專利名稱：一種用于快速基因克隆的酶混合物及制備方法、包含該酶混合物的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及ー種酶混合物，尤其涉及一種用于快速基因克隆的酶混合物及其制備方法。此外，本發(fā)明還涉及包含該酶混合物的試劑盒。
背景技術(shù)：
λ噬菌體Red重組系統(tǒng)已成功地應(yīng)用于基因的定點(diǎn)替代、修復(fù)和染色體工程中，特別的，該系統(tǒng)也可應(yīng)用于快速基因克隆，取代傳統(tǒng)的TA克隆法，限制性酶切與連接法等。TA克隆高效、成功率高，但是需要単獨(dú)再次構(gòu)建表達(dá)載體。限制性酶切與連接法是利用II型限制性內(nèi)切酶雙酶切，將目的基因和表達(dá)載體切出互補(bǔ)的粘性末端，利用T4 DNA Iigase將互補(bǔ)的粘性末端或者平末端連接。這兩種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力并且在克隆設(shè)計(jì)上經(jīng)常會(huì)遇到很多限制，比如I.沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)。2.多余的酶切位點(diǎn)又會(huì)増加不必要的氨基酸，在蛋白表達(dá)中使重組蛋白與天然蛋白性質(zhì)變得不同。3.不適合高通量的基因克隆等等。所以，ー種不依賴連接酶，而直接用同源重組的方法，即無(wú)縫克隆(seamlesscloning)技術(shù)，完成目的片段與載體相連接的基因克隆技術(shù)日漸獲得研究者的青睞。目前，市場(chǎng)上銷售的無(wú)縫克隆酶或試劑盒有Invitrogen公司的GENEART+15+Seamless Cloningand AssemblyKit ;Clontech 的 In-Fusion HD Cloning Kit ;金斯瑞的CloneEZ 重組克隆試劑盒；德聚生物的Dogene seamless cloning kit等等。這些試劑盒使用融合酶，重組酶或酶混合物，可以促進(jìn)有15bp末端序列同源的線性化載體和目的片段的同源重組而完成無(wú)縫克隆實(shí)驗(yàn)。這些試劑盒都無(wú)需酶切連接，但是有的反應(yīng)時(shí)間超過(guò)30分鐘，如，GENEART Seamless Cloning andAssembly Kit 和CloneEZ 重組克隆試劑盒，有的反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜，需要兩個(gè)不同的溫度，如CkmeEZ 重組克隆試劑盒(室溫25° C 30分鐘，然后冰上放置 5 分鐘)，Dogene seamlesscloning kit (室溫 25°C, 30 分鐘；然后 42°C, 15 分鐘)；Clontech的In-Fusion HD CloningKit雖然只要15分鐘,但它需要在50°C溫度下反應(yīng)，需要提前預(yù)熱水浴鍋，不如室溫25°C放置簡(jiǎn)單方便，等等這些都給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)不便。因此，亟需研發(fā)一種新的融合酶，重組酶或酶混合物用于無(wú)縫克隆。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之ー在于提供一種用于快速基因克隆的酶混合物，其可有效應(yīng)用于無(wú)縫克隆(seamless cloning),在室溫下放置較短時(shí)間就能達(dá)到很高的陽(yáng)性率。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之ニ在于提供ー種包含該酶混合物的試劑盒。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三在于提供一種該酶混合物的制備方法。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案在本發(fā)明的一方面，提供一種用于快速基因克隆的酶混合物，該酶混合物由Reda蛋白，Red^蛋白和Gam蛋白組成,在該酶混合物中，三種蛋白的混合比例如下Reda蛋白的使用濃度為3ng/ μ I ；Red^蛋白的使用濃度為150ng/ μ l_1500ng/ μ I ;Gam蛋白的使用濃度為 3ng/ μ l-300ng/ μ I。本發(fā)明是一種基于λ噬菌體Red重組系統(tǒng)的應(yīng)用于快速基因克隆技術(shù)的酶混合物。