專(zhuān)利名稱(chēng)：可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片及其制備法和使用法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)在醫(yī)學(xué)衛(wèi)生領(lǐng)域中的應(yīng)用，特別涉及一種可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片。
背景技術(shù)：
美國(guó)、英國(guó)、加拿大等國(guó)100萬(wàn)以上人群的大規(guī)模調(diào)查發(fā)現(xiàn)，吸煙者肺癌的發(fā)病率是不吸煙者的10. 8倍。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)調(diào)查證實(shí)，吸煙者患肺癌是不吸煙者的8倍 12倍。吸煙量越大，得肺癌的危險(xiǎn)性越高。每天吸I支 9支者，他們的危險(xiǎn)性是不吸煙者的3倍 15倍；每天吸40支以上者則是不吸煙者的19倍 30倍。從肺癌的年死亡率來(lái)看，吸煙者比不吸煙者高18. 4倍?？梢?jiàn)，吸煙是引起肺癌發(fā)生的最重要因素。既然吸煙與肺癌有關(guān)，為什么有些人抽了一輩子煙，活了 80多歲，仍然沒(méi)有得肺·癌呢？目前認(rèn)為，主要與以下因素有關(guān)I、遺傳個(gè)體差異吸煙引起肺癌的危險(xiǎn)性還存在著遺傳性個(gè)體差異，其中包括代謝酶的變異及獲得的易感性。這類(lèi)酶的遺傳性變異將導(dǎo)致個(gè)體人群因吸煙而致肺癌的危險(xiǎn)性上升50%，也就是說(shuō)，如果吸煙者具有肺癌的遺傳易感性，發(fā)生肺癌的機(jī)會(huì)將明顯增高，開(kāi)始吸煙年齡愈早，吸煙量愈大，吸煙年限愈長(zhǎng)，則肺癌危險(xiǎn)性愈高。反之，無(wú)遺傳易感性的吸煙者肺癌危險(xiǎn)性相對(duì)較小，吸煙者可能不會(huì)患肺癌。2、家族高發(fā)性肺癌患者親屬中發(fā)生肺癌的危險(xiǎn)度要比無(wú)肺癌家屬者高出約2. 4倍，肺癌患者的后代，年齡在40歲 59歲期間發(fā)生肺癌的危險(xiǎn)性甚至可高達(dá)普通人的7. 2倍。由于吸煙致癌并非短期形成，一般從開(kāi)始吸煙到充分顯示出吸煙的致肺癌效應(yīng)，有10年 20年的潛伏期，因而易被人們所忽視。比較而言，吸煙年限長(zhǎng)的人比吸煙量大的人更容易患癌。3、吸煙與肺癌易感性基因易感性基因的特點(diǎn)是基因突變本身并不直接導(dǎo)致疾病的發(fā)生，而只造成機(jī)體患病的潛在危險(xiǎn)性增加，一旦外界有害因素的介入，可導(dǎo)致疾病發(fā)生。另一種情況出現(xiàn)在藥物治療中，易感基因突變?cè)斐蓹C(jī)體易感性改變，用藥后可出現(xiàn)這些人治療的療效差或出現(xiàn)不良反應(yīng)。目前關(guān)于可能是吸煙者患肺癌風(fēng)險(xiǎn)影響因素的遺傳多態(tài)性的研究主要集中在與外源性異物代謝I/II階段、DNA修復(fù)和尼古丁成癮效應(yīng)相關(guān)的酶類(lèi)研究。特別是DNA損傷修復(fù)基因、代謝酶基因多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系已成為腫瘤分子流行病學(xué)的熱點(diǎn)。已知大多數(shù)的化學(xué)致癌物在體內(nèi)需要生物轉(zhuǎn)化過(guò)程激活或解毒。在此過(guò)程中涉及的代謝酶分為兩類(lèi)I相代謝酶為代謝活化酶，主要包括細(xì)胞色素P450家族(cytochrome P450,CYP450)，可將前致癌物活化為終致癌物；II相代謝酶為代謝解毒酶，主要包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione- S- transferase, GST)和 N-乙酸化轉(zhuǎn)移酶(arylamine N-acetyltransferase, NAT),將化學(xué)致癌物的活性產(chǎn)物催化形成親水物質(zhì)排出。由于這些代謝酶控制和影響了致癌物的代謝，故其多態(tài)性在決定人群中個(gè)體的腫瘤易感性方面起著重要的作用。對(duì)于與環(huán)境污染物及吸煙有密切關(guān)系的肺癌來(lái)說(shuō)，個(gè)體易感性起著重要的作用。