專利名稱：一種生物法制備中低分子量右旋糖酐的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于精細(xì)化工領(lǐng)域，特別涉及ー種生物法制備中低分子量右旋糖酐的方法及其產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
右旋糖酐(dextran)又名葡聚糖(學(xué)名)，主要是蔗糖經(jīng)某些微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一種胞外多糖。右旋糖酐首先被應(yīng)用于在醫(yī)藥領(lǐng)域，最主要的也是最早的使用是作為血容量擴(kuò)充劑即代血漿。它是目前國際上公認(rèn)的優(yōu)良的代血漿首選 藥物。不同相對(duì)分子量的右旋糖酐具有許多的藥理活性。此外，右旋糖酐在人體內(nèi)可水解成較低分子質(zhì)量的化合物，并會(huì)代謝生成葡萄糖而具有一定的營養(yǎng)作用。目前臨床上常應(yīng)用的有三種規(guī)格右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20。右旋糖酐還常用作藥物載體，被科學(xué)家形象地稱為“生物導(dǎo)弾”。目前已經(jīng)應(yīng)用于許多藥物中作為載體，包括有降血糖藥、抗腫瘤藥、免疫蛋白和DNA等。在食品エ業(yè)上的應(yīng)用，右旋糖酐作為ー種天然的來源豐富的微生物多糖是食品的一種優(yōu)良的配料。主要是作為在食品中的保濕劑、穩(wěn)定劑、増量劑和增稠劑。在石油エ業(yè)上，右旋糖酐被作為油井鉆泥的添加劑。右旋糖酐的合成實(shí)質(zhì)是蔗糖在胞外右旋糖酐蔗糖酶(又稱葡聚糖蔗糖酶)的作用下催化合成的葡萄糖聚合物，由此可以將右旋糖酐的合成看成是由兩步來完成，ー步是酶的產(chǎn)生，ニ步是酶催化合成右旋糖酐。右旋糖酐蔗糖酶是ー種高分子蛋白質(zhì)，其分子量在170kD左右?？梢陨a(chǎn)右旋糖酐的菌種主要分為明串球菌屬(Leuconostoc)和鏈球菌屬(Streptococcus)。據(jù)文獻(xiàn)記載,其中以明串珠菌屬中的腸膜明串珠菌(Leuoconostocmesenteroides,簡寫為L. M.)的產(chǎn)量最高。國內(nèi)右旋糖酐的商業(yè)生產(chǎn)菌株應(yīng)用較多的菌種是L. M. 1226號(hào)菌種。微生物發(fā)酵合成右旋糖酐是目前エ業(yè)上主要采用的ー種方法。微生物發(fā)酵法是將右旋糖酐蔗糖酶的生成和合成右旋糖酐兩大步合到同一個(gè)反應(yīng)器中同時(shí)進(jìn)行。傳統(tǒng)的右旋糖酐生產(chǎn)エ藝是以蔗糖作為底物，以游離的微生物為轉(zhuǎn)化菌，控制一定的發(fā)酵條件，經(jīng)微生物發(fā)酵利用蔗糖分子中的葡萄糖単元，因發(fā)酵過程對(duì)形成的分子量不能調(diào)控，最終發(fā)酵合成分子量巨大的右旋糖酐產(chǎn)物；而分子量巨大的右旋糖酐產(chǎn)物一般很少能直接使用。因此，發(fā)酵合成的分子量巨大的右旋糖酐須再經(jīng)過一系列的后續(xù)加工(一般包括こ醇沉淀、捏洗、酸水解、劃分、純化、干燥等エ序)，最終才得到不同分子量級(jí)別的右旋糖酐成品O右旋糖酐分子量的調(diào)控方法包括有化學(xué)法、物理法和生物法。其中化學(xué)法是傳統(tǒng)所使用的方法，主要是通過鹽酸把大分子量的右旋糖酐降解成小分子量的右旋糖酐，該法由于反應(yīng)條件劇烈，不易控制，反應(yīng)后部分右旋糖酐被降解成了單糖，因而導(dǎo)致收率很低。物理的方法主要是利用超聲波來截?cái)啻蠓肿拥挠倚囚@取低分子量的右旋糖酐；此法耗能較多，不適于大規(guī)模生產(chǎn)采用，且反應(yīng)過程會(huì)產(chǎn)生很多熱量，目前在這方面的研究還處于初步探索階段。由于酶解法具有反應(yīng)條件溫和，耗能少，適于實(shí)現(xiàn)エ業(yè)規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因而目前有關(guān)采用酶來調(diào)控右旋糖酐分子量的研究也比較多，但就在發(fā)酵法合成右旋糖酐基礎(chǔ)上如何實(shí)現(xiàn)定向控制合成右旋糖酐分子量方面的研究報(bào)道很少，因而本發(fā)明采用雙微生物偶合作用，對(duì)生物法降解右旋糖酐分子量進(jìn)行研究，通過生物的方法來定向調(diào)控合成右旋糖酐的分子量，以到達(dá)臨床醫(yī)學(xué)所需的右旋糖酐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服傳統(tǒng)的制備中低分子量右旋糖酐存在的步驟多、成本高的不足，提供一種新的 生物法制備中低分子量右旋糖酐的方法及其產(chǎn)品。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下本發(fā)明的技術(shù)方案之ー為ー種生物法制備中低分子量右旋糖酐的方法，包括以下步驟在含鹿糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides)種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，再加入圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium)種子液或者圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium)的發(fā)酵液上清繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng),從發(fā)酵液中分離中低分子量的右旋糖酐。