研究表明，Red重組系統(tǒng)要發(fā)揮其高效的同源重組功能，需要Reda，Red^和Gam三種蛋白的作用。Reda，Red^和Gam來(lái)源于基因工程重組蛋白，純度>95%。Reda是ー個(gè)24kd的蛋白，具有5' —3'核酸外切酶的活性，可使線性雙鏈DNA產(chǎn)生突出的3'粘性末端。Redii是ー種退火蛋白，分子量為25kD，可以自發(fā)地形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，緊緊地結(jié)合在單鏈DNA3/粘性末端，防止DNA被單鏈核酸酶降解，同時(shí)介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA的退火，促進(jìn)替代基因兩端的序列和與其同源的靶基因序列間發(fā)生重組，在重組反應(yīng)中起非常大的作用。Gam蛋白只有16kd，但它能與宿主細(xì)胞中RecB⑶核酸酶結(jié)合，抑制RecB⑶核酸酶對(duì)外源DNA的降解，對(duì)外源DNA起到保護(hù)作用。

在本發(fā)明的另一方面，提供ー種含有上述酶混合物的試劑盒。該試劑盒還包括如下反應(yīng)緩沖液100-500mM 的 Tris-HclCpH 7. 5，25。。)，IOOmM 的 MgCl2, IOmM 的 ATP，5-10mM的 DTT，0-0. 5%mM 的 BSA。mM=lmmol/L 毫摩爾每升。在本發(fā)明的另一方面，提供一種該酶混合物的制備方法，包括如下步驟(I)Reda , Red^和Gam蛋白表達(dá)菌株的獲得全基因合成Red a，Red β和Gam蛋白的DNA序列，合成Reda，Red^和Gam蛋白的引物，以合成好的基因?yàn)槟０?，用?duì)應(yīng)的引物PCR獲得的產(chǎn)物Ndel和Xhol雙酶切后連接到用相同的酶酶切好的Pet30a載體上，轉(zhuǎn)化DH5a,測(cè)序獲得正確的陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒pet30a_Reda，pet30a-Red^ , pet30a_Gam ;然后這三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3 )，獲得表達(dá)菌株；(2) Reda，Red^和Gam蛋白的表達(dá)和純化步驟(I)獲得的表達(dá)菌株接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，離心收菌，進(jìn)行超聲破菌，離心收集上清；過(guò)附柱純化，陰離子柱純化，得到純化后的Red a , Red β和Gam蛋白。步驟(I)中，所述的引物序列為reda nde F:5’ -ccgCATATGACACCGGACATTATCC-3’ (SEQ ID NO. I),reda xho R ’-ccgCTCGAGTCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3’ (SEQ ID NO. 2)；redb nde F:5’ -ccgCATATGAGTACTGCACTCGCAAC-3’ (SEQ ID NO. 3),redb xho R :5’ -ccgCTCGAGTGCTGCCACCTTCTGCTC-3’ (SEQ ID NO. 4)；gam nde F :5’ -ccgCATATGGATATTAATACTG-3’ (SEQ ID NO. 5),gam xho R:5’ -ccgGATATTGATTCAGAGGTACTCGAG-3’ (SEQ ID NO. 6)。步驟(2)具體為將步驟(I)獲得的表達(dá)菌株I : 100接種到LB培養(yǎng)基中，37°C，250rmp震蕩培養(yǎng)到0D600=0. 6時(shí)，加入ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)將培養(yǎng)溫度降至20°C，低溫誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜，5k轉(zhuǎn)離心收菌；Ig菌體加入IOml緩沖液，超聲破菌；12k轉(zhuǎn)離心30min收集上清，過(guò)Ni柱純化；陰離子柱純化。