專利名稱：構象差異凝膠電泳檢測單核苷酸多態(tài)性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，尤其涉及一種構象差異凝膠電泳檢測單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術：
隨著人類基因組計劃的完成，越來越多的研究開始關注基因多態(tài)性在醫(yī)學方面的應用。作為第三代的遺傳標記，單核苷酸多態(tài)性可能與疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關，也可能與疾病治療過程中藥物的療效和毒副作用相關，因此，對SNPs的準確分型有助于疾病的早期診斷、預防和治療。目前已有很多的SNPs的分型方法，但有的方法要經(jīng)過繁雜的過程，有的方法需要特定的設備，有的方法需要昂貴的試劑，有的方法需要熟練的技能。因此，有必要建立一種 能在普通實驗室開展的準確、簡便、快速、成本低的SNP分型方法。構象敏感凝膠電泳是一種主要對突變進行檢測的方法，其原理是溫和變性劑可以增大堿基錯配引起的DNA同源雙鏈和異源雙鏈之間構象的差異，從而在聚丙烯酰胺凝膠電泳時對同源雙鏈和異源雙鏈條帶進行區(qū)分。通常情況下，構象敏感凝膠電泳可以區(qū)分同源雙鏈和異源雙鏈條帶，但不能區(qū)分兩種同源雙鏈條帶，因此對SNPs的檢測需要設立一個對照純合子，將一條帶樣本的PCR產(chǎn)物與對照純合子樣本的PCR產(chǎn)物等體積混合，變性復性后再次進行構象敏感凝膠電泳分析，從而對兩種純合子樣本進行區(qū)分。Leung等的研究表明構象敏感凝膠電泳不僅可以區(qū)分同源雙鏈和異源雙鏈條帶，而且還可以對某些SNPs的兩種同源雙鏈條帶進行區(qū)分。與普通聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，構象敏感凝膠電泳使用了價格昂貴的交聯(lián)劑1，4-雙丙烯酰哌嗪，在凝膠中加入了變性劑，使用含牛磺酸的O. 5 X TTE作為電泳緩沖液，從而增加了實驗成本，而且電泳時間較長(通常為16h)。因此，如果能用普通聚丙烯酰胺凝膠電泳直接對SNP進行分型，可大大降低實驗成本，提高效率。因為聚丙烯酰胺凝膠電泳對SNPs分型的原理是由于DNA分子構象的差異，我們把這種對SNPs分型的方法稱為構象差異凝膠電泳。本研究用構象差異凝膠電泳對3個SNPs進行了分析，證明構象差異凝膠電泳可以直接對SNPs進行分型，從而使其成為一種準確、簡便、快速、低成本的SNPs分型方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種構象差異凝膠電泳檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，對口腔拭子提取基因組DNA，作為PCR擴增用的模板。選取與疾病發(fā)生、藥物療效和毒性相關的3 個 SNPs 進行檢測NQOl 基因 C609T、CHRNA3 基因的 rsl2910984、MTHFR 基因 A1298C。前2個SNPs擴增所用引物由Primer3軟件設計，MTHFR A1298C擴增所用引物使用文獻中引物。PCR擴增后在濃度為8%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，銀染顯色。根據(jù)電泳條帶的位置和數(shù)目判斷為不同基因型。根據(jù)DNA測序結果判斷為3種具體基因型。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，具體步驟如下a)口腔拭子由志愿者提供，每人清水漱口后用無菌棉簽在口腔頰黏膜輕擦10次，室溫下保存于5ml滅菌離心管；
b)提取口腔拭子基因組DNA，最后將DNA稀釋為10ng/μ 1，作為擴增用模板；
c)選取與疾病發(fā)生、藥物療效和毒性相關的3個SNPs進行檢測NQ01基因C609T、CHRNA3 基因的 rs 12910984、MTHFR 基因 A1298C ；
d)用Primer3軟件設計前2個SNPs擴增所用引物，MTHFRA1298C擴增所用引物使用文獻中引物；以10μ I體系在同一條件下擴增；
e)3個片段的PCR產(chǎn)物在同一條件下電泳；
f)銀染顯色，根據(jù)條帶的位置和數(shù)目判斷為不同基因型；
