專利名稱：：提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法及其質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是ー種生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
的方法及其質(zhì)粒，具體是ー種提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法及其質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
：隨著細胞生物學以及生物工程技術(shù)在微生物尤其是抗生素育種領(lǐng)域的應(yīng)用，基因工程育種技術(shù)已成為主要的菌種改良手段，并且在改良エ業(yè)生產(chǎn)菌種方面已獲得巨大的成功。生物工程育種技術(shù)在一定范圍內(nèi)克服了傳統(tǒng)育種技術(shù)的隨機性和盲目性，可以借助對微生物次級代謝生物合成途徑的認識，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗生素高產(chǎn)菌株，有助于次級代謝產(chǎn)物的エ業(yè)生產(chǎn)。在微生物菌種選育領(lǐng)域中，通過基因工程技術(shù)將目的基因與載體在體外連接然后轉(zhuǎn)入受體細胞，使外源基因在受體中穩(wěn)定表達遺傳。主要途徑包括有①通過調(diào)節(jié)基因的加倍或失活、提高抗生素的主動外排效率等來提高抗生素的產(chǎn)量；②在宿主細胞中引入増加前體物和輔因子的供給的外源基因，提高活性物質(zhì)的生物合成量；③通過激活或抑制支路代謝以改變生物活性分子的活性成分或比例，提高最佳活性組分的積累、降低或消除低活性次級組分的積累。AdpA是廣泛存在于鏈霉菌中的ー個全局性正調(diào)節(jié)因子，是A-因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可激活形態(tài)分化和次級代謝產(chǎn)物所需基因的表達。在天藍色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、抗生鏈霉菌和阿維鏈霉菌中，AdpA正調(diào)節(jié)黑色素的生物合成。目前還沒有文獻報道adpA基因在抗生素產(chǎn)生菌株里的表達對其抗生素產(chǎn)量的影響。透明顫菌(Vitreoscilla)是ー種專性好氧的絲狀革蘭氏陰性細菌,Vgb基因編碼的透明顫菌的血紅蛋白具有結(jié)合氧的特性可以促進微生物細胞內(nèi)氧的傳輸，提高氧的利用率。對許多在溶氧不足的情況下，Vgb表達會促進宿主的生長，蛋白的分泌，代謝物的產(chǎn)生以及增強抗壓性。將透明顫菌血紅蛋白基因整合到異源宿主菌中可以增加重組蛋白產(chǎn)量和發(fā)酵物產(chǎn)量。經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，在抗生素生產(chǎn)中，Vgb基因可明顯促進肉桂地鏈霉菌的菌體生長和抗生素莫能菌素合成(文瑩，宋淵.透明顫菌血紅蛋白在肉桂地鏈霉菌中的表達對其細胞生長及抗生素合成的影響.生物工程學報，2001，17(1):24-28)。Saccharopolysporaerythraea中Vgb基因的表達使紅霉素的產(chǎn)量提高60%(Brunker,P.geneticengineeringofanindustrialstrainof^accharopolysporaerythraeaforstableexpressionoftheVitreoscillhemoglobingene(vhb).Microbiology1998,144(9):2441-2448)。S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，簡稱SAM)，由三磷酸腺苷和L-甲硫氨酸經(jīng)SAM合成酶催化反應(yīng)合成。作為生物合成過程中的重要中間代謝物質(zhì)，SAM合成酶基因metK在很多鏈霉菌中的高效表達都能夠有效提高其代謝物的產(chǎn)生。在天藍色鏈霉菌里，SAM合成酶基因metK的高效表達能夠大大提高放線紫紅素的產(chǎn)量(OkamotoSjLezhavaA.EnhancedexpressionofS-AdenosylmethioninesynthetasecausesoverproductionofactinorhodininStreptomycescoelicolorA3(2).JBacteriol,2003,185(2)601-609);在Saccharopolysporaerythraea中異源表達S_腺苷甲硫氨酸合成酶基因可以提高紅霉素A的產(chǎn)量(WangY,WangYG.ImprovedproductionoferythromycinAbyexpressionofaheterologousgeneencodingS-adenosylmethioninesynthetase.ApplMicrobiolBiotechnol,2007,75(4):837-842)；Streptomycesactuosus中SAM合成酶基因metK的高效表達促進了那西肽的合成(ZhangXC,FenMQ.OverexpressionofyeastS-adenosylmethioninesynthetasemetKinStreptomycesactuosusleadstoincreasedproductionofnosiheptide.ApplMicrobiolBiotechnol,2008,78(6)991-995)。