步驟(2)中，所述過(guò)Ni柱純化具體包括如下步驟第一歩平衡用平衡緩沖液平衡柱子，直至pH達(dá)到8. O,紫外檢測(cè)讀數(shù)為5 10個(gè)柱體積，檢測(cè)調(diào)零后上樣；第二步上樣樣品應(yīng)保持澄清，如發(fā)現(xiàn)沉淀渾濁則需要離心，收集流出；第三步平衡上樣結(jié)束，用平衡緩沖液平衡層析柱，直到紫外檢測(cè)讀數(shù)回到基線或相對(duì)穩(wěn)定；第四步預(yù)洗用預(yù)洗緩沖液預(yù)洗，收集洗脫組分；第五步洗脫用洗脫液洗脫目標(biāo)蛋白，收集洗脫組分；第六步洗柱用洗柱緩沖液沖洗層析柱，收集洗脫組分。步驟(2)中，所述陰離子柱純化具體包括如下步驟第一歩平衡用緩沖液平衡柱子，直至pH達(dá)到8. O,紫外檢測(cè)讀數(shù)為5 10個(gè)柱體積，檢測(cè)調(diào)零后上樣；第二步上樣樣品應(yīng)保持澄清，如發(fā)現(xiàn)沉淀渾濁則需要離心，樣品中離子強(qiáng)度不宣 超過(guò)5ms/cm,收集流出；第三步平衡上樣結(jié)束，用平衡液平衡層析柱，直到紫外檢測(cè)讀數(shù)回到基線或相對(duì)穩(wěn)定;第四步洗脫用不同鹽濃度I)20mM Tris-HCl, pH8. 0,50mMNaCl ；2) 20mMTris-HCl, pH8. O,IOOmMNaCl ；3) 20mM Tris-HCl, pH8. 0,200mMNaCl ；4) 20mM Tris-HCl,pH8. 0,300mMNaCl ；5)20mM Tris-HCl，pH8. 0，500mMNaCl 分步洗脫，分步收集各個(gè)洗脫組分。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明將λ噬菌體Red重組系統(tǒng)的三種蛋白在體外按ー定濃度比例混合后，在特定的反應(yīng)體系下，該混合物就能在室溫25°C，20min內(nèi)完成克隆實(shí)驗(yàn)，克隆效率和陽(yáng)性率與其他試劑盒相當(dāng)。該混合物制備簡(jiǎn)單，成分明確，可以有效應(yīng)用于無(wú)縫克隆(seamless cloning)。與其他相同功能酶或酶混合物相比,本發(fā)明酶混合物及試劑盒在室溫(25°C )放置20分鐘就能達(dá)到很高的陽(yáng)性率，操作較其他試劑盒更方便(室溫，無(wú)需加熱及冰上放置等)，完成克隆實(shí)驗(yàn)的時(shí)間更短。


圖I是實(shí)施例2中15%的SDS-PAGE蛋白電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)■ (New York:Cold SpringHarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I. Red α，Red β和Gam蛋白表達(dá)菌株的獲得全基因合成Reda，Red^和Gam蛋白的DNA序列，序列參照NCBI中λ噬菌體(NC_001416)的基因序列。合成如下引物reda nde F:5’ -ccgCATATGACACCGGACATTATCC-3’ (SEQ ID NO. I),reda xho R ’-ccgCTCGAGTCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3’ (SEQ ID NO. 2)；redb nde F:5’ -ccgCATATGAGTACTGCACTCGCAAC-3’ (SEQ ID NO. 3),redb xho R :5’ -ccgCTCGAGTGCTGCCACCTTCTGCTC-3’ (SEQ ID NO. 4)；gam nde F :5’ -ccgCATATGGATATTAATACTG-3’ (SEQ ID NO. 5),gam xho R:5’ -ccgGATATTGATTCAGAGGTACTCGAG-3’ (SEQ ID NO. 6)；以合成好的基因?yàn)槟０?，用?duì)應(yīng)的引物PCR獲得的產(chǎn)物Ndel和Xhol雙酶切后連接到用相同的酶酶切好的Pet30a載體上，轉(zhuǎn)化DH5a，測(cè)序獲得正確的陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒pet30a-Red a , pet30a-Red β，pet30a-Gam。然后這三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3),獲得表達(dá)菌株。實(shí)施例2. Red α，Red β和Gam蛋白的表達(dá)和純化I.將實(shí)施例I獲得的菌種I :100接種到LB培養(yǎng)基中，37°C，250rmp震蕩培養(yǎng)到0D600=0. 