專利名稱：一種分析啤酒大麥或大麥麥芽微生物群落的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啤酒大麥或大麥麥芽微生物群落的方法，特別是一種用嵌套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)_變性梯度凝膠電泳(Nested polymerase chain reaction denaturinggradient gel electrophoresis,Nested PCR-DGGE)技術(shù)分析啤酒大麥或大麥麥芽中微生物的群落結(jié)構(gòu)的方法。
背景技術(shù)：
嵌套PCR是一種變異的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，即使用內(nèi)、外兩對引物擴(kuò)增目標(biāo)片段。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似，第二對引物位于在第一次PCR擴(kuò)增片段的內(nèi)部，因此嵌套PCR有著特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高的優(yōu)點。變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵領(lǐng)域，該技術(shù)最初是由Fischer和Lerman在1979年提出用于檢測DNA突變的一種電泳技術(shù)。1993年Muyzer等人首次將DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究，并證實了這種技術(shù)在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優(yōu)越性。DGGE可以將長度相同序列不同的DNA混合物進(jìn)行分離=DNA分子中堿基的組成和排列差異，會使不同序列的雙鏈DNA分子具有不同的解鏈溫度，當(dāng)雙鏈DNA分子在含梯度變性劑(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時，當(dāng)某一雙鏈DNA序列遷移到變性凝膠的一定位置，并達(dá)到其解鏈溫度時，即開始部分解鏈，部分解鏈的DNA分子的遷移速度隨解鏈程度增大而減小，從而使具有不同序列的DNA片段滯留于凝膠的不同位置，達(dá)到分離的目的。將嵌套PCR和DGGE聯(lián)合起來，理論上講能夠分辨出一個堿基對的差異，分辨率較高。DGGE指紋圖譜上條帶數(shù)的多少在一定程度上可以反應(yīng)樣品中微生物組成的差異，條帶的亮度在一定程度上可以反應(yīng)出樣品中微生物的多少，相對于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法有明顯的優(yōu)勢。麥芽(由啤酒大麥通過在人工控制的、適宜的外界條件下，有限制的發(fā)芽過程而得到的產(chǎn)品)是啤酒釀造的主要原料，啤酒大麥在田間生長時就已經(jīng)附著成千上萬的微生物，微生物在制麥過程中影響著麥芽的品質(zhì)，并與啤酒釀造中所產(chǎn)生的問題息息相關(guān)。因此，利用嵌套PCR-DGGE技術(shù)分析啤酒大麥或大麥麥芽中的微生物群落結(jié)構(gòu)意義重大而深遠(yuǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種分析啤酒大麥或大麥麥芽微生物群落的方法，采用Nested PCR-DGGE技術(shù)分析啤酒大麥或大麥麥芽中微生物的群落結(jié)構(gòu)，避免了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法存在的耗時等缺陷。本發(fā)明不同于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)，選擇細(xì)菌16S rDNA、真菌18S rDNA的通用引物擴(kuò)增并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，分析啤酒大麥或大麥麥芽中的優(yōu)勢微生物及影響麥芽品質(zhì)的主要微生物。本方法具有方便、省時、重復(fù)性好等特點，若結(jié)合傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)能夠更好地反映啤酒大麥或大麥麥芽中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成，對研究微生物對麥芽品質(zhì)的影響有著重要的指導(dǎo)意義。
本發(fā)明的技術(shù)方案用土壤DNA抽提試劑盒提取啤酒大麥或大麥麥芽樣品的基因組DNA，Nested PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA、真菌18S rDNA部分序列，產(chǎn)物經(jīng)DGGE電泳分離后，對主要條帶進(jìn)行割膠回收，T-A克隆，測序分析，鑒定條帶對應(yīng)的微生物，測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行檢索。本發(fā)明通過Nested PCR-DGGE技術(shù)分析啤酒大麥或大麥麥芽中微生物的群落結(jié)構(gòu)，可以對不同地區(qū)、不同品種的啤酒大麥或大麥麥芽進(jìn)行微生物群落分析，也可以分析制麥過程中微生物群落的變化規(guī)律，為研究微生物對啤酒大麥或大麥麥芽品質(zhì)的影響以及改善國產(chǎn)啤酒大麥麥芽釀造性能奠定了一定基礎(chǔ)。


圖I細(xì)菌16SrDNA分析

A :第一輪PCR ；B :第二輪PCR，BUB2為啤酒大麥樣品，ml、m2為大麥麥芽樣品。圖2真菌16SrDNA分析圖中A :第一輪PCR ；B :第二輪PCR，BI、B2為啤酒大麥樣品，ml、m2為大麥麥芽樣品。圖3細(xì)菌16S rDNAV3區(qū)分析A :啤酒大麥，B :大麥麥芽。圖4真菌18S rDNA分析中A :啤酒大麥，B :大麥麥芽。圖5微生物群落分析實例具體實施方法實施例I樣品基因組DNA提取取3份經(jīng)液氮研磨好的樣品(0. 5g)，用土壤DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，詳細(xì)步驟參照說明書。得到的粗DNA用核酸蛋白定量儀檢測后存于-20°C備用。實施例2嵌套PCR反應(yīng)分別合成細(xì)菌16S rDNA、真菌18S rDNA的嵌套PCR引物對，見下表