個(gè)體易感性的主要表現(xiàn)形式之一是基因多態(tài)性，包括外來(lái)化合物代謝酶基因多態(tài)性，DNA損傷修復(fù)基因的單核苷酸多態(tài)性以及其他的一些基因多態(tài)性。檢索到目前為止報(bào)道的所有與吸煙引起肺癌易感性相關(guān)基因，包括SNP、突變，基因缺失等。因此人們期望制成SNP芯片，用于預(yù)測(cè)吸煙人群患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的高低，從而能實(shí)現(xiàn)一定程度上減少肺癌的發(fā)病率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片，設(shè)置陰性探針為GGGTGTATGGGTCGTAGCGAACTGAG，設(shè)置 GAPDH 陽(yáng)性探針為 GTCCAGTTAATTTCTGACCTTTACTCCTGCCCTTTGAGTTTGATGATGCTGAGTGTAC ；還設(shè)置以下9個(gè)SNP位點(diǎn)中的至少一個(gè)SNP位點(diǎn)的野生型探針和突變型探針CDKALl (rs7756992)野生型探針TAITTTAGITTTAGATCTACAGTTA突變型探針TATTTTAGTTTTGGATCTACAGTTA；CYP2E1 (rs 2031920)野生型探針ATATAAAAGTACAAAATTGCAA突變型探針ATATAAAAGTATAAAATTGCAA；IL-18 (rs 360721)野生型探針GCTGAAACTTCTGGCATTTATTGAATG突變型探針GCTGAAACTTCTGGGATTTATTGAATG；IL-8 (rs 4073)野生型探針TGAAACTTCTGGCATTTATTGAATG突變型探針TGAAACTTCTGGGATTTATTGAATG；ILlB (rs 16944)野生型探針GTTCTCTGCCTCAGGAGCTCTCT突變型探針GTTCTCTGCCTCGGGAGCTCTCT；ITGAlKrs 2306022)野生型探針GTCACATCGGTCATGTCCTCCAG突變型探針GTCACATCGGTCGTGTCCTCCAG；NAT2 (rs 1799930)野生型探針CTTGAACCTCAAACAATTGAAG突變型探針CTTGAACCTCGAACAATTGAAG；XPD (ERCC2) (rs 13181)野生型探針CTCTATCCTCTGCAGCGTCTCCTCT突變型探針CTCTATCCTCTTCAGCGTCTCCTCT；
Gln632Gln(rs3547)野生型探針ACATACTTCAGGCCTGCGGCACCACC突變型探針ACATACTTCAGGCTTGCGGCACCACC。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片的制備方法，包括如下步驟I)、在芯片上設(shè)置至少一個(gè)的亞矩陣，對(duì)每個(gè)亞矩陣進(jìn)行如下設(shè)置將每種探針設(shè)置成相應(yīng)的濃度為65 70mM的探針溶液；每種探針溶液均分別進(jìn)行如下操作與點(diǎn)樣緩沖液等體積混合后，在每個(gè)亞矩陣內(nèi)進(jìn)行點(diǎn)樣；2)、將步驟I)所得的芯片于50%的相對(duì)濕度下、室溫下放置1(Γ14小時(shí)； 3)、將步驟2)所得的芯片于42°C預(yù)熱的預(yù)雜交液中保溫預(yù)雜交35 45分鐘；42°C預(yù)熱的預(yù)雜交液的制備方法為在IOOml的20 X SSC緩沖液中，加入質(zhì)量濃度10%的SDS 3. 5 4. 5ml、質(zhì)量濃度10%的BSA 38 42ml，用不含核酸酶的18. 2兆歐姆的水定容至420ml ;42°C預(yù)熱2分鐘；4)、將步驟2)所得的芯片依次用不含核酸酶的18. 2兆歐姆的水、異丙醇進(jìn)行清洗，然后干燥，得可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片。作為本發(fā)明的可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片的制備方法的改進(jìn)步驟I)中的點(diǎn)樣為用高通量芯片點(diǎn)樣儀進(jìn)行點(diǎn)制，點(diǎn)間距20(T300um，點(diǎn)直徑80 120um。