6時(shí)，加入ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，為了提高蛋白可溶性表達(dá)的比例，同時(shí)將培養(yǎng)溫度降至20°C,低溫誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜(16h), 5k轉(zhuǎn)離心收菌。2.破菌菌體總量與破菌緩沖液(50mM Tis-Hcl,pH 8. 0,500mM NaCl) I 10 混合，即Ig菌體加入IOml緩沖液，超聲破菌。12k轉(zhuǎn)離心30min收集上清，過(guò)Ni柱純化。3. Ni 柱純化3. I 第一歩平衡用平衡緩沖液(20mM Tris-HCl,pH8. O, 500mMNaCl, 20mM 咪唑·)平衡柱子，緩沖液及樣品中不可有EDTA，Arg等物質(zhì)，直至pH達(dá)到8. O,紫外檢測(cè)讀數(shù)穩(wěn)定，一般為5 10個(gè)柱體積，檢測(cè)調(diào)零后可以上樣。3. 2第二步上樣樣品應(yīng)保持澄清，如發(fā)現(xiàn)沉淀渾濁則需要離心，收集流出。3. 3第三步平衡上樣結(jié)束，用平衡緩沖液平衡層析柱，直到紫外檢測(cè)讀數(shù)回到基線或相對(duì)穩(wěn)定。3. 4 第四步預(yù)洗用預(yù)洗緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8. 0，500mMNaCl，50mM 咪唑)預(yù)
洗，收集洗脫組分。3. 5 第五步洗脫用洗脫液(20mM Tris-HCl, pH8. O, 500mMNaCl, 200mM 咪唑)洗脫
目標(biāo)蛋白，收集洗脫組分。3. 6 第六步洗柱用洗柱緩沖液(20mM Tris-HCl, pH8. O, 500mMNaCl, 500mM 咪唑)
沖洗層析柱，收集洗脫組分。Red α，RedP和Gam蛋白會(huì)在第五步洗脫下來(lái),純度達(dá)到95%。4.為了去除蛋白中微量的但會(huì)影響后期實(shí)驗(yàn)的宿主殘留DNA或質(zhì)粒DNA，這部分樣品會(huì)再經(jīng)過(guò)陰離子柱純化(Q Sepharose Fast Flow)。陰離子柱純化具體步驟如下4. I第一歩平衡用緩沖液(20mM Tris-HCl, pH8. O)平衡柱子，直至pH達(dá)到8. 0，紫外檢測(cè)讀數(shù)穩(wěn)定，一般為5 10個(gè)柱體積，檢測(cè)調(diào)零后可以上樣。4. 2第二步上樣樣品應(yīng)保持澄清，如發(fā)現(xiàn)沉淀渾濁則需要離心，樣品中離子強(qiáng)度不宜超過(guò)5ms/cm,收集流出。4. 3第三步平衡上樣結(jié)束，用平衡液平衡層析柱，直到紫外檢測(cè)讀數(shù)回到基線或相對(duì)穩(wěn)定。4.4 第四步洗脫用不同鹽濃度(l)20mM Tris-HCl, pH8. 0,50mMNaCl ；2) 20mMTris-HCl, pH8. 0,IOOmMNaCl ；3) 20mM Tris-HCl, pH8. 0,200mMNaCl ；4) 20mM Tris-HCl,pH8. 0,300mMNaCl ；5) 20mM Tris-HCl, pH8. 0,500mMNaCl)分步洗脫，分步收集各個(gè)洗脫組分。5.因?yàn)闅埩鬌NA—般在高鹽組分中，所以收集低鹽洗脫的蛋白質(zhì)樣品供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。6.蛋白樣品加入相同體積甘油-80°C保存(Reda，Red^和Gam蛋白的電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖I)。
實(shí)施例3.蛋白殘留宿主DNA的影響鑒定取實(shí)施例2純化好的蛋白(lmg/ml) 10μ I轉(zhuǎn)化100μ I DH5a感受態(tài)(感受態(tài)效率>109cfu/ug)，42°C熱激后加入900μ I無(wú)抗SOC培養(yǎng)基，復(fù)蘇Ih后，5k離心5min，去掉800 μ I上清，剩余200 μ I混勻后涂在kana抗性的LB板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，計(jì)算板上克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，板上沒(méi)有克隆長(zhǎng)出，說(shuō)明純化好的蛋白沒(méi)有DNA污染，可以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例4載體pucl9經(jīng)EcoRl/Sall雙酶切后割膠回收，回收后線性化載體濃度為(20ng/μ I)。目的片段經(jīng)PCR獲得，長(zhǎng)度為lkb，膠回收后濃度為(50ng/y I)兩端與線性化pucl9載體有15bp的同源序列。載體與插入片段的摩爾數(shù)比為I : 3。反應(yīng)體系為20μ1，各組分含量分別如表I所不