g)DNA測序對3個SNPs的分型結果進行驗證、明確純合子基因型。 步驟b)中基因組DNA提取用鹽析法進行。其中步驟d)擴增條件為94°C預變性3 min ;94°C變性20 s，60°C退火30 s，72°C延伸20 S，35個循環(huán)；最后72°C延伸5 min。其中步驟e)中電泳條件為膠濃度為8%，使用北京六一儀器廠的DYCZ-20C電泳槽在室溫下800V電泳，電泳時間為2h。其中步驟f)中不同基因型判定出現(xiàn)2條或2條以上條帶者判定為雜合子基因型，出現(xiàn)I條帶者判斷為純合子基因型，不同純合子基因型的區(qū)分通過測序來完成。其中步驟g)中DNA測序為?、荊E表現(xiàn)為不同帶型樣本的PCR產(chǎn)物和正反向引物送北京諾賽基因組研究中心進行。由于純合子樣本在PCR過程中只有I種同源雙鏈DNA分子，故在電泳時表現(xiàn)為I條帶，而不同純合子樣本由于構象的不同在電泳時表現(xiàn)為遷移率不同，故可以對兩種純合子樣本進行區(qū)分。雜合子樣本在PCR過程中除了有2種同源雙鏈DNA分子外，還有2種異源雙鏈DNA分子，故在電泳時可表現(xiàn)為2 4條帶(由4種DNA分子遷移率差異的大小而定)，所以在電泳時表現(xiàn)為2條及2條以上條帶者可判定為雜合子。就象其他以構象為基礎的檢測SNPs的技術(如單鏈構像多態(tài)性、構像敏感凝膠電泳等)一樣，構像差異凝膠電泳不能直接判定兩種I條帶樣本分別為哪一種純合基因型，但可通過測序來對兩種純合子樣本進行區(qū)分。本發(fā)明的技術效果是本發(fā)明對SNPs的分析是對雙鏈PCR產(chǎn)物進行分析，不需要內切酶，在電泳前不需要對樣品進行任何處理，可以直接上樣，不需要昂貴的設備和試劑，因此操作簡便，成本較低。這一發(fā)明為疾病易感性和個體化藥物治療相關SNPs提供了快速、準確、簡便、低成本的檢測手段，為其在臨床應用上奠定了基礎。


圖I為10例樣本NQOl基因C609T構象差異凝膠電泳圖，其中1、4、7、10為3條帶，2、5、8為遷移率慢的I條帶，3、6、9為遷移率快的I條帶，11為陰性對照，M為DNA分子量標準。圖2為NQOl基因C609T測序圖,其中A為8號樣本測序圖,B為9號樣本測序圖，C為10號樣本測序圖。結合圖I和圖2，可知在構象差異凝膠電泳圖上表現(xiàn)為3帶的樣本(1、4、7和10號)是CT基因型，遷移率慢的I條帶樣本(2、5和8)為TT基因型，遷移率快的I條帶樣本(3、6和9)為CC基因型。圖3為6例樣本CHRNA3基因的rsl2910984構象差異凝膠電泳圖，其中1、2為遷移率慢的I條帶，為GG基因型，3、4為遷移率快的I條帶，為AA基因型，5、6為3條帶，為AG基因型，7為陰性對照。圖4為6例樣本MTHFR基因A1298C構象差異凝膠電泳圖，其中1、2為遷移率慢的I條帶，為AA基因型，3、4為遷移率快的I條帶，為CC基因型，5、6為2條帶，為AC基因型，7為陰性對照。
具體實施例方式如圖I、圖2、圖3、圖4所示，口腔拭子由志愿者提供，每人清水漱口后用無菌棉簽在口腔頰黏膜輕擦10次，室溫下保存于5ml滅菌離心管。根據(jù)文獻使用鹽析法提取口腔拭子基因組DNAJpTVSOyL TE溶解。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結果將DNA稀釋為10 ng/μ ，作 為PCR擴增的模板。選取與疾病發(fā)生、藥物療效和毒性相關的3個SNPs進行檢測CHRNA3基因的rsl2910984、NQOl 基因 C609T、MTHFR 基因 A1298C。前 2 個 SNPs 擴增所用引物由 Primer3軟件設計，MTHFR A1298C擴增所用引物使用文獻中引物。3個SNPs的引物具體見表I。表I引物序列表
基因I位點I上游引物(5’到3’)I下游引物(5’到3’)I長度(bp)
NQOl C609T_GAAGCCCAGACCAACTTCT_AGGCTGCTTGGAGCAAAATA_247_
CHRNA~ rsl291098T~ ttgaactcctgggctcaagtGGGCTAGTTCACCACTTTGC170
MTHFR |A1298C |CTTTGGGGAGCTGAAGGACTAC |CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG |l63
_ PCR
反應體系均為 10 μ I,包含 2XPfu master mix (或 SinoBio 2XTaq master mix) 5 μ I,10 μπιοΙ/L 上下游引物各 0. 2 μ 1，模板 0.5 μ l,ddH20 4. I μ I。使用朗基 MG96G/Y PCR儀進行擴增，3個片段使用相同的擴增條件94°C預變性3 min ;94°C變性20 s，60°C退火30s，72°C延伸20 s，35個循環(huán)；最后72°C延伸5 min。使用北京六一儀器廠的DYCZ-20C電泳槽對SNPs進行分析。步驟如下(I)配制8%聚丙烯酰胺凝膠，(2)在加樣孔加入O. 8 μ I PCR產(chǎn)物，室溫下800V穩(wěn)壓電泳2h，(3)電泳結束后銀染顯色，顯色后即可區(qū)分純合和雜合基因型(如果已經(jīng)知道I條帶樣本分別對應的基因型，則顯色后即可對3種基因型進行區(qū)分)。(4)將凝膠轉移至白色濾紙，貼在有保鮮膜的玻璃板上，56°C溫箱中烤干。(5)佳能LiDE200掃描儀對電泳圖進行掃描。取構象差異凝膠電泳表現(xiàn)為不同帶型的樣本擴增后進行測序，結合電泳圖上電泳條帶的位置和數(shù)目判斷樣品的基因型。實驗結果參照說明書附圖。由附圖可見，NQOl基因 C609T、CHRNA3 基因的 rsl2910984 和 MTHFR 基因 A1298C的3種基因型都可以清楚地區(qū)分開。圖I 中，M :天根 DNA Marker I 1、4、7、10 :CT 基因型 2、5、8:TT 基因型 3、6、9:CC基因型 11:陰性對照。圖2中，A :TT基因型(8號樣本) B :CC基因型(9號樣本) C :CT基因型(10號樣本)。