其中，所述的腸膜明串珠菌種子液是本領(lǐng)域常規(guī)的腸膜明串珠菌種子液，優(yōu)選處于菌體生長指數(shù)期的腸膜明串珠菌種子液。該腸膜明串珠菌種子液中的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域常規(guī)的用于培養(yǎng)腸膜明串珠菌的培養(yǎng)基，優(yōu)選的種子液培養(yǎng)基是蔗糖8%，蛋白胨O. 7%，磷酸氫ニ鈉O. 2%，磷酸ニ氫鉀O. 05%。發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選pH7. 3^7. 6，更優(yōu)選7. 5。其中，所述的圓弧青霉菌種子液也是本領(lǐng)域常規(guī)的圓弧青霉菌種子液，優(yōu)選處于菌體生長指數(shù)期的圓弧青霉菌種子液。該圓弧青霉菌種子液中的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域常規(guī)的用于培養(yǎng)圓弧青霉菌的種子液培養(yǎng)基，優(yōu)選的種子液培養(yǎng)基是CM0015查氏培養(yǎng)基。其中，所述的圓弧青霉菌的發(fā)酵液上清是指圓弧青霉菌的發(fā)酵液固液分離除去固相后所剩下的液相部分。圓弧青霉菌的發(fā)酵液上清中含有多種生物活性成分，包括右旋糖酐酶。右旋糖酐酶可以降解右旋糖酐，使右旋糖酐分子量降低，從而得到中小分子量的右旋糖酐。其中，所述的含蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基是本領(lǐng)域常規(guī)的用于發(fā)酵培養(yǎng)腸膜明串珠菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中含有蔗糖，蔗糖含量優(yōu)選10% — 20%。優(yōu)選的所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含蔗糖10%-20%，蛋白胨O. 5-0. 8%，磷酸氫ニ鈉O. 1-0. 3%，磷酸ニ氫鉀O. 02-0. 07%和酵母浸膏O. 2-0. 8% ;更優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基是蔗糖18%，蛋白胨O. 7%，磷酸氫ニ鈉O. 2%，磷酸ニ氫鉀O. 05%和酵母浸膏O. 5%。所述的百分比為質(zhì)量百分比。其中，發(fā)酵條件是先在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%_15%的腸膜明串珠菌種子液，在20-35°C，發(fā)酵12-48小時(shí)后；再加入發(fā)酵培養(yǎng)基體積8%_13%的圓弧青霉菌種子液，繼續(xù)在20-35°C下發(fā)酵12-96小時(shí)，優(yōu)選48-72小時(shí)。優(yōu)選為在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10%的腸膜明串珠菌種子液，25-30°C發(fā)酵24小時(shí)后加入發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的圓弧青霉菌種子液，在25-30°C繼續(xù)發(fā)酵48小時(shí)；更優(yōu)選為腸膜明串珠菌的發(fā)酵溫度為28°C，發(fā)酵時(shí)間為36小時(shí)；圓弧青霉菌的發(fā)酵溫度為28°C，發(fā)酵時(shí)間為36小時(shí)；優(yōu)選在搖床轉(zhuǎn)速為150r/min下發(fā)酵。其中，所述的圓弧青霉菌的發(fā)酵液上清的加入量優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基的10%_15%，更優(yōu)選12%。繼續(xù)發(fā)酵的條件優(yōu)選為發(fā)酵溫度為28°C，發(fā)酵時(shí)間為48小時(shí)；優(yōu)選在搖床轉(zhuǎn)速為150r/min下發(fā)酵。
其中，本發(fā)明的方法中，所述的腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides,簡寫為L.M·)是屬于腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides)種內(nèi)的任何一種，優(yōu)選的為腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides) CICC-21725,腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides) CICC-20074,腸膜明串珠菌(Leuoconostocmesenteroides)L. Μ. Ν-4,腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides)L. M. NCTC 10817,和腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides) L. Μ· 1226中的一種或多種?？