表I
^~體積(μ )puc 19( EcoR I/Sal I) Ρ0τ §/μ1)6
R的片段PCR產(chǎn)物(50ng^l)3
^IOx緩沖液2
Γ Tris-HcKPh7.5@25 °C) Γ 300 mM MgC12IOOmM
ATPIOmM
DTT7 mM
BSA0.25%
,混合物^i
Reda3ng/pl
Redp腦 ng/μ
Gam150η§/μ1
去離子水^g混勻后，室溫(25°C)放置20分鐘后，取10 μ I加入100 μ I DH5a感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)效率>5X106cfU/y g)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化方法等同常規(guī)方法冰上放置30分鐘后，42°C熱激I分鐘后再在冰上放置3分鐘，加入900 μ I SOC培養(yǎng)基37°C孵育45分鐘，取100 μ I菌液均勻涂在含有氨芐抗性、加有IPTG和x-gal的LB平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。第二天，數(shù)板上白斑克隆數(shù)，同時(shí)菌落PCR進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。同時(shí)對(duì)其他公司無(wú)縫克隆試劑盒按其說(shuō)明書一起進(jìn)行反應(yīng)，同樣數(shù)白斑克隆和菌落PCR，比較效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示表權(quán)利要求
1.一種用于快速基因克隆的酶混合物，其特征在于，該酶混合物由Reda蛋白，Redii蛋白和Gam蛋白組成，在該酶混合物中，三種蛋白的混合比例如下Reda蛋白的濃度為3ng/ μ I ；Red β 蛋白的濃度為 150ng/ μ l_1500ng/ μ I ；Gam 蛋白的濃度為 3ng/ μ l_300ng/μ I。
2.一種含有權(quán)利要求I所述酶混合物的試劑盒。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括如下反應(yīng)緩沖液100-500mM 的 Tris-Hcl，IOOmM 的 MgCl2, IOmM 的 ATP, 5-1OmM 的 DTT,0-0. 5%mM 的 BSA。
4.一種如權(quán)利要求I所述的用于快速基因克隆的酶混合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)Reda,Red^和Gam蛋白表達(dá)菌株的獲得全基因合成Red a , Red β和Gam蛋白的DNA序列，合成Reda ,Red^和Gam蛋白的引物，以合成好的基因?yàn)槟０?，用?duì)應(yīng)的引物PCR獲得的產(chǎn)物Ndel和Xhol雙酶切后連接到用相同的酶酶切好的Pet30a載體上，轉(zhuǎn)化DH5a，測(cè)序獲得正確的陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒pet30a_Reda，pet30a-Red^ , pet30a_Gam ;然后這三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3 )，獲得表達(dá)菌株； (2)Reda，Red^和Gam蛋白的表達(dá)和純化步驟(I)獲得的表達(dá)菌株接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，離心收菌，進(jìn)行超聲破菌，離心收集上清；過(guò)附柱純化，陰離子柱純化，得到純化后的Red a，Red β和Gam蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的引物序列為 reda nde F :5’ -ccgCATATGACACCGGACATTATCC-3’ (SEQ ID NO. I),reda xho R: ’ -ccgCTCGAGTCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3’ (SEQ ID NO. 2)；redb nde F :5’ -ccgCATATGAGTACTGCACTCGCAAC-3’ (SEQ ID NO. 3),redb xho R :5’ -ccgCTCGAGTGCTGCCACCTTCTGCTC-3’ (SEQ ID NO. 4)；gam nde F :5’ -ccgCATATGGATATTAATACTG-3’ (SEQ ID NO. 5),gam xho R :5’ -ccgGATATTGATTCAGAGGTACTCGAG-3’ (SEQ ID NO. 6)。