但是上述現(xiàn)有技術(shù)僅是單一基因在某些微生物菌株中的表達，其對代謝產(chǎn)物的影響作用還是有限的，對于整個代謝工程仍是非常不充分的。微生物菌株自身復(fù)雜的代謝途徑以及細胞循環(huán)中復(fù)雜的調(diào)節(jié)方式及其特異性，決定了對其代謝流中的某個反應(yīng)進行定向改變依然是不夠的，對微生物代謝途徑的生化改造可以多步進行，最大限度的增加代謝產(chǎn)物的積累。近年來，由于DNA重組技術(shù)的發(fā)展，使得用基因技術(shù)改造代謝途徑成為可能。本發(fā)明根據(jù)上述技術(shù)的不足，設(shè)計了一個全新的提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法及質(zhì)粒，將多個與抗生素合成相關(guān)的具有廣泛正調(diào)控作用的基因構(gòu)建在一個載體上同時表達，構(gòu)建的質(zhì)?？梢栽诓煌溍咕曛羞M行表達，有效提聞各種抗生素的廣量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法及其質(zhì)粒，在抗生素生產(chǎn)菌株里同時引入包括調(diào)節(jié)基因、前體合成基因等外源基因以增加抗生素的產(chǎn)量。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法，通過構(gòu)建metK基因和/或VgbS基因和/或adpA-c基因的對應(yīng)整合表達質(zhì)粒pFMetK、pFVgb、pFAdpA、pFMV、pFMA以及pFMVA，并將所述的整合表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入鏈霉菌ZYJ-6中，實現(xiàn)產(chǎn)量的提高。所述的metK基因，是指S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，如SeqIDNo.I所示；所述的VgbS基因，是指透明顫菌血紅蛋白合成基因，如SeqIDNo.2所示；所述的adpA-c基因，是指鏈霉菌中的全局性正調(diào)節(jié)基因，如SeqIDNo.3所示；所述的構(gòu)建包括以下六種方式中的任意一種I)含有天藍色鏈霉菌metK基因質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴增天藍色鏈霉菌M145中不帶原始啟動子的metK基因，具體步驟包括在天藍色鏈霉菌的metK基因內(nèi)部設(shè)計引物metKF2/metKR，在ATG密碼子處加入了一個NdeI酶切位點；將擴增到的不帶原始啟動子的1334bp的metK基因插入pBlueScriptllSK(+)的EcoRV位點構(gòu)建4292bp的克隆pJTU2524；用NdeI和EcoRI將無啟動子的metK基因片段從pJTU2524上切下插入到含有紅霉素抗性基因強啟動子PermE*的pIB139載體中，得到質(zhì)粒pFMetK。所述的引物metKF2/metKR的序列為metKF2(5’-CAGGGAGCCATATGTCCCGT-3’)；metKR(5，-TCGCAAAGGCCACTGACAACA-3，)。2)含有透明顫菌血紅蛋白合成基因VgbS質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒PJTU4405含有全基因合成vgbS，長度456bp，在基因VgbS兩端分別引入了NdeI和EcoRI酶切位點。用NdeI和EcoRI雙酶切帶有透明顫菌VgbS基因的質(zhì)粒pJTU4405。將vgbS基因(441bp)插入含有紅霉素抗性基因強啟動子PermE*的鏈霉菌整合型載體pIB139的對應(yīng)位點，得到質(zhì)粒pFVgb。3)含有天藍色鏈霉菌adpA-c基因質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴增天藍色鏈霉菌中的adpA-c基因，具體步驟包括設(shè)計引物adpAc2F/adpAclR，在ATG密碼子處加入了ー個NdeI酶切位點；將1556bp的adpA-c擴增片段插入到pBlueScriptllSK(+)的EcoRV位點，得到質(zhì)粒pJTU2520;再用NdeI和EcoRI將adpA_c從pJTU2520上切下插入到帶有紅霉素啟動子的質(zhì)粒pIB139的相應(yīng)位點,得到質(zhì)粒pFAdpA。所述的引物adpAc2F/adpAclR的序列為adpAc2F(5’-GGCTTAGCCATATGAGCCAC-3’)；adpAclR(5，-CGTTCATGCGGGCCACTTTA-3，)。4)含有metK和VgbS兩個基因的質(zhì)粒pFMV的構(gòu)建用NdeI和EcoRI將VgbS從PJTU4405上切下插入pJTU968的相應(yīng)酶切位點，再用MunI和EcoRI將帶有紅霉素強啟動子的vgbS基因片段插入到pFMetK質(zhì)粒的EcoRI位點，得到質(zhì)粒pFMV。5)含有metK和adpA_c兩個基因的質(zhì)粒pFMA的構(gòu)建用NdeI和EcoRI將adpA_c從PJTU2520上切下插入到帶有紅霉素啟動子的質(zhì)粒PJTU968的相應(yīng)位點，再用MunI和EcoRI將帶有紅霉素強啟動子的adpA-c基因片段插入到pFMetK質(zhì)粒的EcoRI位點，構(gòu)建質(zhì)粒pFMA。