專利名稱：一種水解錦綸的聚酰胺酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種水解水不溶性底物錦綸的聚酰胺酶及其編碼基因，屬于酶基因工程和酶工程領域。
背景技術(shù)：
在紡織工業(yè)中聚酰胺(polyamida, PA)俗稱尼龍或錦纟侖,是紡織三大合成纖維之一，其耐磨性高、彈性好、拉伸恢復能力強、摩擦系數(shù)低的優(yōu)點，使其在紡織工業(yè)中具有重要應用。然而作為高分子聚合物，PA的手感和潤濕性較差，需要對其進行改性，以達到優(yōu)良的吸水性和染色效果。目前工業(yè)上均使用強堿或強酸工藝處理PA，導致纖維結(jié)構(gòu)損傷嚴重，強度和質(zhì)量降低，織物染色效果差，且生產(chǎn)過程產(chǎn)生大量廢水，對環(huán)境造成極大污染。生物酶 處理相對于傳統(tǒng)酸堿工藝具有作用條件溫和、特異性強、工藝可控制性強，處理過程污染小等優(yōu)點，因此開發(fā)適用于PA改性的高效酶制劑以實現(xiàn)PA的生物酶改性，不僅能夠有效提高PA的質(zhì)量和加工性能，還順應了綠色生產(chǎn)加工和可持續(xù)發(fā)展的趨勢。聚酰胺酶能夠水解PA分子鏈中的酰胺鍵，生成相應的氨基和羧基，從而增加PA的親水性。聚酰胺酶與其它水解錦綸的生物酶相比特異性強，水解效率高，因此酶處理工藝時間短，具有潛在的工業(yè)應用價值。目前國外對能夠水解PA的聚酰胺酶研究尚處于初級階段，只是報道過來源于Nocardia farcinica的聚酰胺酶能夠水解PA,但野生菌產(chǎn)酶量低,且該聚酰胺酶的基因序列和蛋白序列尚未確定。國內(nèi)尚未有關(guān)水解PA聚酸胺酶的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的一個技術(shù)問題是提供一種水解PA的聚酰胺酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I 所示。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種編碼聚酰胺酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供一種生產(chǎn)聚酰胺酶的方法，具體包括如下步驟首先采用化學全合成或PCR方法獲得SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列；克隆獲得的核苷酸序列到pET20b(+)表達載體；然后將獲得的表達載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21獲得表達聚酰胺酶的基因工程菌；最后通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，將獲得的基因工程菌在LB培養(yǎng)基中37°C液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)3h后用4mg/L IPTG誘導，降溫至25°C培養(yǎng)，20h時離心收集菌體，破壁后收集上清粗酶液。本發(fā)明的另一個目的是提供一種編碼本發(fā)明的聚酰胺酶的DNA分子，所述的DNA分子具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。本發(fā)明的再一個目的是提供包含本發(fā)明基因的表達載體。本發(fā)明的又一個目的是提供包含本發(fā)明表達載體的宿主細胞。本發(fā)明提供的聚酰胺酶最適溫度50°C，最適pH8. O.在40°C、pH8. O下處理錦綸，吸水實驗和染色實驗結(jié)果顯示該重組聚酰胺酶能夠提高其吸水性和上染率，具有很好的應用前景。


圖I重組菌發(fā)酵產(chǎn)聚酰胺酶SDS-PAGE圖I :胞內(nèi)上清，2 :空載對照，M protein marker圖2重組聚酰胺酶純化SDS-PAGE電泳分析I :純化后蛋白；M protein marker.圖3錦綸經(jīng)不同處理后的上染率
具體實施方式
