎn)エ廠分別采集土壤樣品； 2)取上述采集的土壤樣品I.0g，置消毒試管中，加入無(wú)菌水IOml后以渦旋振蕩器振蕩搖勻，靜置后取上層清液，滴于種子培養(yǎng)基上，以玻璃棒涂勻，置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-5d，待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑出單菌落于新的種子培養(yǎng)基上，根據(jù)形態(tài)特征判斷純的菌株，編號(hào)保存； 3)將分離得到的幾十個(gè)菌株分別接種在種子培養(yǎng)基中，待長(zhǎng)出單菌落后，取菌落下面的培養(yǎng)基I. Og放置于試管中，加三氯甲烷IOml并震蕩，使培養(yǎng)基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入硫酸IOml ;觀察，若三氯甲烷層顯血紅色，則此菌株具備轉(zhuǎn)化能力；若不顯血紅色，則不具備轉(zhuǎn)化能力； 4)將篩選獲得的菌株在種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落質(zhì)地致密、表面呈較緊密的絨狀或堅(jiān)實(shí)、干燥、多皺，可初步猜測(cè)菌株為放線(xiàn)菌； 進(jìn)ー步挑取細(xì)菌制作玻片，在顯微鏡下觀察，細(xì)菌呈分枝絲狀，可進(jìn)ー步確定菌株為放線(xiàn)菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，其特征是將篩選獲得的放線(xiàn)菌置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取菌落下的培養(yǎng)基于具塞試管中，加入50% 100%的こ醇,充分震蕩，然后加入こ醚，搖動(dòng)，再加入石油醚，充分震蕩后靜置使液層分尚，取上層有機(jī)相用氮?dú)獯蹈?，并?0% 100%こ醇溶解反復(fù)結(jié)晶。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或6所述的微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，其特征是發(fā)酵過(guò)程條件為:PH為6. 0-8. 5，溫度20-50°C，發(fā)酵時(shí)間70— 160h。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或6或7所述的微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，其特征是發(fā)酵過(guò)程條件為？11為7.6，溫度30°C，發(fā)酵時(shí)間110h。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種微生物轉(zhuǎn)化法制備膽固醇的方法，該方法完全通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化，以羊毛脂為原料生產(chǎn)膽固醇，步驟包括1)將原料粉碎，加入碳源和氮源，制備種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基；2)篩選菌種；3)接入菌種，攪拌發(fā)酵；4)分離提純結(jié)晶；上述方法制備膽固醇，具有條件溫和、反應(yīng)專(zhuān)一、污染小等特點(diǎn)。通過(guò)該方法制得的膽固醇的純度較高，且收率大，符合環(huán)保理念。
文檔編號(hào)C12P33/00GK102676626SQ20121016304
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月24日
發(fā)明者薛家祿, 馬志軍 申請(qǐng)人:河南利偉生物藥業(yè)股份有限公司