6)含有metK、vgbS和adpA-c的質(zhì)粒pFMVA的構(gòu)建用MunI和EcoRI將帶有紅霉素啟動子的adpA-c從pJTU2522上切下插入到pFMV的EcoRI位點，得到質(zhì)粒pFMVA。步驟I)所述的載體pIB139是含有紅霉素抗性基因強啟動子PermE*的鏈霉菌整合型載體，記載于WilkinsonCJ,Hughes-ThomasZA,MartinCJ,BohmI,MironenkoT,DeaconM,WheatcroftM,WirtzG,StauntonJ,LeadlayPF.Increasingtheefficiencyofheterologouspromotersinactinomycetes.JMolMicrobBiotech,2002,4(4)417-426。本實施例涉及的載體pIB139由朱冬青博士贈送。步驟2)中所述的質(zhì)粒PJTU4405由朱冬青博士贈送，通過以下方式制備得到將vgb基因在鏈霉菌中使用頻率不高的密碼子改為在鏈霉菌中使用頻率最高的密碼子，保持氨基酸序列不變，產(chǎn)生新的基因vgbS。在基因vgbS兩端分別引入NdeI和EcoRI的酶切位點，其中在vgbS核苷酸序列的5’端添加7個核苷酸，形成限制性內(nèi)切酶NdeI位點和保護堿基，在vgbS核苷酸序列的3’端添加8個核苷酸，形成限制性內(nèi)切酶EcoRI位點和保護堿基。將vgbS全基因合成,全長456bp。合成的456bp的vgbS的DNA被插在載體pGH的SmaI位點,產(chǎn)生質(zhì)粒PJTU4405，測序證明合成無誤。其中基因全合成、插入載體、測序驗證由上海美季生物技術(shù)有限公司完成。所述的轉(zhuǎn)入是指將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，經(jīng)水浴熱激后置于培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，具體步驟包括將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567/PUZ8002中并挑轉(zhuǎn)化子在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶有轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567/PUZ8002，該液體LB培養(yǎng)基內(nèi)存在有終濃度為25iig/iiL的氯霉素，50ug/uL的卡那霉素和30iig/iiL的阿泊拉霉素。37°C培養(yǎng)8小時后收集菌體，用新鮮LB培養(yǎng)基洗滌菌體3次備用。將鏈霉菌孢子懸浮于5ml1￡3緩沖液中，該緩沖液濃度為0.0511101/1，？11值為8.0。然后在55°C水浴中熱激lOmin，冷卻至室溫后，按IO8IO8與大腸桿菌細胞等量混合后涂在SFM培養(yǎng)基平板上，該培養(yǎng)基平板組分為2%瓊脂糖(m/v)，2%甘露醇(m/v)，2%黃豆餅粉(m/v)，培養(yǎng)平板pH值為7.27.5，吹干后放在30°C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。12小時后用含萘啶酮酸和阿泊拉霉素的Iml無菌水覆蓋平板，平板上萘啶酮酸的終濃度為50ng/mL，阿泊拉霉素為30ng/mL，置30°C培養(yǎng)3天后即可看到轉(zhuǎn)移接合子。所述的大腸桿菌ET12567/pUZ8002公開于Paget,M.S.,Chamberlin,L.,Atrih,A.,Foster,S.J.,andButtner,M.J..EvidencethattheextracytoplasmicfunctionsigmafactoroEisrequiredfornormalcellwallstructureinStreptomycescoelicolorA3(2).J.Bacteriol,1999,181:204_211。所述的鏈霉菌ZYJ-6是指產(chǎn)生殺念菌素D單組分的突變株，通過以下方式制備得到(一)確定功能域KR21(存在于聚酮合酶FscF)和DH18(存在于聚酮合酶FscE)的催化活性位點。(二)設(shè)計并構(gòu)建分別用于對KR21和DH18的催化活性位點進行突變的同源重組載體PJTU573和pJTU572。(三)把PJTU573通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入鏈霉菌FR-008進行同源重組。(四)首先通過硫鏈絲菌素抗性影印篩選，進而通過PCR以及對PCR產(chǎn)物酶切驗證和測序驗證的方法最終篩選到KR21突變株。(五)同樣方法，把PJTU572轉(zhuǎn)入KR21突變株進行同源重組，最終篩選到KR21和DH18雙突變株ZYJ-6。本發(fā)明涉及的定向生產(chǎn)殺念菌素單一組份FR-008-111，其產(chǎn)量是野生型菌株該組份產(chǎn)量的120-130%，而FR-008-III是殺念菌素3個主要組分中最具藥用價值的成份。通過該工程菌可以大規(guī)模生產(chǎn)高純度的殺念菌素有效組份，所以具有顯著的工業(yè)應(yīng)用價值。本發(fā)明涉及的定向積累殺念菌素單一組份FR-008-III的基因工程菌株，其中的雙突變株ZYJ-6公開于ZhouYJ,LiJL,ZhuJ,ChenS，BaiLQ,ZhouXF,WuHM,DengZX.Incomplete旦—KetoneProcessingasaMechanismforPolyeneStructuralVariationintheFR-008/CandicidinComplex.Chemistry&Biology,2008,15629-638。