梢允且吧偷木辏部梢允峭ㄟ^采用基因 工程技術(shù)手段改造野生型菌株所獲取的基因工程菌。其中，所述的圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium)是屬于圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium)種內(nèi)的任何一種，優(yōu)選圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium)CICC-4022或者圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium) CICC-4021。可以是野生型的菌株，也可以是通過采用基因工程技術(shù)手段改造野生型菌株所獲取的基因工程菌。本發(fā)明繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液中含有的右旋糖酐的分子量分布情況是均重分子量大于40000的產(chǎn)物部分在8%以下，均重分子量小于20000的產(chǎn)物部分小于5%以下，均重分子量40000的產(chǎn)物部分約占總產(chǎn)物的80%。較好地實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物分子量的調(diào)控。本發(fā)明中，從繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液中分離右旋糖酐的方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)的分離方法。優(yōu)選在發(fā)酵液中加入こ醇沉淀，進(jìn)行兩級(jí)沉淀分離。包括在分離除去大部分菌體的發(fā)酵液中加入こ醇使發(fā)酵液中こ醇的體積濃度在43-48%(V/V)，進(jìn)行ー級(jí)沉淀除雜，以沉淀的方式除去發(fā)酵液中的大分子量右旋糖酐和少量的菌體；在沉淀分離后，再在清液中加入こ醇使發(fā)酵液中的こ醇濃度為48%-52% (V/V)，進(jìn)行ニ級(jí)沉淀，獲得的沉淀即為中低分子量的右旋糖酐粗品。本發(fā)明省略了傳統(tǒng)右旋糖酐生產(chǎn)過程中的酸解操作，減少了こ醇的使用量和生產(chǎn)過程中こ醇的消耗量。本發(fā)明的技術(shù)方案之ニ為由所述方法制備的右旋糖酐。本發(fā)明還提供所述的右旋糖酐在制備藥物中的應(yīng)用以及在食品、化工中的應(yīng)用。右旋糖酐可以用于制備代血漿，也可以作為藥物載體制備各種藥物。在食品エ業(yè)上，右旋糖酐可作為天然來源的微生物多糖作為優(yōu)良的配料，如保濕劑、穩(wěn)定劑、増量劑和增稠劑。在石油エ業(yè)上，右旋糖酐作為油井鉆泥的添加剤。右旋糖酐還作為化妝品、BlTl殺蟲劑的增效劑、土壌改良劑等。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明采用雙微生物耦合發(fā)酵的方式，提供生物法合成右旋糖酐分子量調(diào)控的方法，通過生物的方法來定向調(diào)控合成低分子量的右旋糖酐，使大分子右旋糖酐降解趨向于臨床所需的中低分子量的右旋糖酐。同時(shí)，本發(fā)明可直接進(jìn)行こ醇沉淀，省去傳統(tǒng)生產(chǎn)エ藝中的酸解操作和冗長費(fèi)時(shí)又昂貴的逐級(jí)分劃沉淀，提高了右旋糖酐的收率，減少了こ醇的使用量和生產(chǎn)過程中こ醇的消耗量。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖I圓弧青霉菌CCIC-4022的生長曲線。圖2腸膜明串珠菌CICC-21725的生長曲線。圖3右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖4圓弧青霉菌與腸膜明串珠菌CICC-21725耦合發(fā)酵的產(chǎn)物分子量變化。圖5產(chǎn)品分子量的液相色譜分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期而廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)在生物法合成右旋糖酐的生產(chǎn)中，通過產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶的微生物在含蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵所得的發(fā)酵液中加入產(chǎn)右旋糖酐酶的微生物或者該產(chǎn)右旋糖酐酶的微生物 的發(fā)酵液上清，使兩種微生物耦合共同發(fā)酵或者使產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶的微生物在右旋糖酐酶存在的情況下繼續(xù)發(fā)酵，可以對(duì)發(fā)酵過程中生成的右旋糖酐的分子量進(jìn)行調(diào)控，從共同發(fā)酵液中分離得到符合使用要求的分子量降低的右旋糖酐。