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片的使用方法，對(duì)每種待測(cè)樣品DNA依次進(jìn)行如下步驟I)、靶基因的多重PCR擴(kuò)增①、獲取待測(cè)樣品DNA的提取液；②、將待測(cè)樣品DNA的提取液針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物PCR反應(yīng)體系為10XPCR反應(yīng)緩沖液(含15mM Mg離子，例如為MgCl2) 2. 5μ1，含胺酰dUTP的dNTP(總濃度為10mM，含2mM胺酰標(biāo)記的dUTP) 2. Ομ , Taq DNA聚合酶(2U/ml) O. 5μ1，引物(20ρπιΟ1/μ1)各O. 5μ1 (正向引物和反向引物各O. 5μ1)，待測(cè)樣品的DNA提取液 μ ，不含核酸酶的18. 2兆歐姆的水補(bǔ)足到25μ1 ；上述含胺酰dUTP的dNTP (總濃度為10禮，含2mM胺酰標(biāo)記的dUTP)的制備方法為將dATP，dTTP, dGTP, dCTP, aa dUTP和不含核酸酶的18. 2兆歐姆的水混合，得溶液；dATP, dTTP, dGTP, dCTP, aa dUTP在溶液中的濃度各分別為2mM ;所述aa dUTP為含胺酰標(biāo)記的dUTP ；PCR循環(huán)參數(shù)94°C預(yù)變性5 min ;94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸25秒，共35個(gè)循環(huán)；得擴(kuò)增產(chǎn)物；引物具體如下CDKALl(rs7756992)正向引物CCTCAAGCAACCCTCCTCC反向引物GCAAATAAATTCAACTGGCATC；
CYP2E1 (rs 2031920)正向引物GACTTGCTTATGTGGCTAA反向引物TCATACAGACCCTCTTCCA；IL-18 (rs 360721)正向引物GAAGCCAGTCCTTCCTAAA反向引物TCATTGCCACAAAGTTGAT；IL-8 (rs 4073)正向引物GATTGGCTGGCTTATCTTC 反向引物GTTTGTGCCTTATGGAGTG；ILlB (rs 16944)正向引物ATCGTTGTGCAGTTGATGT反向引物ATCTGGCATTGATCTGGTT；ITGAlKrs 2306022)正向引物CCCTGCGTGATTGAATCTGC反向引物TTTACTGCCCTCCCATTTGTC；NAT2 (rs 1799930)正向引物TCGATGCTGGGTCTGGAAG反向引物CAGGTTTGGGCACGAGATT；XPD (ERCC2) (rs 13181)正向引物GATTAAAGGCTGTGGACATGA反向引物TCCGACTACCTAGCTGGCTC；Gln632Gln(rs3547)正向引物GAGGGTCAGATTCCCAGTT反向引物TGAGGAGGTGAGTACCAAAG；③、將已知是健康人的DNA提取液針對(duì)GAPDH進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物PCR反應(yīng)體系為10XPCR反應(yīng)緩沖液(含15mM Mg離子)2. 5μ1，含胺酰dUTP的dNTP (總濃度為IOmM,含2mM 胺酰標(biāo)記的 dUTP) 2. Ομ , Taq DNA 聚合酶(2U/ml) O. 5μ1,引物(20ρπιο1/μ1)各O. 5μ1(正向引物和反向引物各O. 5μ1)，已知是健康人的DNA提取液 μ ，不含核酸酶的18. 2兆歐姆的水補(bǔ)足至Ij 25μ1 ；PCR循環(huán)參數(shù)94°C預(yù)變性5 min ;94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸25秒，共35個(gè)循環(huán)；得擴(kuò)增產(chǎn)物；所述GAPDH的引物為正向引物GCACCGTCAAGGCTGAGAAC反向引物TGGTGAAGACGCCAGTGGA；2)、芯片雜交檢測(cè)①、熒光染料標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物將粉末狀染料I mg用70 75μ1 DMSO溶解，得染料溶液；
