專利名稱：一種利用線粒體分子標記快速鑒定縊蟶群體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種縊蟶種質(zhì)鑒定，具體說，涉及ー種利用線粒體分子標記鑒定縊蟶群體的方法。
背景技術(shù)：
縊蟶是我國四大海產(chǎn)養(yǎng)殖貝類之一，具有生長快、養(yǎng)殖周期短、易管理、產(chǎn)量高、效益好等養(yǎng)殖特點。據(jù)統(tǒng)計，我國貝類的養(yǎng)殖產(chǎn)量占海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的82%。灘涂貝類的年產(chǎn)量近200萬噸，其中縊蟶的產(chǎn)量就已經(jīng)達到了 70萬噸，約占我國灘涂貝類養(yǎng)殖總產(chǎn)量的30%，在我國海水養(yǎng)殖中占有重要的地位。例如，我國浙江和福建一帯沿海是縊蟶的重要苗種產(chǎn)區(qū)，被運輸?shù)狡渌睾３鞘?進行養(yǎng)殖和銷售。近幾年，隨著縊蟶養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，江蘇和上海沿海灘涂也逐步開始引種養(yǎng)殖。異地苗種引進和養(yǎng)殖容易導致異地苗種與土著苗種的混雜，因此如何區(qū)分不同地區(qū)苗種以期進行后期苗種選擇，種質(zhì)資源保護和良種選育工作成為重要的課題。由于不同群體縊蟶表型相近，且容易受到環(huán)境因素的影響，因此依靠表型進行群體鑒別具有相當困難。線粒體屬于母系遺傳，變異速度較快，采用線粒體分子標記進行縊蟶群體的鑒別是非?？煽康姆肿由飳W方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種利用線粒體分子標記鑒定縊蟶群體的方法，該方法可靠性高。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是ー種利用線粒體分子標記快速鑒定縊蟶群體的方法，該方法包括以下步驟( I)采集縊蟶個體，提取DNA ；(2)合成線粒體細胞色素氧化酶I標記引物；(3)對縊蟶群體的線粒體細胞色素氧化酶I (COI)基因進行PCR擴增；(4)對PCR產(chǎn)物進行純化；(5)對純化的PCR產(chǎn)物進行測序和序列比對。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，步驟(I)中，所述標記引物為Sc-COI-F :5’ GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’ ；Sc-COI-R :5，TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AATCA 3。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，步驟(2)中，所述PCR擴增程序為(a) 94°C預變性3min,進行35個循環(huán)(b)94°C變性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 50s ；(c)最后 72°C延伸 lOmin。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，步驟(2)中，所述PCR擴增所用反應體系為25 ii L，含IOXBuffer 2. 5 u L, Mg2+2. OmmoI/dm3, dNTPO. 2mmol/dm3, TaqDNA 聚合酶 IU，上、下游引物各 0. 2 Ii mol/dm3,模板 DNA50_100ng。本發(fā)明的方法，鑒別方法簡單，可靠性強。


圖I是縊蟶江滬群體和浙閩群體的線粒體分子標記細胞色素氧化酶I(COI)序列。其中“*”表示江滬群體和浙閩群體的保守位點，“ ”表示鑒別江滬群體和浙閩群體的堿基位點，JSSc, SHSc, ZJSc和FJSc分別表示江蘇，上海，浙江和福建縊蟶個體。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進ー步說明本發(fā)明。 實施例I :利用本發(fā)明的方法，對縊蟶江滬群體和浙閩群體進行鑒別。(I)采集江蘇、上海、浙江和福建沿海灘涂的縊蟶個體，提取DNA ；在我國江蘇、上海、浙江和福建沿海灘涂隨機采集縊蟶個體。利用解剖刀和鑷子分別收集四個地區(qū)的縊蟶個體的外套膜組織，置于無水こ醇中保存?zhèn)溆?。采用酚氯仿抽提法進行DNA抽提，具體方法如下。每個樣本取0. 5g外套膜組織剪碎后，加入 500 u L 組織勻衆(zhòng)緩沖液(10mmol/dm3 Tris-Hcl, PH=8. 0; 50mmoI /dm3 EDTA,PH=8. 0)，混勻后加入終濃度為1%的SDS和200 u g/cm3的蛋白酶K，55°C消化澄清。利用飽和酚抽提I次，然后利用等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1)提取2次，再次利用氯仿異戊醇(24 1)抽提I次，最后加入2倍體積預冷的無水こ醇沉淀，70%こ醇洗滌兩遍后干燥，無菌水溶解DNA。紫外分光光度計測定樣品DNA的0D260、0D280值，確定其濃度和純度，母液置于_20°C保存。(2)合成線粒體細胞色素氧化酶I (COI)引物；線粒體細胞色素氧化酶I (COI)引物的合成，采用固相亞磷酰胺三酯法，由DNA合成儀合成引物堿基序列，通過PAGE法純化弓I物。