進(jìn)而本發(fā)明人通過對(duì)兩微生物種類的篩選和優(yōu)選，以及生產(chǎn)エ藝中各個(gè)生產(chǎn)エ藝參數(shù)的優(yōu)化，終于得到了一種可以調(diào)控發(fā)酵過程中右旋糖酐分子量的方法，直接獲得符合醫(yī)學(xué)和其他エ業(yè)領(lǐng)域使用要求分子量的右旋糖酐，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明人對(duì)兩微生物種類以及生產(chǎn)エ藝中的參數(shù)，比如兩種微生物的種子培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵初始pH值，發(fā)酵溫度和時(shí)間，兩種微生物合并發(fā)酵的時(shí)間，合并時(shí)兩者的用量比例，發(fā)酵條件等進(jìn)行了大量的試驗(yàn)，包括單因素試驗(yàn)，兩因素交互試驗(yàn)以及多因素試驗(yàn)，采用“正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)”數(shù)學(xué)方法來確定配方和生產(chǎn)エ藝，通過方差分析，確定影響較大的因素。從而得到了雙生物耦合發(fā)酵調(diào)控產(chǎn)物右旋糖酐分子量的方法。本發(fā)明對(duì)這些因素的優(yōu)選方式如前文中技術(shù)方案部分所述。在所述的技術(shù)方案下，得到的右旋糖酐分子量可以達(dá)到臨床所需的中低分子量要求。下面用實(shí)施例來進(jìn)ー步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明中所述的常溫是指10-35°C，一般為25°C。實(shí)施例I菌種腸膜明串珠菌(LeuconostocMesenteroides, L.M· ) CICC-2I725 和圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium) CICC-4022購于中國エ業(yè)微生物菌種保藏中心(ChinaCenter of Industrial Culture Collection, CICC)。I、圓弧青霉菌種子液的制備(I)圓弧青霉囷種子制備圓弧青霉菌種子培養(yǎng)和保存基制備種子培養(yǎng)和保存基為CM0015查氏瓊脂培養(yǎng)基蔗糖3%，亞硝酸鈉0. 3%，七水硫酸鎂0. 05%,氯化鉀0. 05%,四水硫酸亞鐵0. 001%,磷酸氫ニ鉀 0. 1%，瓊脂 I. 5%, ρΗ6· 0 6· 5。按上述培養(yǎng)和保存基配方稱取各個(gè)培養(yǎng)基組分，放入干凈的燒杯中，再加入一定量的蒸餾水，攪拌加熱完全溶解后，用精密PH試紙測定其pH，并用酸堿調(diào)節(jié)溶液的pH值至
6.(Γ6. 5 ;隨后將其放入高壓滅菌鍋中進(jìn)行滅菌；滅菌條件為121°C，0. lMPa，20min。取出趁熱將其倒入圓形培養(yǎng)皿中，待其溫度下降至常溫；并放置24h，觀察培養(yǎng)基有無雜菌污染，如果無，便可以使用。種子制備將購置的圓弧青霉菌按常規(guī)轉(zhuǎn)移到有種子培養(yǎng)和保存基的培養(yǎng)皿中，在28°C靜置培養(yǎng)3天。
(2)圓弧青霉菌種子擴(kuò)大液的制備種子擴(kuò)大培養(yǎng)基的制備按CM0015查氏液體培養(yǎng)基組成，去掉瓊脂制備IL的液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)其pH至6. 0^6. 5之間，定容后分裝成50mL姆瓶,用棉花塞塞住,包扎好；放入高壓鍋中滅菌。種子擴(kuò)大液制備在無菌環(huán)境下，分別從圓弧青霉菌種培養(yǎng)皿中挑取幾環(huán)菌體接入已滅菌好的50mL CM0015查氏種子擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在28°C，150r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，測定不同培養(yǎng)時(shí)間下種子擴(kuò)大培養(yǎng)基中菌體的重量，以確定種子擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)間，獲得可用于發(fā)酵的圓弧青霉菌種子液。 圓弧青霉菌生長曲線的繪制菌體收集發(fā)酵培養(yǎng)中，每隔一定的時(shí)間，取其中的ー瓶發(fā)酵培養(yǎng)液，采用SOOOr/min，離心10分鐘，去掉上清收集菌體。菌體干重的測定將帶有菌體的離心管一起放入烘箱中，115°C，干燥至恒重，取出置于玻璃干燥器中進(jìn)行冷卻干燥，稱量三次取平均值，并計(jì)算菌體干重(菌體干重=平均總重-空管重)。圓弧青霉菌生長曲線見圖I。前f 2天是菌體生長繁殖的遲緩期，此時(shí)由于菌種剛加入到新的培養(yǎng)環(huán)境中，需要一段時(shí)間來調(diào)整適應(yīng)新環(huán)境，2飛天時(shí)為菌種生長繁殖的對(duì)數(shù)生長期，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間到達(dá)第5天左右，圓弧青霉菌CCIC-4022的生長處于穩(wěn)定期。而到了第7天之后開始進(jìn)入了衰亡期，此時(shí)在實(shí)驗(yàn)中觀察到發(fā)酵液已經(jīng)發(fā)粘、變色，菌體呈現(xiàn)泛紅色。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將種子擴(kuò)大培養(yǎng)2天后的圓弧青霉菌作為下ー步發(fā)酵用的圓弧青霉菌種子液，簡稱A液。