實施例I本實驗說明聚酰胺酶分離克隆程序。Nocardia farcinica CGMCC 4. 1166菌株在液體培養(yǎng)基(葡萄糖 lg/L,蛋白腺 IOg/L,氯化鈉5g/L,氯化|丐O. lg/L)中培養(yǎng)3天,IOOOOrpm離心收集菌體，無菌水洗漆，使用基因組提取試劑盒提取總DNA，提取過程中需加入O. 5%的SDS，提高總DNA提取效率。根據(jù)NCBI 中 N. farcinica IFM10152 中 nfa28230 設計引物如下，nfa28230 上游引物(amid-f) :5，-CCCATATGGATGTCGCCGAATACGCCGC-3，下游引物(amid-r) :3，-CAAGCTTAGAAGACGGCCTGCCCGGTGTGGG-5,，下劃線部分為限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind III酶切位點。利用上述引物，以Nocardia farcinica總DNA為模版,PCR擴增聚酰胺酶基因。反應條件為94°C預變性4min后進入一下循環(huán)98°C變性10s，55°C退火5s，72°C延伸90s，30個循環(huán)；72°C延伸IOmin0擴增得到1440bp的PCR片段，割膠回收?；厥掌瑪嗯cpMD18_Tsimple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板。37°C培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，8h后提取質(zhì)粒。將此質(zhì)粒進行序列測定，結(jié)果表明此基因全長1440個核苷酸，編碼479個氨基酸，和蛋白nfa-28320的基因有9個核苷酸的差異，編碼氨基酸有三個不同。此基因是第一個報道的能夠水解錦綸的聚酰胺酶基因。實施例2本實驗說明聚酰胺酶基因在大腸桿菌表達載體上的構(gòu)建程序。用于構(gòu)建大腸桿菌表達載體的質(zhì)粒是pET20b (+)。將pET20b (+)質(zhì)粒和聚酰胺酶基因進行Nde I和Hind III雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，再用T4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細胞，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子100mg/L氨芐青霉素LB進行液體培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，得到富集的AMI-pET20b (+)質(zhì)粒。實施例3本實驗說明大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)化和篩選重組菌的程序。將質(zhì)粒AMI_pET20b (+)熱擊轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)宿主菌，在氨芐青霉素(100mg/L) -LB平板上經(jīng)37 °C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子(重組菌AMI_pET20b (+) /E. coliBL21(DE3))在LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl lg/L)中37°C液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HP04 12. 54g/L，KH2P042. 31g/L) 37°C培養(yǎng)3h后用4mg/L IPTG (異丙基硫代β D半乳糖苷)誘導，降溫至25°C培養(yǎng)，20h時離心收集菌體，破壁后上清酶活為0. 6u/mL。電泳圖見圖1，表觀分子量31kDa。實施例4本實驗說明重組聚酰胺酶的純化程序。
將胞內(nèi)上清液經(jīng)70%硫酸銨沉淀過夜,40C, 12000rpm離心20min,棄上清,沉淀用適量磷酸鈉緩沖液(50mM，pH7. O)溶解，透析過夜得到濃縮酶液。將透析過夜蛋白液于4°C，12000rpm離心IOmin后，經(jīng)O. 22微米膜過濾后制成陰離子交換柱上樣樣品。DEAE陰離子交換柱先用水平衡，再用緩沖液A (pH7. O. 50mM磷酸鈉)平衡，待基線穩(wěn)定后，將上樣樣品完全注入陰離子柱，用緩沖液A洗去未結(jié)合的蛋白后，再用緩沖液A和緩沖液B (pH7. 0，50mM磷酸鈉+IM Nacl)進行梯度洗脫，收集目的蛋白樣品，測定酶活及蛋白含量。將經(jīng)過初步純化收集的目的蛋白樣品再經(jīng)monoQ陰離子柱進一步純化，收集目的蛋白樣品，測定酶活及蛋白含量。HiTrap phenl FF疏水柱用水平衡后，用緩沖液A (pH7. 50mM磷酸鈉+IM Na2S04)平衡，將經(jīng)monoQ陰離子柱分離到的目的蛋白樣品注入疏水層析柱，用洗去未結(jié)合蛋白，再用緩沖液A和緩沖液B (pH7. 50mM磷酸鈉)進行梯度洗脫，得到較純的聚酰胺酶，測定酶活及蛋白含量。實施例5本實驗說明重組聚酰胺酶的錦綸改性程序。I、錦綸的預處理