所述的雙突變株ZYJ-6(鏈霉菌Streptomycessp.)已于2008年3月7日提交位于北京市朝陽區(qū)大屯路，郵編100101(中國微生物研究所)的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，其保藏登記編號為CGMCCNO.2394。本發(fā)明提供了一種提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法和質(zhì)粒，通過對抗生素的生物合成有廣泛促進作用的3個基因采取在一個載體上同時進行表達的方式，利用接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入鏈霉菌中進行高效表達以提高抗生素的產(chǎn)量。圖I為表達質(zhì)粒的構(gòu)建圖。圖2為菌株ZYJ-6/pFMetK，ZYJ-6/pFMV,ZYJ-6/pFMA,ZYJ-6/pFMVA中metK基因的PCR驗證。圖3為菌株ZYJ-6/pFVgb，ZYJ-6/pFMV,ZYJ-6/pFMVA菌株中vgbS基因的PCR驗證。圖4為菌株ZYJ-6/pFAdpA，ZYJ-6/pFMA,ZYJ-6/pFMVA中adpA-c基因的PCR驗證。圖5為分光光度法分析菌株ZYJ-6和ZYJ-6/pFMetK，ZYJ-6/pFVgb，ZYJ-6/pFAdpA，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMA,ZYJ-6/pFMVA中殺念菌素FR-008-III在不同培養(yǎng)時間的產(chǎn)量變化。圖6為定量分析出發(fā)菌株ZYJ-6和高產(chǎn)菌株ZYJ-6/pFMVA中殺念菌素FR-008-III的產(chǎn)量變化。具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例I制備產(chǎn)生殺念菌素D單組分的突變株(一)質(zhì)粒的構(gòu)建(用于轉(zhuǎn)入宿主并和染色體發(fā)生同源重組以便獲得目標突變)(I)用于KR21功能域突變的質(zhì)粒構(gòu)建EcoRI和KpnI酶解鏈霉菌FR-008文庫柯斯質(zhì)粒pHZ220后回收3615-bpEcoRI-KpnIDNA片段作為PCR模板，引物Pl和P3用來擴增528-bpDNA片段；P4和P2用來擴增618-bpDNA片段。P3和P4有18_bp的重疊，在該重疊區(qū)域引入突變位點(Y1526F)，同時引入DNA限制性酶切位點(ApoI)以便該突變的篩選(如圖I所示)。通過第二次PCR(引物為Pl和P2;模板為瓊脂糖膠回收后的兩個PCR產(chǎn)物各取1/100加入PCR體系)得到1146-bpDNA片段。1146-bpDNA片段被克隆在T-vector(得到質(zhì)粒pJTU566)上并經(jīng)過測序確認正確后又被酶解成849-bpSacI-SfiIDNA片段。849-bpSacI-SfiIDNA片段被用來替換3615-bpEcoRI-KpnIDNA片段(由EcoRI-KpnI酶解pHZ220后回收得到，并克隆在PIJ2925載體上而得到質(zhì)粒pJTU569)內(nèi)部對應(yīng)的區(qū)域從而得到質(zhì)粒PJTU571。重組后的3615-bpEcoRI-KpnIDNA片段包含了目標突變位點和分布于突變位點兩邊的用于和染色體發(fā)生同源交換的兩個臂(分別為1948-bp和1667-bp)。該3615-bpDNA重組片段最終被克隆在PHZ1358(大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒)BamHI位點，從而得到用于和染色體發(fā)生同源重組的質(zhì)粒PJTU573。PCR反應(yīng)引物P1,5'-CCGCCTCACCCAACTGCC-3'P3,5'-GCGACGAAATTTGCCTGGCCG-3'P4,5'-CCAGGCAAATTTCGTCGCCGC-3'P2，5'-GGGGAGCCGCTGTCGTAGA-3'(下劃線表示引入的限制性酶切位點ApoI)PCR反應(yīng)體系0.Iug模板DNA，引物各50pmol，4uLDMSO,2uLMg2+，5uLdNTP,5uL緩沖液和I個單位KODDNA聚合酶(TOYOTA)，加純水到50uL。PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為95°C(5分鐘)；32個循環(huán)的95°C(30秒)，60°C(30秒)和68°C(36秒);最后是68°C5分鐘。(注引物為Pl和P2的第二輪PCR延伸時間為66秒)。PCR產(chǎn)物末端加A(以便于克隆在T-Vector)堿基的條件為50iigPCR產(chǎn)物，5iiLdATP，2個單位TagDNA聚合酶，5uL緩沖液，2uLMg2+,加純水至50uL.72°C20分鐘。(2)用于DH18功能域突變的質(zhì)粒構(gòu)建用于DH18功能域活性位點相應(yīng)編碼堿基突變的兩個同源交換臂分別由PCR擴增獲得。PCR模板為鏈霉菌FR-008文庫柯斯質(zhì)粒PHZ220的DNA。擴增1475-bpDNA片段所用引物為DH18P1和DH18P2;擴增1203-bpDNA片段所用引物為:DH18P3和DH18P4。突變位點分別通過引物DH18P2和DH18P3引入，同時又引入限制性酶切位點BsrGI以便于突變篩選(如圖I所示)。1475-bpPCR產(chǎn)物插入pBluescriptIISK(+)EcoRV位點后得到質(zhì)粒PJTU568，并進行了測序驗證。