專利名稱：轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)樣品、其建立方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的標(biāo)準(zhǔn)樣品制備、其建立方法及其在檢測轉(zhuǎn) 基因玉米MIR162中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米是世界上重要的糧食作物之一，其單位面積產(chǎn)量位居榜首。世界范圍內(nèi)玉米害蟲高達(dá)350多種，其中以鱗翅目的玉米螟分布最廣、危害最重，是世界性的重要玉米害蟲，其嚴(yán)重影響著玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。近十多年來，轉(zhuǎn)基因植物培育取得突破，推出了一批新品種，在改善農(nóng)作物生產(chǎn)中發(fā)揮了明顯的作用，也顯露出巨大的潛力。然而，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米的安全性存在著很多的爭論。面對(duì)生物基因工程技術(shù)對(duì)我國經(jīng)濟(jì)利益帶來的沖擊和國外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)生態(tài)環(huán)境和消費(fèi)者可能帶來的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行檢測具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。2009年，我國已經(jīng)解除了對(duì)玉米進(jìn)口的限制，大批量的玉米已經(jīng)涌入中國。這勢必對(duì)我國的農(nóng)業(yè)安全帶來沖擊。開展轉(zhuǎn)基因成分檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制在保證測試結(jié)果的可比性和溯源性，保障食品安全，解決貿(mào)易爭端，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展等方面均具有重要的意義。在所有的商品化的轉(zhuǎn)基因作物中，轉(zhuǎn)基因玉米的品系最多，共有28個(gè)品系。我國尚未批準(zhǔn)進(jìn)境的轉(zhuǎn)基因玉米品系有7種MIR162品系，MON 89034品系，DBT418品系，LY038品系，ES3272品系，BtlO品系，DP98140品系。2010年我國深圳等口岸已陸續(xù)截獲違禁品系，MIR162品系就是其中的一種。轉(zhuǎn)基因玉米MIR162是先正達(dá)種苗公司的產(chǎn)品，在美國被批準(zhǔn)食用的時(shí)間為1997年，在加拿大被批準(zhǔn)食用的時(shí)間為1997年，在澳大利亞被批準(zhǔn)食用的時(shí)間為2002年。轉(zhuǎn)基因玉米MIR162所含的外源基因有I)抗鱗翅目昆蟲基因vip3Aa20，2)選擇性標(biāo)記基因pmi。國內(nèi)很多檢測機(jī)構(gòu)開始大量地開展玉米中轉(zhuǎn)基因成分的檢測，但國內(nèi)外市場卻始終沒有轉(zhuǎn)基因MIR162品系的標(biāo)準(zhǔn)樣品。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于國內(nèi)轉(zhuǎn)基因MIR162品系標(biāo)準(zhǔn)樣品緊缺的狀況，我們研制了轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系標(biāo)準(zhǔn)樣品，本項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備完成，對(duì)全面深入的研究解決轉(zhuǎn)基因成分檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)和穩(wěn)定性保證技術(shù)，積極開展我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制，添補(bǔ)該測量領(lǐng)域的空白，具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系簡介轉(zhuǎn)基因玉米MIR162所含的外源基因有1)抗鱗翅目昆蟲基因vip3Aa20，2)選擇性標(biāo)記基因pmi。