2、發(fā)酵制備右旋糖酐(I)腸膜明串珠菌種子液制備腸膜明串珠菌L. M. CICC-21725種子擴(kuò)大液體培養(yǎng)基為蔗糖8%，蛋白胨O. 2%，磷酸氫ニ鈉O. 14%，磷酸ニ氫鉀O. 03%。pH 7. 0 7· 2。種子培養(yǎng)液制備按上述液體培養(yǎng)基配方(蔗糖8%，蛋白胨O. 2%，磷酸氫ニ鈉O. 14%，磷酸ニ氫鉀O. 03%)稱取各個(gè)培養(yǎng)基組分，放入干凈的燒杯中，再加入一定量的蒸餾水，攪拌加熱完全溶解后，待其溫度下降至常溫；再用已校準(zhǔn)好的PH計(jì)測定溶液的pH值并用酸堿調(diào)節(jié)溶液的PH值至7. (Γ7. 2，之后補(bǔ)加蒸餾水定容。然后將配制好的培養(yǎng)液分裝到的250mL錐形瓶中，裝液量為50mL，之后用棉花塞塞住瓶ロ，并用牛皮紙包扎嚴(yán)實(shí)。隨后將其放入高壓滅菌鍋中進(jìn)行滅菌；滅菌條件為121°C，0. lMPa，20min。滅菌之后，取出讓其自然冷卻至常溫，并放置24h，觀察培養(yǎng)液中有無雜菌污染，如果無，便可以使用。在無菌的環(huán)境下操作，從培養(yǎng)皿中挑選長勢好的腸膜明串珠菌落，挑取幾環(huán)接入種子擴(kuò)大培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 溫度25°C，轉(zhuǎn)速150r/min培養(yǎng)，測定不同培養(yǎng)時(shí)間下種子擴(kuò)大培養(yǎng)基中菌體的重量，以確定種子擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)間，獲得可用于發(fā)酵的腸膜明串珠菌しM. CICC-21725種子液。腸膜明串珠菌生長曲線見圖2，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將種子擴(kuò)大培養(yǎng)I天后的腸膜明串珠菌L. M. CICC-21725作為下ー步發(fā)酵用的腸膜明串珠菌L. M. CICC-21725種子液。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基制備
用腸膜明串珠菌L. M. CICC-21725發(fā)酵合成右旋糖酐的發(fā)酵培養(yǎng)基為蔗糖18%，蛋白胨O. 7%，磷酸氫ニ鈉O. 2%，磷酸ニ氫鉀O. 05%，酵母浸膏O. 5%。pH 7. 2-7. 5。按上述配方制備IL的發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)其pH至7. 2-7. 5之間，定容后分裝成每瓶250mL，用棉花塞塞住，包扎好；放入高壓鍋中滅菌。(3)合成右旋糖酐及其產(chǎn)率測定將腸膜明串珠菌發(fā)酵培養(yǎng)基分裝成兩組，分別接入(I)中獲得的腸膜明串珠菌種子液，接種量為10% (v/v)，25°C發(fā)酵48小時(shí)，即得 含產(chǎn)物的發(fā)酵液。采用稱重取樣法，稱取一定量經(jīng)腸膜明串珠菌發(fā)酵獲得的發(fā)酵液，并加入一定量的蒸餾水進(jìn)行稀釋，然后高速離心(10000r/min，IOmin)去除菌體；取上清液，用60%こ醇進(jìn)行沉淀，所得沉淀產(chǎn)物再用無水こ醇進(jìn)行脫洗兩次，離心收集沉淀；將沉淀物置于真空度O. 05MPa以上、50°C左右的條件下真空干燥至恒重，再轉(zhuǎn)移至干燥器中進(jìn)行冷卻干燥，三次稱重取平均值，并計(jì)算右旋糖酐產(chǎn)率(右旋糖酐產(chǎn)率=粗酐產(chǎn)量/蔗糖用量 X0. 474X100%) O結(jié)果，腸膜明串珠菌L. M. CICC21725發(fā)酵合成右旋糖酐的產(chǎn)率達(dá)98%。(4)右旋糖酐分子量的測定相對(duì)分子量分布檢測產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量利用凝膠滲透色譜法(gel permeation chromatography,GPC)檢測。用6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量右旋糖酐作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，重均相對(duì)分子質(zhì)量從5000 2000kD。在該色譜條件下測定樣品的保留時(shí)間，來檢測右旋糖酐的分子量分布。色譜條件流動(dòng)相0. 7%NaS04+0 . 02%NaN3的水溶液，流速I. 0min/mL,檢測池溫度40°C，柱溫 35°C。配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液取一定量的相對(duì)分子量(Mw)分別為5kD、10kD、20kD、40kD、70kD、2000kD的葡聚糖(Dextran)標(biāo)準(zhǔn)品，加入流動(dòng)相配制成約2%標(biāo)樣溶液，用0. 45 μ m膜過濾，進(jìn)樣檢測，記錄不同標(biāo)樣的保留時(shí)間，井根據(jù)保留時(shí)間和對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在所測得的高效液相凝膠色譜圖中右旋糖酐樣品的峰分布較窄且峰形較尖，出峰效果良好，可用來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來檢驗(yàn)及計(jì)算發(fā)酵液中的右旋糖酐分子量大小及分布情況。