1203-bpPCR產(chǎn)物克隆在T-Vector上而得到質(zhì)粒pJTU565，并進行了測序驗證。從PJTU565酶解得到的I.2kbBsrGI-KpnIDNA片段被插入到pJTU568相應(yīng)位點后得到質(zhì)粒PJTU570，從而使得兩個同源交換臂在BsrGI位點拼接.該2.6kb重組片段又被BamHI從pJTU570上切出，進而又插入到pHZ1358載體BamHI位點而得到同源重組質(zhì)粒PJTU572。PCR引物DH18PL5'-GACACGGAGTCCCCCGAGCCCCAGG-3'DH18P2，5'-CCGACGGTGTACACGGCGAGCCAGG-3'DH18P3，5'-CCTGGCTCGCCGTGTACACCGTCGG-3'DH18P4,5'-CGCCCGAGAGCGGACCGAGGAGTTG-3'(下劃線表示引入的限制性酶切位點BsrGI)PCR條件1475-bpPCR產(chǎn)物(引物為DH1SP1和DHl8P2)由KODDNA聚合酶(TOYOTA)擴增。PCR反應(yīng)體系同上。PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為95°C(5分鐘)；32個循環(huán)的95°C(30秒)，570C(30秒)和68°C(90秒)；最后是68°C5分鐘。1203-bpPCR產(chǎn)物(引物為DH18P3和DH18P4)由TagDNA聚合酶擴增。PCR條件PCR反應(yīng)體系0.Iiig模板DNA，引物各40pmol，3iiLDMS0,2uLMg2+,3uLdNTP,4uL緩沖液和I個單位TagDNA聚合酶，加純水到40uL。PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為95°C(5分鐘)；32個循環(huán)的95°C(30秒)，60°C(30秒)和72°C(20秒)；最后是72°C5分鐘。(二)把用于和染色體發(fā)生同源重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生型宿主通過電轉(zhuǎn)把pHZ1358衍生質(zhì)粒(PJTU572或pJTU573)分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567(攜帶接合轉(zhuǎn)移輔助質(zhì)粒pUZ8002)中，以便于pJTU572或pJTU573在輔助質(zhì)粒PUZ8002的協(xié)助，通過接合轉(zhuǎn)移進入受體鏈霉菌FR-008細胞中。先在合適的抗生素存在下培養(yǎng)攜帶PUZ8002和待轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大腸桿菌，12小時后收集菌體，用新鮮LB培養(yǎng)基洗滌菌體3次備用。作為受體的鏈霉菌孢子需經(jīng)熱激和預(yù)萌發(fā)處理。將鏈霉菌孢子懸浮于TES緩沖液(5ml0.05mol/L，pH8.0)中，在50°C水浴中熱激5min，冷卻至室溫后加入等體積2X孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基(Difco酵母粉I%，Difco酪蛋白氨基酸I%，CaCl2O.OImoI/L)，37°C搖床(250rpm)培養(yǎng)2h，離心收集孢子并重新均勻懸浮于適量的LB培養(yǎng)基中，按108108與大腸桿菌細胞等量混合后涂在培養(yǎng)平板(2%瓊脂糖，2%甘露醇，2%黃豆餅粉，pH7.27.5)上，進行細菌雙親接合轉(zhuǎn)移。11小時后用含萘啶酮酸(抑制大腸桿菌的生長)和硫鏈絲菌素(轉(zhuǎn)入質(zhì)粒帶有此抗性)的Iml無菌水覆蓋平板(終濃度萘唳酮酸50ng/mL;硫鏈絲菌素25ng/mL)，置30°C培養(yǎng)3天后即可看到轉(zhuǎn)移接合子。(三)突變株的篩選和驗證從覆蓋板上挑選單個接合轉(zhuǎn)移子接種到抗性(硫鏈絲菌素)平板上進ー步確認抗性，再轉(zhuǎn)接到不加抗生素(硫鏈絲菌素)的平板上進行松弛培養(yǎng)，進而通過抗性平板和非抗平板影印實驗篩選到若干硫鏈絲菌素敏感的菌株(突變株的備選株)。以備選株總DNA作為PCR模板；引物Pl和P4用于KR21突變的篩選，1146_bp源自于突變株KR21突變的PCR產(chǎn)物可以被ApoI酶解為528-bp和618-bpDNA片段，而源自于野生型的同樣大小PCR產(chǎn)物不能被ApoI酶解；引物DH-test-L和DH-test-R用于DH18突變的篩選，706-bp源自于DH18突變的PCR產(chǎn)物可以被BsrGI酶解為244_bp和462_bpDNA片段，而源自于野生型的PCR產(chǎn)物不能被BsrGI酶解。源自于KR21突變和DH18突變的PCR產(chǎn)物被分別克隆在T-Vector上進行測序驗證，從而最終確證了目標突變的正確性。KR21突變株P(guān)CR篩選條件引物Pl和P4。PCR反應(yīng)體系0.05μg模板DNA，引物各20pmol,IμLDMSO,IμLMg2+，2μLdNTP,2μL緩沖液和O.5個單位TagDNA聚合酶，加純水到20μしPCR反應(yīng)的循環(huán)條件為95°C(5分鐘)；32個循環(huán)的95°C(30秒)，60°C(30秒)和72°C(22秒)；最后是72°C5分鐘。DH18突變株P(guān)CR篩選條件引物DH-test-L，5'-GCTCTACCGTCCGCTTCGCC-3'DH-test-R,5'-CTGTGTCCAGGTGGCGTCCG-3'PCR反應(yīng)條件復(fù)性64°C，延伸15秒.