質(zhì)粒圖譜如圖I :本發(fā)明通過以下技術(shù)路線實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的一方面在于轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其具體步驟如下(I)將原料研磨成粉末，過100目篩，將過篩后的粉末收集，向粉末中加入等質(zhì)量的水，攪拌均勻后，靜置lh，棄上清，將沉淀物制備成凍干粉；(2)以轉(zhuǎn)基因玉米MIR162為原料，按照步驟(I)所述方法制備的凍干粉為添加原料；(3)以非轉(zhuǎn)基因玉米為原料，按照步驟(I)所述方法制備的凍干粉為基質(zhì)原料；(4)將步驟(2)制備的添加原料與步驟(3)制備 的基質(zhì)原料按I : 100的重量比例混合，向混合粉末中加入等質(zhì)量的水，攪拌均勻后，靜置lh，棄上清，將沉淀物制備成凍干粉并分裝，0°C 4°C貯存；上述步驟(I) (4)中任一項(xiàng)所述的凍干，其具體步驟如下冷凍干燥程序①樣品預(yù)凍先把樣品在_80°C冷凍2h ；②冷凍過程關(guān)好冰凍干燥機(jī)的干燥室門，開始干燥室制冷；干燥室溫度降至-35°C時(shí)，開始冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至_40°C時(shí)，將步驟①處理的樣品迅速放入干燥室內(nèi)，關(guān)好干燥室門；啟動(dòng)真空泵開始抽真空；當(dāng)真空度降至O. 5T0rr時(shí)，結(jié)束冷凍過程；③樣品干燥干燥室的溫度設(shè)置為15°C，當(dāng)真空度降至O. ITorr時(shí)，樣品已干燥好;④關(guān)閉真空泵，使干燥室與外界大氣相通，待內(nèi)外氣壓平衡后，打開干燥室門，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋?；旌戏蹱顦悠钒匆陨侠鋬龈稍锍绦蛑瞥蓛龈煞?，即轉(zhuǎn)基因玉米粉狀標(biāo)準(zhǔn)樣品；分裝后的樣品加貼唯一性標(biāo)識(shí)，放置于_20°C中避光貯存。本發(fā)明的另一方面在于公開一種轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的Real-Time PCR檢測試劑盒，包括轉(zhuǎn)基因玉米MIR162檢測基因和陽性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，其中，陽性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品是利用上述方法制備的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)樣品；轉(zhuǎn)基因玉米MIR162檢測基因，包括
系鑒y w的檢測 物和探針序列:__
ι1·； _ I 物 5’-CACCTTCAGCAACCCGAACTA-3”__SEQ ID NO I
Li. 1· 彌 S^GCTTAGCCTCCACGATCATCTT-3'__SEQ ID NO: I
m\- S^-FAM- GTCCTCG丁CGCTGCCCTTCACCTTAMRA-3’__SEQ ID MO·· 3
zSSIIb坫W的檢測蘭I物IlIMH f列:__
Il-；! ■]引物.V-CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C'V__SEQ IDNO= 4
反 I 物 5’-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3’__SEQIDMCh 5
探針 S^FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAATGC A-TAMRA-3* SEQ ID NO 6其中FAM為6-carboxyfluorescein, TAMRA為 6_carboxytetramethylrhodamine。本發(fā)明中，上述檢測試劑盒中，采用了開放式的描述形式，其含義是均未限定檢測試劑盒中的其他緩沖液等成分，因其可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)確定，并通過配置或商業(yè)途徑購買獲得，檢測試劑盒的使用方法和檢測條件，技術(shù)人員可以依據(jù)實(shí)施例中所列條件做參考依據(jù)進(jìn)行調(diào)整。這些關(guān)于制劑方式和方法的選擇，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從現(xiàn)有技術(shù)中得到充分的啟示，本發(fā)明不再贅述。試劑盒的使用方法是以待測樣品的基因組為模板，利用轉(zhuǎn)基因玉米MIR162檢測基因，經(jīng)過Real-Time PCR反 應(yīng)，結(jié)束后確認(rèn)Real-Time PCR的擴(kuò)增曲線，先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后可以利用公式計(jì)算待測樣品中轉(zhuǎn)基因成分的含量。或者通過PCR特異性的引物和探針序列，擴(kuò)增待測樣品與陽性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，并將擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品種，具體制作和檢測方法參照實(shí)施例。