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)具體為將步驟(I)獲得的表達(dá)菌株I :100接種到LB培養(yǎng)基中，37°C，250rmp震蕩培養(yǎng)到0D600=0. 6時(shí)，加入ImMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)將培養(yǎng)溫度降至20°C，低溫誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜，5k轉(zhuǎn)離心收菌；Ig菌體加入IOml緩沖液，超聲破菌；12k轉(zhuǎn)離心30min收集上清，過(guò)Ni柱純化；陰離子柱純化。
7.如權(quán)利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述過(guò)Ni柱純化具體包括如下步驟 第一步平衡用平衡緩沖液平衡柱子，直至PH達(dá)到8. 0，紫外檢測(cè)讀數(shù)為5 10個(gè)柱體積，檢測(cè)調(diào)零后上樣； 第二步上樣樣品應(yīng)保持澄清，如發(fā)現(xiàn)沉淀渾濁則需要離心，收集流出； 第三步平衡上樣結(jié)束，用平衡緩沖液平衡層析柱，直到紫外檢測(cè)讀數(shù)回到基線或相對(duì)穩(wěn)定; 第四步預(yù)洗用預(yù)洗緩沖液預(yù)洗，收集洗脫組分； 第五步洗脫用洗脫液洗脫目標(biāo)蛋白，收集洗脫組分； 第六步洗柱用洗柱緩沖液沖洗層析柱，收集洗脫組分。
8.如權(quán)利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述陰離子柱純化具體包括如下步驟 第一步平衡用緩沖液平衡柱子，直至PH達(dá)到8. 0，紫外檢測(cè)讀數(shù)為5 10個(gè)柱體積，檢測(cè)調(diào)零后上樣； 第二步上樣樣品應(yīng)保持澄清，如發(fā)現(xiàn)沉淀渾濁則需要離心，樣品中離子強(qiáng)度不宜超過(guò)5ms/cm,收集流出； 第三步平衡上樣結(jié)束，用平衡液平衡層析柱，直到紫外檢測(cè)讀數(shù)回到基線或相對(duì)穩(wěn)定; 第四步洗脫用不同鹽濃度1) 20mM Tris-HCl, ρΗ8· 0,50mMNaCl ；2) 20mM Tris-HCl,pH8. 0,IOOmMNaCl ；3) 20mM Tris-HCl, pH8. 0,200mMNaCl ；4) 20mM Tris-HCl, pH8. 0， 300mMNaCl ；5) 20mM Tris-HCl, pH8. 0,500mMNaCl分步洗脫，分步收集各個(gè)洗脫組分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于快速基因克隆的酶混合物，該酶混合物由Redα蛋白，Redβ蛋白和Gam蛋白組成，在該酶混合物中，三種蛋白的混合比例如下Redα蛋白的濃度為3ng/μl；Redβ蛋白的濃度為150ng/μl-1500ng/μl；Gam蛋白的濃度為3ng/μl-300ng/μl。此外，本發(fā)明還公開了該酶混合物的制備方法。另外，本發(fā)明還公開了含有該酶混合物的試劑盒。本發(fā)明的酶混合物及試劑盒可有效應(yīng)用于無(wú)縫克隆(seamless cloning)，與其他相同功能酶或酶混合物相比,在室溫放置20分鐘就能達(dá)到很高的陽(yáng)性率，操作較其他試劑盒更方便(室溫，無(wú)需加熱及冰上放置等)，完成克隆實(shí)驗(yàn)的時(shí)間更短。
文檔編號(hào)C12N9/22GK102676470SQ20121017028
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者林霞, 王娟, 蔡麗君, 許志戎 申請(qǐng)人:吳江近岸蛋白質(zhì)科技有限公司