其余同KR21突變株篩選.(四)雙突變株(ZYJ-6)的獲得先把同源重組質(zhì)粒PJTU573通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入鏈霉菌FR-008細胞中發(fā)生同源重組，篩選并得到KR21突變株。再把質(zhì)粒PJTU572轉(zhuǎn)入KR21突變株細胞內(nèi)通過同源重組對DH18進行突變，最終篩選得到KR21和DH18雙突變菌株ZYJ-6。(五)突變菌株的發(fā)酵培養(yǎng)平板發(fā)酵2%瓊脂糖，2%甘露醇，2%黃豆餅粉(煮沸熬制后過濾去渣)，pH7.27.5，孢子接種，30°C，6天。(六)抗生素的分離純化刮取平板孢子，稱量后用10倍體積甲醇超聲萃取3次。合并萃取液40°C旋轉(zhuǎn)蒸干后重溶于少量體積甲醇，O.25uM濾膜過濾后-20°C避光保存以備檢測。(七)LC-MS對發(fā)酵產(chǎn)物檢測高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)檢測結(jié)果表明突變株ZYJ-6僅生產(chǎn)FR-008-III(CandicidinD)，而不再積累原始組份FR-008_V和FR-008-VI。HPLC檢測結(jié)果如圖2所示。LC-MS是在安捷倫公司的AgilentIlOOseriesLC/MSDTrapsystem上進行。高壓液相工作條件為柱子(agilentEclipseXDB-C18,4.6X250mm);流速0.6ml/min;流動相45%乙晴和55%5.5mMNH4AC(pH4.5);檢測波長380nm;柱溫25°C。質(zhì)譜工作條件負離子模式；干燥氣流101/min;噴霧器壓力50psi;干燥氣溫3500C;轟擊電壓1.0-1.8V。實施例2先把同源重組質(zhì)粒PJTU572通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入鏈霉菌FR-008細胞中發(fā)生同源重組，篩選并得到DH18突變株。再把質(zhì)粒PJTU573轉(zhuǎn)入DH18突變株細胞內(nèi)通過同源重組對KR21進行突變，最終篩選得到KR21和DH18雙突變菌株ZYJ-6。實施例3鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的提高步驟一,表達質(zhì)粒的構(gòu)建。本實施例涉及的基因表達載體PIB139是一個含有紅霉素抗性基因強啟動子PermE*的鏈霉菌整合型載體，可以通過大腸桿菌和鏈霉菌之間的兩親本接合轉(zhuǎn)移進入鏈霉菌，發(fā)生位點特異性重組后整合在鏈霉菌的染色體上，隨著染色體一起復(fù)制和遺傳。圖I為本實施例中涉及的所有表達質(zhì)粒構(gòu)建圖。步驟二，把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入鏈霉菌宿主以及接合轉(zhuǎn)移子的篩選和驗證將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，挑轉(zhuǎn)化子在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶有轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567/pUZ8002，該液體LB培養(yǎng)基內(nèi)存在有終濃度為25ug/uL的氯霉素，50ug/uL的卡那霉素和30yg/yL的阿泊拉霉素。37°C培養(yǎng)8小時后收集菌體，用新鮮LB培養(yǎng)基洗滌菌體3次備用。將鏈霉菌孢子懸浮于5mlTES緩沖液中，該緩沖液濃度為0.05mol/L，pH值為8.O。然后在55°C水浴中熱激lOmin，冷卻至室溫后，按IO8IO8與大腸桿菌細胞等量混合后涂在SFM培養(yǎng)基平板上，該培養(yǎng)基平板組分為2%瓊脂糖(m/v)，2%甘露醇(m/v)，2%黃豆餅粉(m/v)，培養(yǎng)平板pH值為7.27.5，吹干后放在30°C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。12小時后用含萘啶酮酸和阿泊拉霉素的Iml無菌水覆蓋平板，平板上萘啶酮酸的終濃度為50ng/mL，阿泊拉霉素為30ng/mL，置30°C培養(yǎng)3天后即可看到轉(zhuǎn)移接合子。從覆蓋板上挑選單個接合轉(zhuǎn)移子接種到阿泊拉霉素抗性平板上進一步確認抗性。以備選菌株的總DNA作為PCR模板，pFMetK，pFMA,pFMV，pFMVA四個質(zhì)粒中都含有metK基因，質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得的ZYJ-6/pFMetK，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMA,ZYJ-6/pFMVA菌株用PCR驗證使用的引物為metKTF/metKTR，PCR產(chǎn)物為986bp(見圖2)。圖2中I為marker，2、3、4、5分別為菌株ZYJ-6/pFMetK，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMA,ZYJ-6/pFMVA的染色體為模板可以擴增得到986bp擴增帶。pFVgb，pFMV，pFMVA三個質(zhì)粒中都含有VgbS基因，質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得的ZYJ-6/pFVgb，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMVA菌株用PCR驗證使用的引物為vgbTF/vgbTR，PCR產(chǎn)物為436bp(見圖3)。