序列為Sc-COI-F:5，GGTCAACAAATCATAAAG ATATTGG 3，；Sc-C0I-R :5，TAAACTTCAGGGTGACCA AAA AATCA 3’(3)線粒體細胞色素氧化酶I (COI)的PCR擴增利用合成的引物進行細胞色素氧化酶I (COI)的PCR擴增，擴增反應在德國艾本德PCR儀上進行，具體實施如下PCR擴增程序94°C預變性3min，進行35個循環(huán)94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸50s，最后72°C延伸IOmin0PCR 擴增所用反應體系為 25 ii L，含 IOXBuffer 2. 5 u L, Mg2+2. Ommo I/dm3,dNTPO. 2mmol/dm3, TaqDNA 聚合酶 1U，上、下游引物各 0. 2 y mol/dm3，模板 DNA50_100ng。(4 )對PCR產(chǎn)物進行純化；PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠檢測，EB染色，于凝膠成像系統(tǒng)下將PCR產(chǎn)物進行切膠回收，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，具體操作步驟參考純化試劑盒說明書(購自上海生エ生物工程有限公司)。( 5 )對純化的PCR產(chǎn)物進行測序和序列比對采用ABI3730測序儀進行PCR產(chǎn)物雙向測序,測序引物為PCR擴增引物。測序結(jié)果經(jīng)過拼接校對后，利用 Clustal W2 軟件(http://www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/)進行序列比對，獲得不同序列間的保守堿基和變異堿基，通過變異堿基鑒定不同地區(qū)的縊蟶群體。本實施例中鑒別縊蟶兩個群體的線粒體分子標記細胞色素氧化鎂I (COI)序列為圖I所示。由縊蟶江滬群體和浙閩群體共計4個體線粒體COI基因400bp序列的排序結(jié)果可以看出，兩個群體存在21個堿基變異，包括17個轉(zhuǎn)化和4個顛換，分別為第8，35，59，125，131，134，137，155，170，188，275，281，290，331，332 堿基為 A-G 轉(zhuǎn)換，156，347 堿基為 C-T 轉(zhuǎn)換，第140，249，269堿基為C-G顛換，第251堿基為A-T顛換。該結(jié)果穩(wěn)定，可重復性強，鑒別方法簡單，可以作為鑒別縊蟶江滬群體和浙閩的分子標記。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)·人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入本發(fā)明要求保護的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護的范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。
權(quán)利要求
1.ー種利用線粒體分子標記快速鑒定縊蟶群體的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)采集縊蟶個體，提取DNA； (2)合成線粒體細胞色素氧化酶I標記引物； (3)對縊蟶群體的線粒體細胞色素氧化酶I(COI)基因進行PCR擴增； (4)對PCR產(chǎn)物進行純化； (5)對純化的PCR產(chǎn)物進行測序和序列比對。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述標記引物為Sc-COI-F :5’ GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’ ；Sc-COI-R :5’ TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AATCA 3。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴增程序為 (a)94°C預變性3min,進行35個循環(huán) (b)94°C變性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 50s ； (c)最后72°C延伸 IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴增所用反應體系為 25 ii L，含 10 XBuffer 2. 5u L,Mg2+2. Ommol/dm3, dNTPO. 2mmol/dm3，TaqDNA聚合酶 1U，上、下游引物各 0. 2 ii mol/dm3,模板 DNA50_100ng。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用線粒體分子標記快速鑒定縊蟶群體的方法，該方法包括步驟(1)采集縊蟶個體，提取DNA；(2)合成線粒體細胞色素氧化酶I標記引物；(3)對縊蟶群體的線粒體細胞色素氧化酶I(COI)基因進行PCR擴增；(4)對PCR產(chǎn)物進行純化；(5)對純化的PCR產(chǎn)物進行測序和序列比對。該方法該結(jié)果穩(wěn)定，可重復性強，鑒別方法簡單。
文檔編號C12Q1/68GK102776278SQ20121016824
公開日2012年11月14日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者李家樂, 沈和定, 牛東紅, 王劦, 金凱 申請人:上海海洋大學