專利名稱：一種促進(jìn)芽孢桿菌生長的培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)芽孢桿菌生長的培養(yǎng)基及其應(yīng)用，特別涉及一種促進(jìn)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)生長的添加礦質(zhì)養(yǎng)料的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
芽孢桿菌(Bacillus sp.)由于能夠產(chǎn)生抗逆性的芽孢，能夠忍受多種不良環(huán)境，具有促長、防病等作用，是生物制劑的ー種重要資源。礦質(zhì)養(yǎng)料是微生物生長必不可少的ー類營養(yǎng)物質(zhì)，主要參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成，并與能量轉(zhuǎn)移、細(xì)胞透性調(diào)節(jié)有夫，是酶的活性基組分或激活劑。但是加入過量也會對微生物產(chǎn)生毒害。
目前國內(nèi)外芽孢桿菌發(fā)酵研究熱點在于以代謝產(chǎn)物為目標(biāo)的碳氮源的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，缺乏以活菌為目標(biāo)產(chǎn)物的相關(guān)研究，礦質(zhì)養(yǎng)料對芽孢桿菌生長速率的影響尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)芽孢桿菌生長的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus sp.)的培養(yǎng)基,是在Tryptone Broth培養(yǎng)基中添加K+至其終濃度為2. 2-5. ImM,如2. 2mM,同時添加Cu2+至其終濃度為8 μ M的培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，所述Tryptone Broth培養(yǎng)基的溶質(zhì)為胰蛋白胨、鹿糖和NaCl,溶劑為水；所述胰蛋白胨在所述Tryptone Broth培養(yǎng)基中的終濃度為10g/L,所述鹿糖在所述Tryptone Broth培養(yǎng)基中的終濃度為10g/L,所述NaCl在所述Tryptone Broth培養(yǎng)基中的終濃度為5g/L ;所述Tryptone Broth培養(yǎng)基的pH為7. 5。所述K+可來源于K2HP04、KH2PO4, KCUK2SO4, KOH或K2CO3等多種含鉀化合物，在本發(fā)明的一個實施例中，所述K+具體來源于K2HPO4,當(dāng)然K2HPO4的水合物也可達(dá)到相同的效
果O所述Cu2+可來源于CuSO4 · 5H20, CuCl2等，在本發(fā)明的一個實施例中，所述Cu2+具體來源于CuSO4 · 5H20,當(dāng)然CuSO4的其他水合物以及CuSO4也可達(dá)到相同的效果。所述培養(yǎng)基為貯存型培養(yǎng)基(粉末)或即用型培養(yǎng)基(溶液)；所述貯存型培養(yǎng)基由K2HP04、CuSO4 ·5Η20 (或 CuS04)、胰蛋白胨、蔗糖和 NaCl 按照 O. 19g :0. 002g (或 O. 00128g)10g10g5g的配比組成；所述即用型培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)為K2HPO4, CuSO4 · 5H20、胰蛋白胨、蔗糖和NaCl，在所述即用型培養(yǎng)基中，所述K2HPO4的終濃度為O. 19g/L，所述CuSO4 · 5H20的終濃度為O. 002g/L，所述胰蛋白胨的終濃度為10g/L，所述蔗糖的終濃度為10g/L，所述NaCl的終濃度為5g/L，pH7. 5。在本發(fā)明的一個實施例中，所述培養(yǎng)基具體為上述即用型培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基在如下(I)- (4)任一種的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍(I)提高芽孢桿菌(Bacillus sp.)生長速率；
(2)提高芽孢桿菌(Bacillus sp.)產(chǎn)量；(3)縮短芽孢桿菌(Bacillus sp.)芽孢形成時間；(4)提高芽孢桿菌(Bacillus sp.)芽孢形成率。在本發(fā)明中，所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)生長速率具體體現(xiàn)在所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌體生長曲線(0D_)的斜率上，斜率越大，則所述芽孢桿菌(Bacillussp.)生長速率越快。所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)產(chǎn)量具體體現(xiàn)在所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌體生長曲線(OD6tltl)某一時間點(橫坐標(biāo))所對應(yīng)的OD6tltl值(縱坐標(biāo))上，OD6tltl值越大，則所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)該時間點的產(chǎn)量越高。所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)芽孢形成時間具體體現(xiàn)在發(fā)酵罐菌體生長曲線(0D_)末端的時間點，曲線越短，形成芽孢的時間就越短(所述生長曲線(OD6tltl)末端的時間點對應(yīng)顯微鏡檢芽孢形成率達(dá)80%的時間)。所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)芽孢形成率具體體現(xiàn)在顯微鏡100倍觀察數(shù)據(jù)記錄，以染色后顯微鏡下觀察計算，一個視野中，100個細(xì)胞中芽孢的數(shù)量。芽孢形成 率=100%X (芽孢的數(shù)量/100)。本發(fā)明的再ー個目的是提供一種培養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus sp.)的方法。該方法包括將所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)接種到上述培養(yǎng)基中，在30-32°C，如32°C進(jìn)行振蕩培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)的步驟。在上述方法中，在生長曲線分析儀配套培養(yǎng)板中培養(yǎng)時，所述培養(yǎng)的時間是7-64h。在本發(fā)明的實施例中具體為20h，或64h。在上述方法中，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)時,所述培養(yǎng)的時間可為34_64h,在本發(fā)明的ー個實施例中具體為40h。所述培養(yǎng)過程中的通氣量可為O. 5 (V / V -min)至I. 5 (V / V -min)；所述通氣量以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示。