將上述步驟I)所得的每種擴(kuò)增產(chǎn)物(包括上述步驟I)的②中針對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的擴(kuò)增產(chǎn)物以及步驟I)的③中針對(duì)GAPDH進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的擴(kuò)增產(chǎn)物)各取10μ1進(jìn)行混合，得擴(kuò)增產(chǎn)物混合液；然后按2μ1染料溶液/每10μ1擴(kuò)增產(chǎn)物混合液的量將上述2者混勻，在黑暗室溫環(huán)境下放置O. 5 1. 5小時(shí)；然后進(jìn)行純化、洗脫、濃縮至擴(kuò)增產(chǎn)物混合液體積的1/1(Γ1/15 ;得雜交探針；②、樣品與芯片雜 交將上述步驟①所得的雜交探針進(jìn)行如下處理先將蓋片蓋到芯片上，再將得到的雜交探針與2XF雜交液(250μ1的20XSSC、250μ1去離子甲酰胺；10μ1質(zhì)量濃度10% SDS組成)等體積量混合后進(jìn)行如下處理于98°C變性2分鐘，然后迅速置于冰上；5分鐘后取出，離心，得處理后的雜交探針與雜交液的混合液；然后用移液槍吸取上述處理后的雜交探針與雜交液的混合液后，從蓋片上的小孔加入至一個(gè)亞矩陣內(nèi)；接著在58°C雜交2h ;所述2XF雜交液按照以下體積比的原料配制而得250μ1的20XSSC緩沖液、250μ1去離子甲酰胺和10μ1質(zhì)量濃度10% SDS ；最后分別用洗脫液I (2XSSC，0.1% SDS’ 42°C預(yù)熱)、洗脫液II (O. 5XSSC，0.01% SDS, 42 °C預(yù)熱)、洗脫液III (O. 06 X SSC)各洗5 min ;再用玻片離心機(jī)(例如為800rpm)甩干；洗脫液I的制備方法為每IL的2 X SSC緩沖液的基礎(chǔ)上加入Ig的SDS (十二烷基硫酸鈉)，42°C預(yù)熱2分鐘；洗脫液II的制備方法為每IL的O. 5XSSC緩沖液的基礎(chǔ)上加入O. I g的SDS，42°C預(yù)熱2分鐘；洗脫液III為O. 06 X SSC緩沖液；3)、雜交結(jié)果的檢測(cè)與分析采用Agilent G2505 B掃描儀掃描芯片，并用生物信息學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，(平均信號(hào)值一平均背景信號(hào))/平均背景信號(hào)，對(duì)所述每個(gè)SNP位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的野生型探針和突變型探針進(jìn)行判斷，大于5倍的視為陽(yáng)性，以此為判斷依據(jù)；當(dāng)某個(gè)基因位點(diǎn)僅有野生型探針為陽(yáng)性時(shí)，表明待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的該基因位點(diǎn)為野生型；當(dāng)某個(gè)基因位點(diǎn)僅有突變型探針為陽(yáng)性時(shí)，表明待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的該基因位點(diǎn)為突變型；當(dāng)某個(gè)基因位點(diǎn)的野生型探針和突變型探針均為陽(yáng)性時(shí)，表明待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的該基因位點(diǎn)為雜合型。作為本發(fā)明的可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片的使用方法的改進(jìn)還包括以下步驟吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)當(dāng)待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的任意一個(gè)基因位點(diǎn)為突變型或雜合型時(shí)，表明該待測(cè)樣品的當(dāng)事人吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)高；9個(gè)SNP位點(diǎn)，出現(xiàn)突變型或雜合型的越多，風(fēng)險(xiǎn)則越高；當(dāng)待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的所有基因位點(diǎn)均為野生型，表明該待測(cè)樣品的當(dāng)事人吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)較普通人群低。