稱取O. 5gPA置于IOOmL去離子水中，60°C、200rpm回轉(zhuǎn)式搖床洗滌30min，去除PA表面的一些雜質(zhì)，以免影響錦綸的改性處理。2、錦綸纖維的酶處理、堿處理酶處理將預處理過的PA置于5mL pH 7. O的磷酸鈉緩沖液的中，加入5mL重組聚酰胺酶酶液(酶活為2. 5U)，40°C、200rpm回轉(zhuǎn)式搖床酶處理lh。堿處理將預處理過的PA置于IOmL pH 7. O的磷酸鈉緩沖液的三角瓶中，加入ImL lmol/L氫氧化鈉,40°C、200rpm回轉(zhuǎn)式搖床處理lh。對照將預處理過的PA纖維置于IOmLpH 7. O的磷酸鈉緩沖液中，440°C、200rpm回轉(zhuǎn)式搖床處理lh。3、錦綸纖維的后處理將處理的錦綸置于IOOmL碳酸鈉(10mM，pH9. 5)中，50°C、200rpm洗滌30min后，再用去離子水充分洗滌，以去除吸附在PA表面的酶蛋白等，后在60°C烘干。4、錦綸纖維酶改性效果的測定吸水高度實驗根據(jù)毛細管效應,將處理后的PA裁成2cm*20cm條狀,底部(Icm)浸入水中，測定處理后的錦綸在30min內(nèi)水的上升的高度(cm)，用來表示PA纖維的潤濕性[10]。水面上升高度越高，說明PA纖維的潤濕性越強。染色實驗配制20g/L的弱酸性黃GN染料，將錦綸75°C入染，染色lh，自然冷卻，測定纖維對染料的上染率。以PA對染料的上染率表征酶對纖維的改性效果。上染率越高，說明PA的潤濕性越好，改性效果越明顯。PA分別經(jīng)堿、重組聚酰胺酶和磷酸緩沖液處理后，測定PA纖維毛細管上升高度和上率，結(jié)果如表I和圖3所示，酶處理和堿處理效果基本相當。表I. PA經(jīng)不同處理后的吸水高度結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種水解錦綸的聚酰胺酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.編碼權(quán)利要求I所述聚酰胺酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQID NO. 2所
3.表達權(quán)利要求I所述聚酰胺酶的基因工程菌或細胞系。
4.含有權(quán)利要求2所述聚酰胺酶基因的表達載體或克隆載體。
5.生產(chǎn)權(quán)利要求I所述聚酰胺酶的方法，其特征在于包括如下步驟 . 1)采用化學全合成或PCR方法獲得SEQID NO. 2所示核苷酸序列； .2)克隆SEQID NO. 2所示核苷酸序列到pET20b (+)表達載體； . 3)將步驟2)獲得的表達載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)獲得表達聚酰胺酶的基因工程菌； . 4)將步驟3)獲得的基因工程菌在LB培養(yǎng)基中37°C液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)3h后用4mg/L IPTG誘導，降溫至25°C培養(yǎng)，20h時離心收集菌體，破壁后收集上清粗酶液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種聚酰胺酶及其編碼基因和表達系統(tǒng)。聚酰胺酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。編碼其的基因核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。該聚酰胺酶能夠有效水解錦綸，可用于紡織改性行業(yè)。本發(fā)明提供的聚酰胺酶最適溫度50℃，最適pH8.0.在40℃、pH8.0下處理錦綸，吸水實驗和染色實驗結(jié)果顯示該重組聚酰胺酶能夠提高其吸水性和上染率，具有很好的應用前景。
文檔編號C12N1/19GK102757949SQ201210168510
公開日2012年10月31日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者吳敬, 郭迎春, 陳堅, 陳晟 申請人:江南大學