圖3中I為marker，2、3、4分別為菌株ZYJ-6/pFVgb，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMVA的染色體為模板可以擴增得到436bp擴增帶。pFAdpA，pFMA,pFMVA三個質(zhì)粒中都含有adpA基因，質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得的ZYJ-6/pFAdpA，ZYJ-6/pFMA,ZYJ6_/pFMVA菌株用PCR驗證使用的引物為adpATF/adpATR，PCR產(chǎn)物為620bp(見圖4)。圖4中I為marker，2、3、4分別為菌株ZYJ-6/pFAdpA，ZYJ-6/pFMA，ZYJ-6/pFMVA的染色體為模板可以擴增得到620bp擴增帶。引物序列metKTF:5'GAACAGACCCACGGGCTCGG3'metKTR:5'TGTCCCGTCGCCTGTTCACC3'vgbTF:5'GTGGACCAGCAGACCATCAA3'vgbTR:5'ACTCGACCGCCTGGGCGTAC3'adpATF:5'CGCAGGGACTGGAGGCGATC3'adpATR:5'CACCCGCTGGGTGATCAGCC3'PCR反應(yīng)體系0.Iiig模板DNA，引物各50pmol，4iiLDMS0,4uLdNTP,5uLPCR緩沖液和I個單位TagDNA聚合酶，該聚合酶為日本T0Y0B0公司產(chǎn)品，加純水到50yL。PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為94°C,5min；94°C,30s；57°C,30s;72°C，80s(30個循環(huán))；72°C延伸5min,4°C結(jié)束反應(yīng)。步驟三，菌株發(fā)酵以及抗生素的提取和檢測。將出發(fā)菌株ZYJ-6和獲得的ZYJ-6/pFMetK，ZYJ-6/pFVgb,ZYJ-6/pFAdpA，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMA,ZYJ-6/pFMVA六個菌株依次進行液體發(fā)酵及抗生素檢測。以菌株ZYJ-6作為宿主，以FR-008III組分的產(chǎn)量作為檢測標準。首先將菌株在SFM平板上活化，30°C培養(yǎng)3天。然后接種在25ml液體培養(yǎng)基TSBY(10.3%蔗糖)中，其中液體培養(yǎng)基TSBY的制備方法為胰蛋白胨(TSB)30g，Difco酵母粉5g，蔗糖340g(34%)或103g(10.3%)，定容至1000ml，分裝滅菌。30°C搖床培養(yǎng)24小時，取樣，離心，收菌體，烘干，稱干重，確定各菌種之間菌體密度的差異，調(diào)整到一致。按大約1/100體積比接種到50ml液體培養(yǎng)基YEME中，30°C搖床培養(yǎng)84小時。其中液體培養(yǎng)基YEME的制備方法為取Difco酵母粉3g，Difco蛋白胨5g，Oxoid麥芽粉3g，蔗糖103g，葡萄糖10g，然后定容至1000ml，滅菌，使用前補加2ml的無菌2.5MMgCl26H20溶液。在不同的培養(yǎng)時間取發(fā)酵液進行抗生素的提取和檢測。分別在36h，48h，60h，72h和84h取發(fā)酵液，然后加入2倍體積的正丁醇，振蕩萃取，離心取上清，重復(fù)三次，將菌液中的抗生素萃取出來，合并萃取液，在波長380nm處用分光光度計檢測(PerMnElmer)，同時以鏈霉菌FR-008的不產(chǎn)抗生素的突變株HJ-5(YirongZhang,LinquanBaiandZixinDeng.Functionalcharacterizationofthefirsttwoactinomycete4-amino-4-deoxychorismatelyasegenes.Microbiology,2009,155:2450-2459)的發(fā)酵液作為空白對照。實驗重復(fù)三次。圖5為菌株ZYJ-6和構(gòu)建的六個菌株ZYJ-6/pFMetK，ZYJ-6/pFVgb，ZYJ-6/pFAdpA，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMA,ZYJ-6/pFMVA產(chǎn)生的殺念菌素的產(chǎn)量分析。六個菌株與出發(fā)菌株同時進行平行發(fā)酵檢測，結(jié)果表明，前五個菌株使殺念菌素的產(chǎn)量依次提高了90%(pFMetK),130%(pFVgb),80%(pFAdpA),130%(pFMV),150%(pFMA)(見圖5);圖6表示三個基因的整合型質(zhì)粒pFMVA在ZYJ-6中的表達最終將殺念菌素的產(chǎn)量提高了2.I倍，產(chǎn)量從424ug/ml(ZYJ-6)提高到130lug/ml(ZYJ-6/pFMVA)。權(quán)利要求1.一種提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法，其特征在于，通過構(gòu)建vgbS基因的整合表達質(zhì)粒pFVgb，并將所述的整合表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入鏈霉菌ZYJ-6中，實現(xiàn)產(chǎn)量的提高。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法，其特征是，所述的VgbS基因，是指透明顫菌血紅蛋白合成基因，如SeqIDNo.2所示。