以tR為橫坐標(biāo)，右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖3所示)，其線性回歸方程為IgMw=-O. 5885t+9. 5305,其中R2=O. 9974 ;Mw代表右旋糖酐的相對(duì)分子量，tK代表相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間。在所選定的測定范圍內(nèi)，保留時(shí)間與右旋糖酐的相對(duì)分子量具有良好的線性關(guān)系，因而可以通過在該色譜條件下測定樣品的保留時(shí)間，來檢測反映樣品中右旋糖酐的分子量及分布。在(3)中獲得的右旋糖酐產(chǎn)物，經(jīng)分子量測定，其分子量全部大于2000000D。3、雙菌體耦合發(fā)酵制備中低分子量右旋糖酐(I)雙菌發(fā)酵分別向兩組發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10% (v/v)經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的腸膜明串珠菌L. M. CICC21725種子液，25°C發(fā)酵24小時(shí)后，再加入發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的圓弧青霉菌擴(kuò)大種子液(A液)，繼續(xù)在25°C下發(fā)酵72小吋。發(fā)酵過程中右旋糖酐分子量的檢測在加入圓弧青霉菌后，在發(fā)酵條件下，分別取12h、24h、36h、48h、60h、72h的發(fā)酵液進(jìn)行右旋糖酐分子量檢測。檢測方法取2mL發(fā)酵液入離心管中進(jìn)行離心除菌體，取上液清ImL加入4mL無水こ醇，混勻靜置過夜后離心，去上清液，取沉淀，真空干燥除去水分和こ醇；再向各個(gè)離心管中加入5mL流動(dòng)相，振蕩充分溶解；用O. 45 μ m水系膜過濾頭過濾，取濾液，在獲得的色譜條件下檢測產(chǎn)物相對(duì)分子量。其中12h和24h的溶解液由于還比較黏，先稀釋2倍后離心除菌體，再按檢測方法檢測產(chǎn)物的分子量。結(jié)果見圖4。
從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可獲得雙菌耦合發(fā)酵的時(shí)間為72小吋。(2)雙菌發(fā)酵右旋糖酐產(chǎn)率測定取發(fā)酵72小時(shí)的發(fā)酵液，并加入一定量的蒸餾水進(jìn)行稀釋，然后高速離心(10000r/min, I Omin)去除菌體；取上清液，加入こ醇使其中こ醇含量為60% (V/V),進(jìn)行沉淀，所得沉淀產(chǎn)物再用無水こ醇進(jìn)行脫洗兩次，離心收集沉淀；將沉淀物置于真空度O. 05MPa以上、50°C左右的條件下真空干燥至恒重，再轉(zhuǎn)移至干燥器中進(jìn)行冷卻干燥，三次稱重取平均值，并計(jì)算右旋糖酐產(chǎn)率(右旋糖酐產(chǎn)率=粗酐產(chǎn)量/蔗糖用量XO. 474X100%)。結(jié)果，雙菌耦合發(fā)酵合成右旋糖酐的產(chǎn)率達(dá)95%。4、中低分子量右旋糖酐的分離在所選擇的發(fā)酵條件下經(jīng)雙菌耦合發(fā)酵72小時(shí)獲得的發(fā)酵液用濾紙進(jìn)行過濾，去除大部分菌體。在濾液中加入こ醇，控制溶液中的こ醇含量為43%，進(jìn)行ー級(jí)沉淀，將其中的大分子量右旋糖酐和少量的菌體去除。取上層清液，加入こ醇使其中こ醇含量達(dá)到51%，進(jìn)行第二級(jí)沉淀，靜置12小時(shí)后，先傾倒出上層清液，在沉淀物中加入等體積的95%こ醇，用濾紙過濾，濾渣再用少量95%こ醇洗滌一次。取出濾渣在50°C左右的條件下真空干燥12小時(shí)獲得產(chǎn)品。對(duì)獲得的產(chǎn)品進(jìn)行分子量檢測，產(chǎn)品的分子量在40000左右，結(jié)果見圖5?？梢娋胤肿恿看笥?0000的產(chǎn)物部分在8%以下，均重分子量小于20000的產(chǎn)物部分小于5%以下，均重分子量40000的產(chǎn)物部分約占總產(chǎn)物的80%。較好地實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物分子量的調(diào)控。結(jié)果，雙菌耦合發(fā)酵獲得的分子量為40000左右的右旋糖酐產(chǎn)率為92%。分子量分布D 值為 1.015。由于在發(fā)酵液中右旋糖酐的分子量已符合使用的要求，不需要進(jìn)行酸解和對(duì)酸解后的右旋糖酐進(jìn)行多級(jí)こ醇劃分，將可以大大的減少こ醇的用量，減少能耗，提高收率，降低生產(chǎn)成本。實(shí)施例2菌種腸膜明串珠菌(LeuconostocMesenteroides, L. Μ· ) CICC-2I725 和圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium) CICC-4022購于中國エ業(yè)微生物菌種保藏中心(ChinaCenter of Industrial Culture Collection, CICC)。I、圓弧青霉菌酶液的制備按實(shí)施例I的擴(kuò)大培養(yǎng)條件，將擴(kuò)大培養(yǎng)3天后的圓弧青霉菌種子液在8000r/min離心10分鐘，取上清液得圓弧青霉菌酶液，簡稱為B液。2、發(fā)酵制備右旋糖酐(I)腸膜明串珠菌種子液制備與實(shí)施例I相同。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基制備