在本發(fā)明的一個實施例中，發(fā)酵培養(yǎng)時，所述培養(yǎng)過程中的通氣量具體為培養(yǎng)前期(從培養(yǎng)開始至菌體生長對數(shù)期之前)通氣量為O. 5 (V / ν·π η)，培養(yǎng)后期(從菌體生長對數(shù)期至最大生長量期結(jié)束)I. 5 (V / V -min)(所述通氣量以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示,O. 5 (V / V *min)表示每分鐘內(nèi)通入氣體的體積為培養(yǎng)液體積的ー半)。在本發(fā)明的實施例中，上述所有的所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)均為枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis),具體為枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) B201 CGMCCNo.5786。本發(fā)明的另ー個目的是提供一種培養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus sp.)的培養(yǎng)基礦質(zhì)養(yǎng)料本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基礦質(zhì)養(yǎng)料，具體由質(zhì)量比為95g : Ig的K2HPO4和CuSO4 ·5Η20組成。當(dāng)然也可將CuSO4 · 5Η20轉(zhuǎn)換為相應(yīng)質(zhì)量的CuS04。在使用中，所述K2HPO4在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. 19g/L，所述CuSO4 · 5H20在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. 002g/L。所述培養(yǎng)基礦質(zhì)養(yǎng)料成分在制備上述培養(yǎng)基，或培養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus sp.)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明通過研究礦質(zhì)養(yǎng)料對芽孢桿菌生長速率的影響，明確影響芽孢桿菌(Bacillus sp.)生長的主要礦質(zhì)養(yǎng)料,實驗證明，使用添加該礦質(zhì)養(yǎng)料的Tryptone Broth培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) B201 CGMCC No. 5786，發(fā)酵液含菌量能提高約2倍，芽孢形成時間縮短15%。如此，生產(chǎn)成本將降低30%。具有很好的推廣價值。本發(fā)明為芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化提供參考，同時為相關(guān)生防制劑的研制與開發(fā)提供理論指導(dǎo)。保藏證明參據(jù)的生物材料B201建議的分類命名枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)保藏機(jī)構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡稱CGMCC地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號 保藏日期2012年2月22日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 578

圖I為不同濃度的各種礦質(zhì)養(yǎng)料對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) B201CGMCC No. 5786 生長的影響。其中，A 代表 K (KH2PO4) ；B 代表 Mg (MgSO4 · 7H20) ；C 代表 Mn(MnSO4 · H2O) ；D 代表 Fe (FeSO4 · 7H20) ；E 代表 Zn (ZnSO4 · 7H20) ；F 代表 Cu (CuSO4 · 5H20)；G 代表 Mo (Na2MoO4 · 2H20) ;H 代表 Ca (CaCl2)0圖2為不同來源的K離子對枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) B201 CGMCCNo. 5786生長的影響。圖3為含有最優(yōu)礦質(zhì)養(yǎng)料配比和不含礦質(zhì)養(yǎng)料的Tryptone Broth培養(yǎng)基對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B201 CGMCC No. 5786在生長曲線分析儀中培養(yǎng)的生長影響的對比圖。其中，TS表示Tryptone Broth培養(yǎng)基。圖4為含有最優(yōu)礦質(zhì)養(yǎng)料配比和不含礦質(zhì)養(yǎng)料的Tryptone Broth培養(yǎng)基對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B201 CGMCC No. 5786在50L發(fā)酵罐中培養(yǎng)的生長影響的對比圖。其中，TS表不Tryptone Broth培養(yǎng)基。圖5為含有不同濃度K離子的エ業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) B201 CGMCC No. 5786在300mL三角瓶中培養(yǎng)的生長影響的對比圖。其中，a為不添加外源K離子的エ業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基；b為添加了終濃度為O. 3g/L的KH2PO4的エ業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基；c為添加了終濃度為O. 5g/L的KH2PO4的エ業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基；d為添加了終濃度為O. 7g/L的KH2PO4的エ業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。LB液體培養(yǎng)基終濃度為10g/L的胰蛋白胨、終濃度為10g/L的NaCl、終濃度為5g/L的酵母提取物、余量為水，pH7. 0-7. 2。LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另加終濃度為15g/L的瓊脂粉。Tryptone Broth液體培養(yǎng)基終濃度為10g/L的胰蛋白胨、終濃度為10g/L的蔗糖、終濃度為5g/L的NaCl、余量為水，pH7. 5。
