專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高通量棉花品種dna指紋庫(kù)構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種高通量棉花品種DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
棉花是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物，優(yōu)良新品種的培育與推廣對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展與人民生活水平的提高具有重要意義。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2000— 2009年我國(guó)通過(guò)國(guó)家及省級(jí)審定的棉花品種數(shù)量700多個(gè)。截止到2012年2月29日，已申請(qǐng)植物新品種保護(hù)的棉花品種達(dá)335個(gè)。然而，由于骨干親本的集中使用與轉(zhuǎn)基因技術(shù)在棉花育種中的大規(guī)模應(yīng)用，棉花品種間的遺傳差異越來(lái)越小，使得完全依賴傳統(tǒng)的形態(tài)性狀進(jìn)行品種鑒別越來(lái)越困難。同時(shí)由于形態(tài)鑒定的時(shí)效性差，容易受到環(huán)境與主觀因素的影響，品種多亂雜的現(xiàn)象難以得到有效控制。近年來(lái)，以微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記為基礎(chǔ)的玉米、水稻等主要農(nóng)作物的DNA指紋庫(kù)構(gòu)建已逐步開(kāi)展，基于SSR標(biāo)記在棉花遺傳圖譜構(gòu)建、純度鑒定與遺傳多樣性分析等方面的研究·也有相關(guān)報(bào)道。但常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染技術(shù)的檢測(cè)方法在分析的材料和位點(diǎn)較多時(shí)，檢測(cè)工作顯得費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不同膠板間數(shù)據(jù)的整合與統(tǒng)計(jì)是ー項(xiàng)很繁瑣的工作，數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性也很難保證。多色熒光檢測(cè)技術(shù)是以不同顔色的熒光染料標(biāo)記在SSR引物的5’端，熒光檢測(cè)器對(duì)標(biāo)記有熒光染料的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行信號(hào)采集，并通過(guò)與各泳道的分子量?jī)?nèi)標(biāo)進(jìn)行比對(duì)，可自動(dòng)讀取產(chǎn)物片段大小，大大提高檢測(cè)效率的同時(shí)保證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，尤其適用于大規(guī)模材料的檢測(cè)分析。然而，基于棉花SSR的多色熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)構(gòu)建我國(guó)棉花品種DNA指紋庫(kù)的方法還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種高通量棉花品種DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足。本發(fā)明提供的一種高通量棉花品種DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法，包括以下步驟(I)提取棉花 DNA ；(2)使用分布于棉花全基因組26條染色體上的ー套40對(duì)核心引物分別對(duì)待測(cè)品種進(jìn)行SSR-PCR檢測(cè)，每對(duì)引物標(biāo)記有熒光染料標(biāo)記，所述核心引物的核苷酸序列如下表I所示表I
權(quán)利要求
1.一種高通量棉花品種DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取棉花DNA； 2)使用分布于棉花全基因組26條染色體上的ー套40對(duì)核心引物分別對(duì)待測(cè)品種進(jìn)行SSR-PCR檢測(cè)，每對(duì)引物標(biāo)記有熒光染料，所述核心引物的核苷酸序列如下所示
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，步驟I)所述DNA提取包括以下步驟將去殼棉種粉碎后，加入SDS提取液，漩渦充分后，65°C水??；加入體積比依次為25 : 24 : I的酚、氯仿和異戊醇的混合液，混勻，離心；取上清，加入濃度為10mg/mlRNase，水浴；抽提后離心取上清，加入異丙醇，待DNA成團(tuán)析出后，用乙醇洗滌DNA沉淀，加入TE或ddH20充分溶解DNA，備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在干，所述DNA提取包括以下步驟將去殼棉種充分粉碎后，加入800 u I SDS提取液，漩渦充分后，65°C水浴30min，間隔IOmin輕搖一次；加入等體積800 u I體積比依次為25 24 I的酚、氯仿和異戊醇的混合液，混勻至不分層，IOOOOrpm離心IOmin ;取上清，加入濃度為10mg/ml的Iu I RNase, 37 °C水浴30min ;重復(fù)抽提一次后離心取上清，加入0. 7倍體積異丙醇，待DNA成團(tuán)析出后，70%乙醇洗滌DNA沉淀2次，加入200 u ITE或ddH20充分溶解DNA，備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，步驟2)每對(duì)引物的熒光標(biāo)記如下
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，步驟2)所述SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，其中20u L反應(yīng)液中包括濃度為5m mo I / L的上、下游引物各0. 5 u L、8uL2. 5XBuffer緩沖液、濃度為20ng/uL DNA模板2 u L、濃度為5U/u L Tag聚合酶0.16 u L、8. 84 u LddH2O0
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，步驟2)所述SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min，I個(gè)循環(huán)；94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸45s，共32個(gè)循環(huán)；60°C延伸30min，I個(gè)循環(huán)；15°C保存待用。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在干，步驟3)是將40對(duì)引物分別擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物稀釋5倍后，取I UL稀釋液加8. 5 UL去離子甲酰胺和0.5u LLiz-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)，按照熒光多重PCR組合方式，于DNA分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，所述每對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光多重PCR組合方式為
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，步驟3)所述毛細(xì)管電泳檢測(cè)條件為預(yù)電泳13kV，3min ；1. 5kV進(jìn)樣IOs ;電泳10kV，40min。
10.SEQ ID No. 1-80所述的引物在構(gòu)建高通量棉花品種DNA指紋庫(kù)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高通量棉花品種DNA指紋庫(kù)構(gòu)建方法，該方法包括提取棉花品種DNA，使用40對(duì)引物(核苷酸序列如SEQ ID No.1-80所示)進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光多重PCR組合，于DNA分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管五色熒光電泳檢測(cè)，根據(jù)熒光圖譜進(jìn)行棉花品種DNA指紋庫(kù)構(gòu)建。本發(fā)明方法相比常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測(cè)效率提高了10倍以上，且通過(guò)分子量?jī)?nèi)標(biāo)的自動(dòng)比對(duì)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，減少人為讀板誤差的同時(shí)，最大程度地保證了數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102732973SQ20121017001
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日
發(fā)明者馮新愛(ài), 匡猛, 周大云, 方丹, 楊偉華, 王延琴, 許紅霞 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所