用腸膜明串珠菌L. M. CICC-21725發(fā)酵合成右旋糖酐的發(fā)酵培養(yǎng)基為蔗糖13%，蛋白胨O. 7%，磷酸氫ニ鈉O. 2%，磷酸ニ氫鉀O. 05%，酵母浸膏O. 5%。pH 7. 2-7. 5。按上述配方制備IL的發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)其pH至7. 2-7. 5之間，定容后分裝成每瓶250mL，用棉花塞塞住，包扎好；放入高壓鍋中滅菌。(3)合成右旋糖酐
將腸膜明串珠菌發(fā)酵培養(yǎng)基分裝成兩組，分別接入(I)中獲得的腸膜明串珠菌種子液，接種量為10%(v/v)，28°C發(fā)酵48小時(shí)后加入發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的圓弧青霉菌酶液(B液)，繼續(xù)發(fā)酵48小吋。取加入圓弧青霉菌酶液發(fā)酵48小時(shí)的發(fā)酵液，用濾紙進(jìn)行過濾，去除大部分菌體。在濾液中加入こ醇，控制溶液中的こ醇含量為46%，進(jìn)行ー級(jí)沉淀，將其中的大分子量右旋糖酐和少量的菌體去除。取上層清液，加入こ醇使其中こ醇含量達(dá)到53%，進(jìn)行第二級(jí)沉淀，靜置12小時(shí)后，先傾倒出上層清液，在沉淀物中加入等體積的95%こ醇，用濾紙過濾，濾渣再用少量95%こ醇洗滌一次。取出濾渣在50°C左右的條件下真空干燥12小時(shí)獲得產(chǎn)品。對(duì)獲得的產(chǎn)品進(jìn)行分子量檢測，分子量為40000左右的右旋糖酐的產(chǎn)率為92%，分子量分布D值為1.007。由于在發(fā)酵液中右旋糖酐的分子量已符合使用的要求，不需要進(jìn)行酸解和對(duì)酸解后的右旋糖酐進(jìn)行多級(jí)こ醇劃分，將可以大大的減少こ醇的用量，減少能耗，提高收率，降低生產(chǎn)成本。實(shí)施例3菌種腸膜明串珠菌(LeuconostocMesenteroides, L. Μ· ) CICC-20074 和圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium) CICC-4021購于中國エ業(yè)微生物菌種保藏中心(ChinaCenter of Industrial Culture Collection, CICC)。過程同實(shí)施例1，結(jié)果雙菌耦合發(fā)酵獲得的右旋糖酐的分子量在70000左右，分子量分布D值為I. 031，產(chǎn)率為88%。實(shí)施例4菌種腸膜明串珠菌(LeuconostocMesenteroides, L. Μ· ) CICC-20074 和圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium) CICC-4022購于中國エ業(yè)微生物菌種保藏中心(ChinaCenter of Industrial Culture Collection, CICC)。過程同實(shí)施例1，結(jié)果雙菌耦合發(fā)酵獲得的右旋糖酐的分子量在40000左右，分子量分布D值為I. 032，產(chǎn)率為89%。實(shí)施例5菌種腸膜明串珠菌(LeuconostocMesenteroides, L. Μ· ) CICC-21725 和圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium) CICC-4021購于中國エ業(yè)微生物菌種保藏中心(ChinaCenter of Industrial Culture Collection, CICC)。過程同實(shí)施例2，但加入的圓弧青霉菌酶液(B液)為15%，發(fā)酵溫度為32°C，發(fā)酵時(shí)間為36小吋，結(jié)果雙菌耦合發(fā)酵獲得的右旋糖酐的分子量在20000左右，分子量分布D值為I. 011，產(chǎn)率為89%ο在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每ー篇文獻(xiàn)被単獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同 樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.ー種生物法制備中低分子量右旋糖酐的方法，其特征在于，包括以下步驟在含蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides)種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，再加入圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium)種子液或者圓弧青霉菌(Penicilliumcyclopium)的發(fā)酵液上清繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng),從發(fā)酵液中分離右旋糖酐，即得。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的圓弧青霉菌種子液在腸膜明串珠菌在20-35°C發(fā)酵12-48小時(shí)加入，然后繼續(xù)發(fā)酵。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含蔗糖10%-20%，蛋白胨O.5-0. 