Tryptone Broth固體培養(yǎng)基在Tryptone Broth液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另加終濃度為15g/L的瓊脂粉。胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptic Soy Agar, TSA)平板終濃度為15g/L的胰蛋白胨，終濃度為5g/L的大豆蛋白胨，終濃度為5g/L的NaCl，余量為水，pH7. 5。下述實施例中所涉及的種子液的制備均按照如下方法進(jìn)行用胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptic Soy Agar,TSA)平板活化枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B201 CGMCC No. 5786菌種，30°C過夜培養(yǎng)后，從平板上挑取單菌落并接種于15mLTS液體培養(yǎng)基中，320C、160r/min過夜培養(yǎng)(12h)，經(jīng)顯微鏡檢查菌體形態(tài)正確，無污染，將培養(yǎng)好的菌液，6000r/min離心5min,用無菌水清洗兩遍,制成菌懸液。用分光光度計600nm波長測OD值，使OD值達(dá)到1，得到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B201 CGMCC No. 5786的種子液。實施例I、促進(jìn)芽孢桿菌生長的培養(yǎng)基所用礦質(zhì)養(yǎng)料的確定一、礦質(zhì)養(yǎng)料基本濃度范圍的確定 I、不同濃度礦質(zhì)養(yǎng)料的配制及相應(yīng)培養(yǎng)基的配制由于每處理所需要的礦質(zhì)養(yǎng)料的質(zhì)量很小，稱量誤差大，所以先配制母液，母液要求溶質(zhì)能完全溶解，根據(jù)母液的濃度換算每處理所需要加的體積，這個體積的增加對于培養(yǎng)基體積的影響應(yīng)該忽略不計整；對于Tryptone Broth培養(yǎng)基中本身的礦質(zhì)養(yǎng)料的含量用原子吸收分光光度計進(jìn)行了檢測(各元素在Tryptone Broth培養(yǎng)基中的含量見表1)，根據(jù)《普通微生物學(xué)》中，微生物生長所需各礦質(zhì)養(yǎng)料的一般濃度范圍，設(shè)定了各礦質(zhì)養(yǎng)料相應(yīng)的濃度梯度，如表I所示。表I礦質(zhì)養(yǎng)料濃度設(shè)定
權(quán)利要求
1.培養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillussp.)的培養(yǎng)基,是在Tryptone Broth培養(yǎng)基中添加K+至其終濃度為2. 2mM至5. ImM,同時添加Cu2+至其終濃度為8 y M的培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述K+來源于K2HPO4或K2HPO4的水合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述Cu2+來源于CuSO4或CuSO4的水合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基為貯存型培養(yǎng)基或即用型培養(yǎng)基； 所述貯存型培養(yǎng)基由K2HP04、CuSO4 5H20、胰蛋白胨、蔗糖和NaCl按照0. 19g :0. 002g 10g10g5g的配比組成;所述即用型培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)SK2HP04、CuSO4 5H20、胰蛋白胨、蔗糖和NaCl，在所述即用型培養(yǎng)基中，所述K2HPO4的終濃度為0. 19g/L，所述CuSO4 5H20的終濃度為0. 002g/L，所述胰蛋白胨的終濃度為10g/L，所述蔗糖的終濃度為10g/L，所述NaCl的終濃度為5g/L，pH7. 5。
5.權(quán)利要求1-4中任一所述培養(yǎng)基在如下(I)- (4)任一中的應(yīng)用 (1)提高芽孢桿菌(Bacillussp.)生長速率; (2)提高芽孢桿菌(Bacillussp.)產(chǎn)量; (3)縮短芽孢桿菌(Bacillussp.)芽孢形成時間； (4)提高芽孢桿菌(Bacillussp.)芽孢形成率。
6.培養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillussp.)的方法,包括將所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)接種到權(quán)利要求1-4中任一所述的培養(yǎng)基中，在30-32°C進(jìn)行振蕩培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的時間是7-64。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的時間是34-64h;所述培養(yǎng)過程中的通氣量為 0. 5 (V / V min)至 I. 5 (V / V min)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的培養(yǎng)基，或權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，或權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。
10.培養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillussp.)的培養(yǎng)基礦質(zhì)養(yǎng)料成分，其特征在于所述培養(yǎng)基礦質(zhì)養(yǎng)料成分由質(zhì)量比為95g :lg的K2HPO4和CuSO4 5H20組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進(jìn)芽孢桿菌生長的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基，是在Tryptone Broth培養(yǎng)基中添加K+至其終濃度為2.2mM，同時添加Cu2+至其終濃度為8μM的培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，具體添加了終濃度為0.3g/L的K2HPO4，以及終濃度為0.002g/L的CuSO4·5H2O。實驗證明，使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B201 CGMCC No.5786，發(fā)酵液含菌量能提高2倍，芽孢形成時間縮短15%，如此，生產(chǎn)成本將降低30%。具有很好的推廣價值。本發(fā)明為芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化提供參考，同時為相關(guān)生防制劑的研制與開發(fā)提供理論指導(dǎo)。
文檔編號C12N1/38GK102676444SQ20121016943
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日
發(fā)明者張麗霞, 李燕, 李超, 段玲玲, 王 琦, 鄭紹芳, 金洪 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)