備注說(shuō)明本發(fā)明中所用到的水均為不含核酸酶的18. 2兆歐姆的水，包括配制各種溶液時(shí)所用到的水。本發(fā)明將目前研究的所有與肺癌易感性相關(guān)的基因收集并進(jìn)行分析，選取顯著性的候選基因，同時(shí)結(jié)合芯片技術(shù)，將篩選出的易感基因制作成芯片，從整體水平研究遺傳多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系，然后通過(guò)不斷的優(yōu)化，最終開(kāi)發(fā)出一種針對(duì)吸煙人群患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的SNP芯片，用于預(yù)測(cè)吸煙人群患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的高低，針對(duì)性的開(kāi)展個(gè)性化預(yù)防，對(duì)一些高危吸煙人群進(jìn)行勸阻，從而減少肺癌的發(fā)病率。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明首次通過(guò)批量檢測(cè)吸煙人群的SNP突變情況，從而能輕易得知待測(cè)樣品針對(duì)9個(gè)SNP位點(diǎn)為突變型還是雜合型；從而實(shí)現(xiàn)預(yù)測(cè)該人群患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)，這在國(guó)內(nèi)為首倉(cāng)|J，目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)類(lèi)似的研究成果或相應(yīng)的產(chǎn)品，本發(fā)明的芯片可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成供家庭用的檢測(cè)試劑盒，為那些吸煙人群提供參考，從而降低中國(guó)肺癌發(fā)病率做出貢獻(xiàn)。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖I是每一個(gè)亞矩陣的示意圖實(shí)線框?yàn)殛?yáng)性探針，點(diǎn)線間隔框?yàn)橐吧吞结?，虛線框?yàn)橥蛔冃吞结?，其他為陰性探針；備注說(shuō)明每個(gè)SNP位點(diǎn)的野生型探針和突變型探針均分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。圖2是雜交后，用掃描儀掃描后的圖片，見(jiàn)右圖，兩個(gè)白框中，分別為純合突變型，以及雜合型；選取雜合型的基因，進(jìn)行驗(yàn)序驗(yàn)證。圖3是測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果顯示為雙峰，是個(gè)雜合型，而對(duì)其他基因位點(diǎn)的驗(yàn)證結(jié)果，也符合芯片的結(jié)果。說(shuō)明本方法的結(jié)果較為可靠。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I、I、SNP基因位點(diǎn)的尋找與確定從NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索突變位點(diǎn)，總共包括，CDKALl (rs7756992)，CYP2E1(rs 2031920), Interleukin-18 (rs 360721)，Interleukin-8 (rs 4073),InterleukinIB (rs 16944)，ITGAll (rs 2306022)，NAT 2 (rs 1799930)，XPD (ERCC2) (rs 13181)，Gln632Gln(rs3547)這九個(gè)不同的位點(diǎn)。該九個(gè)位點(diǎn)在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中已被認(rèn)為是跟吸煙后與肺癌發(fā)生有關(guān)，并達(dá)到顯著水平。2、探針與引物的設(shè)計(jì)所有位點(diǎn)通過(guò)多重PCR擴(kuò)增后，通過(guò)芯片鑒定。所設(shè)計(jì)的引物和探針?lè)謩e如下表I