8%，磷酸氫ニ鈉O. 1-0. 3%，磷酸ニ氫鉀O. 02-0. 07%和酵母浸膏O. 2-0. 8%，所述的百分比為質(zhì)量百分比。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的腸膜明串珠菌種子液和圓弧青霉菌種子液的加入量分別是發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%-15%和8%-13%，所述的圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium)的發(fā)酵液上清的加入量是發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%_15%。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的繼續(xù)發(fā)酵中，發(fā)酵條件是20-35°C，發(fā)酵時(shí)間是12-96小時(shí)。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的腸膜明串珠菌(Leuoconostocmesenteroides)選自腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides) CICC-20074,腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides) CICC-21725,腸膜明串珠菌(Leuoconostocmesenteroides)L. Μ. Ν-4,腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides)L. M. NCTC10817和腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides) L. Μ. 1226中的一種或多種；所述的圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium)選自圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium) CICC-4022 和圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium) CICC-4021中的一種或兩種。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的腸膜明串珠菌(Leuoconostocmesenteroides)或圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium)是野生型的菌株,或者是通過采用基因工程技術(shù)手段改造野生型菌株所獲取的基因工程菌。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，從所述的繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液中分離右旋糖酐的方法包括在分離除去大部分菌體的發(fā)酵液中加入こ醇使發(fā)酵液中こ醇的體積濃度在43-48% (V/V)，進(jìn)行ー級(jí)沉淀除雜；在沉淀分離后，再在清液中加入こ醇使發(fā)酵液中的こ醇濃度為48%-52% (V/V)，進(jìn)行ニ級(jí)沉淀，獲得的沉淀即為中低分子量的右旋糖酐粗品。
9.由權(quán)利要求1-8所述的方法制備的右旋糖酐。
10.如權(quán)利要求9所述的右旋糖酐在制備藥物中的應(yīng)用以及在食品、化工中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物法制備中低分子量右旋糖酐的方法，包括以下步驟在含蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroides)種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，再加入圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium)種子液或者圓弧青霉菌(Penicillium cyclopium)的發(fā)酵液上清繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵液中分離右旋糖酐，即得。本發(fā)明還公開了所制備的右旋糖酐及其應(yīng)用。本發(fā)明采用雙微生物偶聯(lián)發(fā)酵的方式，提供生物法直接獲得中低分子量右旋糖酐的方法。通過生物的方法來定向調(diào)控合成中低分子量的右旋糖酐，使生成的大分子右旋糖酐降解趨向于臨床所需的中低分子量的右旋糖酐。同時(shí)，本發(fā)明可直接進(jìn)行乙醇沉淀，省去了冗長費(fèi)時(shí)又昂貴的逐級(jí)分劃沉淀，提高了右旋糖酐的收率，減少了乙醇的使用量和耗量。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102690857SQ20121016834
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日
發(fā)明者廖安平, 李媚, 梁明征, 藍(lán)麗紅, 藍(lán)平, 謝濤 申請人:廣西民族大學(xué)