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法，其特征是，所述的構(gòu)建包括含有透明顫菌血紅蛋白合成基因VgbS質(zhì)粒的構(gòu)建。4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法，其特征是，所述的轉(zhuǎn)入是指將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，經(jīng)水浴熱激后置于培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)。5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法，其特征是，所述的轉(zhuǎn)入是指.1)將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中并挑轉(zhuǎn)化子在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶有轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567/pUZ8002，該液體LB培養(yǎng)基內(nèi)存在有終濃度為.25ug/uL的氯霉素，50ug/uL的卡那霉素和30yg/yL的阿泊拉霉素，37°C培養(yǎng)8小時后收集菌體，用新鮮LB培養(yǎng)基洗滌菌體3次備用，將鏈霉菌孢子懸浮于5mlTES緩沖液中，該緩沖液濃度為0.05mol/L,pH值為8.0;.2)然后在55°C水浴中熱激lOmin，冷卻至室溫后，按IO8IO8與大腸桿菌細胞等量混合后涂在SFM培養(yǎng)基平板上，該培養(yǎng)基平板組分為2%瓊脂糖(m/V)，2%甘露醇(m/V)，2%黃豆餅粉(m/v)，培養(yǎng)平板pH值為7.27.5，吹干后放在30°C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)12小時；.3)用含萘啶酮酸和阿泊拉霉素的Iml無菌水覆蓋平板，平板上萘啶酮酸的終濃度為.50ng/mL,阿泊拉霉素為30ng/mL，置30°C培養(yǎng)3天后即可看到轉(zhuǎn)移接合子。6.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法，其特征是，所述的構(gòu)建是指質(zhì)粒PJTU4405含有全基因合成VgbS，長度456bp，在基因VgbS兩端分別引入了NdeI和EcoRI酶切位點，用NdeI和EcoRI雙酶切帶有透明顫菌VgbS基因的pJTU4405，將441bp的VgbS基因插入含有紅霉素抗性基因強啟動子PermE*的鏈霉菌整合型載體pIB139的對應(yīng)位點，得到質(zhì)粒pFVgb。7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法，其特征是，所述的鏈霉菌ZYJ-6是指產(chǎn)生殺念菌素D單組分的突變株。8.根據(jù)權(quán)利要求I或7所述的提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法，其特征是，所述的鏈霉菌ZYJ-6通過以下方式制備得到(一)確定存在于聚酮合酶FscF的功能域KR21和存在于聚酮合酶FscE的DHl的催化活性位點；(二)設(shè)計并構(gòu)建分別用于對KR21和DH18的催化活性位點進行突變的同源重組載體PJTU573和pJTU572；(三)把PJTU573通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入鏈霉菌FR-008進行同源重組；(四)首先通過硫鏈絲菌素抗性影印篩選，進而通過PCR以及對PCR產(chǎn)物酶切驗證和測序驗證的方法最終篩選到KR21突變株；(五)同樣方法，把PJTU572轉(zhuǎn)入KR21突變株進行同源重組，最終篩選到KR21和DH18雙突變株ZYJ-6。9.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法，其特征是，所述鏈霉菌ZYJ-6保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記編號為CGMCCNO.2394。全文摘要一種生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
的提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法，通過構(gòu)建metK基因和/或vgbS基因和/或adpA-c基因的對應(yīng)整合表達質(zhì)粒pFMetK、pFVgb、pFAdpA、pFMV、pFMA以及pFMVA，并將所述的整合表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入鏈霉菌ZYJ-6中，實現(xiàn)產(chǎn)量的提高。本發(fā)明在抗生素生產(chǎn)菌株里同時引入包括調(diào)節(jié)基因、前體合成基因等外源基因以增加抗生素的產(chǎn)量。文檔編號C12N15/76GK102703495SQ20121016822公開日2012年10月3日申請日期2011年3月8日優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日發(fā)明者朱冬青,王濤,由德林,白林泉,鄧子新申請人:上海交通大學