權(quán)利要求
1.可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片，其特征是 設(shè)置陰性探針為 GGGTGTATGGGTCGTAGCGAACTGAG，設(shè)置 GAPDH 陽(yáng)性探針為 GTCCAGTTAATTTCTGACCTTTACTCCTGCCCTTTGAGTTTGATGATGCTGAGTGTAC ； 還設(shè)置以下9個(gè)SNP位點(diǎn)中的至少一個(gè)SNP位點(diǎn)的野生型探針和突變型探針CDKALl 野生型探針TATTTTAGITTTAGATCTACAGTTA 突變型探針TATTTTAGITTTGGATCTACAGTTA ；CYP2E1 野生型探針ATATAAAAGTACAAAATTGCAA 突變型探針ATATAAAAGTATAAAATTGCAA ；IL-18 野生型探針GCTGAAACTTCTGGCATTTATTGAATG 突變型探針GCTGAAACTTCTGGGAITTATTGAATG ； IL-8 野生型探針TGAAACTTCTGGCATTTATTGAATG 突變型探針TGAAACTTCTGGGAITTATTGAATG ； ILlB 野生型探針GTTCTCTGCCTCAGGAGCTCTCT 突變型探針GTTCTCTGCCTCGGGAGCTCTCT ；ITGAll 野生型探針GTCACATCGGTCATGTCCTCCAG 突變型探針GTCACATCGGTCGTGTCCTCCAG ；NAT2 野生型探針CTTGAACCTCAAACAATTGAAG 突變型探針CTTGAACCTCGAACAATTGAAG ； XPD 野生型探針CTCTATCCTCTGCAGCGTCTCCTCT 突變型探針CTCTATCCTCTTCAGCGTCTCCTCT ；Gln632Gln 野生型探針ACATACTTCAGGCCTGCGGCACCACC 突變型探針ACATACTTCAGGCTTGCGGCACCACC。
2.如權(quán)利要求I所述的可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片的制備方法，其特征是包括如下步驟 1)、在芯片上設(shè)置至少一個(gè)的亞矩陣，對(duì)每個(gè)亞矩陣進(jìn)行如下設(shè)置 將每種探針設(shè)置成相應(yīng)的濃度為65 70mM的探針溶液；每種探針溶液均分別進(jìn)行如下操作與點(diǎn)樣緩沖液等體積混合后，在每個(gè)亞矩陣內(nèi)進(jìn)行點(diǎn)樣； 2)、將步驟I)所得的芯片于50%的相對(duì)濕度下、室溫下放置1(Γ14小時(shí)； 3)、將步驟2)所得的芯片于42°C預(yù)熱的預(yù)雜交液中保溫預(yù)雜交35 45分鐘； 所述42°C預(yù)熱的預(yù)雜交液的制備方法為在IOOml的20 X SSC緩沖液中，加入質(zhì)量濃度10%的SDS 3. 5 4. 5ml、質(zhì)量濃度10%的BSA 38 42ml，用不含核酸酶的18. 2兆歐姆的水定容至420ml ;42°C預(yù)熱2分鐘； 4)、將步 驟2)所得 的芯片依次用不含核酸酶的18. 2兆歐姆的水、異丙醇進(jìn)行清洗，然后干燥，得可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片的制備方法，其特征是 所述步驟I)中的點(diǎn)樣為用高通量芯片點(diǎn)樣儀進(jìn)行點(diǎn)制，點(diǎn)間距20(T300um，點(diǎn)直徑80 120um。
4.如權(quán)利要求I所述的可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片的使用方法，其特征是對(duì)每種待測(cè)樣品DNA依次進(jìn)行如下步驟 I)、靶基因的多重PCR擴(kuò)增 ①、獲取待測(cè)樣品DNA的提取液； ②、將待測(cè)樣品DNA的提取液針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR反應(yīng)體系為 ·10 X PCR反應(yīng)緩沖液(含15mM Mg離子)2· 5μ1，含胺酰dUTP的dNTP (總濃度為IOmM,含·2mM胺酰標(biāo)記的 dUTP) 2. 0Pl，Taq DNA聚合酶(2U/ml) O. 5μ1，引物(20ρπιο1/μ1)各 O. 5μ1，待測(cè)樣品的DNA提取液 μ ，不含核酸酶的18. 