權(quán)利要求
1.一種分析啤酒大麥或大麥麥芽微生物群落的方法,其特征在于提取啤酒大麥或大麥麥芽樣品基因組DNA后，通過第一輪PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA和真菌18S rDNA ;再次通過第二輪PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)變性梯度凝膠電泳分析后，對主要條帶進(jìn)行割膠回收；T-A克隆，測序分析，及BLAST比對獲取微生物群落信息；所述第二輪PCR時在引物對的正向引物的5’端加上GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)； 所述16S rDNA的第一輪PCR所用引物對為27F :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R :5’ -GGCTACCTTGTTACGACTT-3’ ； PCR 反應(yīng)程序為95°C 5min ；95°C lmin,50°C lmin,72°C lmin，30 個循環(huán)；所述 18SrDNA第一輪PCR所用弓I物對為NSl :5’ -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，F(xiàn)Rl :5’ -AICCATTCAATCGGTAIT-3’ ； PCR 反應(yīng)程序為95 °C 8min ;95 °C lmin, 50 °C lmin, 72 °C 2min，30 個循環(huán)；72 °CIOmin ;所述16S rDNA的第二輪PCR所用引物對為F341-GC :5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG*CCTACGGGAGGCAGCAG-3’，R518 :5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’ ； PCR 反應(yīng)程序為94°C 4min ;94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 45s，30 個循環(huán)；72°C IOmin ；所述18S rDNA第二輪PCR所用引物對為NS3-GC 5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG*GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC-3，，YM951r :5’ -TTGGCAAATGCTTTCGC-3’ ； PCR 反應(yīng)程序為94 °C 4min ；94 °C lmin, 52 °C lmin, 72 °C lmin，30 個循環(huán)；72 °ClOmin。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述啤酒大麥或大麥麥芽樣品采用縮分法取樣，最終樣品的重量為0. 5g。
3.權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系為模板DNA0. 5 y L，引物各0.4uM, dNTPs 0. 2mM, rTaq 酶 2. 5U, Tris-HCl (pH 8. 3) IOmM, KCl 50mM, MgC121. 5mM, ddH20補足25 ii L ;將第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍后做第二輪PCR反應(yīng)中的模板DNA。
4.權(quán)利要求1-2所述的方法，其特征在于所述變性梯度凝膠電泳的相關(guān)參數(shù)是細(xì)菌電泳條件為8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑梯度范圍為459^65%，其中100%的變性劑濃度為7M尿素、40%甲酰胺，電泳溫度60°C，電壓150V ;電泳時間5. 5h ;電泳緩沖液為IXTAEbuffer ;真菌電泳條件按為8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑梯度范圍為30% 50%，其中100%的變性劑濃度為7M尿素、40%甲酰胺，電泳溫度60°C，電壓150V ;電泳時間6. 5h ;電泳緩沖液為 I X TAEbuffer。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種嵌套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(Nested PCR-DGGE)分析啤酒大麥或大麥麥芽中微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，該方法屬于微生物生態(tài)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用土壤DNA抽提試劑盒提取啤酒大麥、大麥麥芽樣品的基因組DNA,采用嵌套PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA、真菌18S rDNA序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE分析后，對主要條帶進(jìn)行割膠回收，再次PCR后瓊脂糖膠回收，T-A克隆，測序分析獲取微生物的相關(guān)信息。本發(fā)明方便、快捷、重復(fù)性好，對分析啤酒大麥或大麥麥芽中的微生物及微生物對麥芽品質(zhì)的影響具有很好的指導(dǎo)意義。
文檔編號C12Q1/68GK102653796SQ20121016816
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者商曰玲, 張中華, 梁小剛, 蔡國林, 陸健 申請人:江南大學(xué)