圖3 中，M :天根 DNA Marker I 1、2:GG 基因型 3、4:AA 基因型 5、6:AG 基因型7:陰性對照。圖4 中，M :天根 DNA Marker I 1、2:AA 基因型 3、4:CC 基因型 5 、6:AC 基因型7:陰性對照。
權利要求
1.一種構象差異凝膠電泳檢測單核苷酸多態(tài)性的簡易方法，其特征是具體步驟如下 a)口腔拭子由志愿者提供，每人清水漱口后用無菌棉簽在口腔頰黏膜輕擦10次，室溫下保存于5ml滅菌離心管； b)提取口腔拭子基因組DNA，最后將DNA稀釋為10ng/yl，作為擴增用模板； c)選取與疾病發(fā)生、藥物療效和毒性相關的3個SNPs進行檢測NQ01基因C609T、CHRNA3 基因的 rsl2910984、MTHFR 基因 A1298C ； d)用Primer3軟件設計前2個SNPs擴增所用引物，MTHFRA1298C擴增所用引物使用文獻中引物；以IOiil體系在同一條件下擴增； e)3個片段的PCR產(chǎn)物在同一條件下電泳； f)銀染顯色，根據(jù)條帶的位置和數(shù)目判斷為不同基因型； g)DNA測序對3個SNPs的分型結果進行驗證、明確純合子基因型。
2.根據(jù)權利要求I所述的構象差異凝膠電泳檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是步驟b)中基因組DNA提取用鹽析法進行。
3.根據(jù)權利要求I所述的構象差異凝膠電泳檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，其中步驟d)擴增條件為94°C預變性3 min ;94°C變性20 s，60°C退火30 s，72°C延伸20S，35個循環(huán)；最后72°C延伸5 min。
4.根據(jù)權利要求I所述的構象差異凝膠電泳檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，其中步驟e)中電泳條件為膠濃度為8%，使用北京六一儀器廠的DYCZ-20C電泳槽在室溫下800V電泳，電泳時間為2h。
5.根據(jù)權利要求I所述的構象差異凝膠電泳檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，其中步驟f)中不同基因型判定出現(xiàn)2條或2條以上條帶者判定為雜合子基因型，出現(xiàn)I條帶者判斷為純合子基因型，不同純合子基因型的區(qū)分通過測序來完成。
6.根據(jù)權利要求I所述的構象差異凝膠電泳檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，其中步驟g)中DNA測序為取CDGE表現(xiàn)為不同帶型樣本的PCR產(chǎn)物和正反向引物送北京諾賽基因組研究中心進行。
全文摘要
一種構象差異凝膠電泳檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，具體步驟如下(1)樣本收集；(2)樣本基因組DNA提??；(3)選取與疾病發(fā)生、藥物療效和毒性相關的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)進行聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction，PCR)擴增；(4)PCR產(chǎn)物構象差異凝膠電泳分析，根據(jù)條帶的位置和數(shù)目判斷為不同基因型。(5)取不同帶型樣本的PCR產(chǎn)物進行DNA測序，判斷不同樣本的具體基因型。本發(fā)明對SNPs的分析是對雙鏈PCR產(chǎn)物進行分析，不需要內切酶，在電泳前不需要對樣品進行任何處理，可以直接上樣，不需要昂貴的設備和試劑，因此操作簡便，成本較低。這一發(fā)明為疾病易感性和個體化藥物治療相關SNPs提供了快速、準確、簡便、低成本的檢測手段，為其在臨床應用上奠定了基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102766684SQ201210169639
公開日2012年11月7日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權日2012年5月29日
發(fā)明者萬福生, 余樂涵, 張泉, 揭克敏, 易敬林, 朱偉鋒, 羅達亞, 鄧燕 申請人:南昌大學