2兆歐姆的水補(bǔ)足到25μ1 ； PCR循環(huán)參數(shù)94°C預(yù)變性5 min ;94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸25秒，共·35個(gè)循環(huán)；得擴(kuò)增產(chǎn)物；CDKALl 正向引物CCTCAAGCAACCCTCCTCC 反向引物GCAAATAAATTCAACTGGCATC ；CYP2E1 正向引物GACTTGCTTATGTGGCTAA 反向引物TCATACAGACCCTCTTCCA ；IL-18 正向引物GAAGCCAGTCCTTCCTAAA 反向引物TCATTGCCACAAAGTTGAT ； IL-8 正向引物GATTGGCTGGCTTATCTTC 反向引物GTTTGTGCCTTATGGAGTG ； ILlB 正向引物ATCGTTGTGCAGTTGATGT 反向引物ATCTGGCATTGATCTGGTT ；ITGAll 正向引物CCCTGCGTGATTGAATCTGC 反向引物TTTACTGCCCTCCCATTTGTC ；NAT2 正向引物TCGATGCTGGGTCTGGAAG反向引物CAGGTTTGGGCACGAGATT ；XPD (ERCC2) 正向引物GATTAAAGGCTGTGGACATGA 反向引物TCCGACTACCTAGCTGGCTC ；Gln632Gln 正向引物GAGGGTCAGATTCCCAGTT 反向引物TGAGGAGGTGAGTACCAAAG ； ③、將已知是健康人的DNA提取液針對(duì)GAPDH進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR反應(yīng)體系為 IOXPCR反應(yīng)緩沖液(含15mM Mg離子)2· 5μ1，含胺酰dUTP的dNTP (總濃度為10mM，含 2mM胺酰標(biāo)記的 dUTP)2. OPl’Taq DNA聚合酶(2U/ml) O. 5μ1，引物(20ρπιο1/μ1)各 O. 5μ1(正向引物和反向引物各O. 5μ1)，已知是健康人的DNA提取液 μ ，不含核酸酶的18. 2兆歐姆的水補(bǔ)足到25μ1 ； PCR循環(huán)參數(shù)94°C預(yù)變性5 min ;94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸25秒，共35個(gè)循環(huán)；得擴(kuò)增產(chǎn)物；所述 GAI3DH 正向引物GCACCGTCAAGGCTGAGAAC 反向引物TGGTGAAGACGCCAGTGGA ； 2)、芯片雜交檢測(cè) ①、熒光染料標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物 將粉末狀染料I mg用7(Γ75μ1 DMSO溶解，得染料溶液； 將上述步驟I)所得的每種擴(kuò)增產(chǎn)物(包括上述步驟I)的②中針對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的擴(kuò)增產(chǎn)物以及步驟I)的③中針對(duì)GAPDH進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的擴(kuò)增產(chǎn)物)各取 ομ 進(jìn)行混合,得擴(kuò)增產(chǎn)物混合液；然后按2μ1染料溶液/每 ομ 擴(kuò)增產(chǎn)物混合液的量將上述2者混勻，在黑暗室溫環(huán)境下放置O. 5 1. 5小時(shí)；然后進(jìn)行純化、洗脫、濃縮至擴(kuò)增產(chǎn)物混合液體積的1/1(Γ1/15 ;得雜交探針； ②、樣品與芯片雜交 將上述步驟①所得的雜交探針進(jìn)行如下處理 先將蓋片蓋到芯片上，再將得到的雜交探針與2XF雜交液等體積量混合后進(jìn)行如下處理于98°C變性2分鐘，然后迅速置于冰上；5分鐘后取出，離心，得處理后的雜交探針與雜交液的混合液；然后用移液槍吸取上述處理后的雜交探針與雜交液的混合液后，從蓋片上的小孔加入至一個(gè)亞矩陣內(nèi)；接著在58°C雜交2h ； 所述2XF雜交液按照以下體積比的原料配制而得250μ1的20XSSC緩沖液、250μ1去離子甲酰胺和10μ1質(zhì)量濃度10% SDS ； 最后分別用洗脫液I、洗脫液II、洗脫液III各洗5 min ;再用玻片離心機(jī)甩干； 洗脫液I的制備方法為每IL的2XSSC緩沖液的基礎(chǔ)上加入Ig的SDS，42°C預(yù)熱2分鐘； 洗脫液II的制備方法為每IL的0. 5 X SSC緩沖液的基礎(chǔ)上加入0. I g的SDS，42°C預(yù)熱2分鐘； 洗脫液III為O. 06 X SSC緩沖液； 3)、雜交結(jié)果的檢測(cè)與分析 采用Agilent G2505 B掃描儀掃描芯片，并用生物信息學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，(平均信號(hào)值一平均背景信號(hào))/平均背景信號(hào)，對(duì)所述每個(gè)SNP位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的野生型探針和突變型探針進(jìn)行判斷，大于5倍的視為陽(yáng)性，以此為判斷依據(jù)； 當(dāng)某個(gè)基因位點(diǎn)僅有野生型探針為陽(yáng)性時(shí)，表明待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的該基因位點(diǎn)為野生型； 當(dāng)某個(gè)基因位點(diǎn)僅有突變型探針為陽(yáng)性時(shí)，表明待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的該基因位點(diǎn)為突變型； 當(dāng)某個(gè)基因位點(diǎn)的野生型探針和突變型探針均為陽(yáng)性時(shí)，表明待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的該基因位點(diǎn)為雜合型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片的使用方法，其特征是還包括以下步驟 吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè) 當(dāng)待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的任意一個(gè)基因位點(diǎn)為突變型或雜合型時(shí)，表明該待測(cè)樣品的當(dāng)事人吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)高；9個(gè)SNP位點(diǎn)，出現(xiàn)突變型或雜合型的越多，風(fēng)險(xiǎn)則越高； 當(dāng)待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的所有基因位點(diǎn)均為野生型，表明該待測(cè)樣品的當(dāng)事人吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)較普通人群低。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片，包括陰性探針、GAPDH陽(yáng)性探針、9個(gè)SNP位點(diǎn)中的至少一個(gè)SNP位點(diǎn)的野生型探針和突變型探針。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了該芯片的制備方法，包括如下步驟1)在芯片上設(shè)置至少一個(gè)的亞矩陣，將每種探針設(shè)置成相應(yīng)的濃度為65~70mM的探針溶液，與點(diǎn)樣緩沖液等體積混合后，在每個(gè)亞矩陣內(nèi)進(jìn)行點(diǎn)樣；2)所得芯片于50%的相對(duì)濕度下、室溫下放置10~14小時(shí)；3)所得芯片于42℃預(yù)熱的預(yù)雜交液中保溫預(yù)雜交；4)所得芯片依次用不含核酸酶的18.2兆歐姆的水、異丙醇進(jìn)行清洗，然后干燥，得可以預(yù)測(cè)吸煙后患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的芯片。本發(fā)明還公開(kāi)了該芯片的使用方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102899393SQ201210167729
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者盧火佺, 臧發(fā)榮, 陳銳, 陳飛 申請(qǐng)人:長(zhǎng)興縣人民醫(yī)院