上文所描述的使用方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方式，以此為例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的公知常識(shí)進(jìn)行更多拓展。本發(fā)明的創(chuàng)新特征是本項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備完成及其制備方法的建立，對(duì)解決轉(zhuǎn)基因MIR162品系檢測分子標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)和穩(wěn)定性保證技術(shù)，開展我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制，添補(bǔ)該測量領(lǐng)域的空白，具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義及應(yīng)用價(jià)值。


圖I :轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的質(zhì)粒圖譜；所含的外源基因有1)抗鱗翅目昆蟲基因vip3Aa20, 2)選擇性標(biāo)記基因pmi。
圖2 :轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)樣品制備、檢測工藝流程。
具體實(shí)施例方式下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。制備轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系標(biāo)準(zhǔn)樣品的原料購于AOCS ；研缽，100目標(biāo)準(zhǔn)篩，DNA提取試劑和PCR反應(yīng)試劑均購于寶生物工程(大連)有限公司；DNA提取試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司(貨號(hào)D9093)；TaqMan Universal Master Mix :購于 ABI 公司；引物和探針寶生物工程(大連)有限公司合成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI 7500型；核酸蛋白分析儀日本日立公司。實(shí)施例I轉(zhuǎn)基因玉米粉狀標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟(a)取原料放在研缽中，用研棒攪拌、研磨成粉末。將粉末過100目標(biāo)準(zhǔn)篩。將過篩后的粉末收集于磨口瓶中，密封，備用。(b)將粉末加約一倍的水，使用攪拌機(jī)攪拌30min使其均勻后，靜置lh，棄上清，將漿糊放置于中試凍干機(jī)內(nèi)，按如下凍干程序，去除水分，制備成凍干粉。(c)轉(zhuǎn)基因玉米MIR162凍干粉作為添加原料；非轉(zhuǎn)基因玉米凍干粉作為基質(zhì)原料。兩種原料制備程序和凍干程序完全相同，但分別獨(dú)立、隔離制備完成。(d)在恒溫恒濕、無菌操作間中，稱取5. Og轉(zhuǎn)基因玉米MIR162粉添加原料和495. Og非轉(zhuǎn)基因玉米粉基質(zhì)原料，按1%的添加比例混合，將混合粉末加約一倍的水，使用攪拌機(jī)攪拌30min，混勻上述混合樣品，均勻后，靜置lh，棄上清；(e)將混合漿糊樣品放置于中試凍干機(jī)中，按照凍干程序，進(jìn)行低溫真空冷凍干燥，制備成混合凍干粉；(f)將混合凍干粉樣品分裝于經(jīng)160°C干熱處理2h的潔凈的7mL棕色玻璃瓶中封蓋密封，每瓶內(nèi)裝混合凍干粉樣品lg。(g)獲500瓶I. 0%添加含量的轉(zhuǎn)基因玉米粉MIR162標(biāo)準(zhǔn)樣品。瓶裝后的樣品加貼唯一性標(biāo)識(shí)，放置于陰涼干燥處0°c 4°C貯存。其中，步驟(a) (h)中所述的凍干程序，其具體步驟如下 (I)樣品預(yù)凍先把混合粉狀樣品溶液在_80°C低溫冷凍2h。(2)冷凍過程關(guān)好冰凍干燥機(jī)的干燥室門，開始干燥室制冷；干燥室溫度降至_35°C時(shí)，開始冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至_40°C時(shí)，將預(yù)凍的標(biāo)準(zhǔn)品迅速放入干燥室內(nèi)，關(guān)好干燥室門；啟動(dòng)真空泵開始抽真空，真空表顯示值開始下降；待真空度降至O. 5Torr時(shí)，結(jié)束冷凍過程。(3)樣品干燥對(duì)干燥室加熱，提高樣品干燥速度；干燥室的溫度設(shè)置為15°C。當(dāng)真空度降至O. ITorr或更低時(shí),表示樣品已干燥好。(4)關(guān)閉真空泵，使干燥室與外界大氣相通，待內(nèi)外氣壓平衡后，打開干燥室門，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋。混合粉狀樣品按以上冷凍干燥程序制成凍干粉，即轉(zhuǎn)基因玉米MIR162粉狀標(biāo)準(zhǔn)樣品；分裝后的樣品加貼唯一性標(biāo)識(shí)，放置于_20°C中避光貯存。實(shí)施例2定值方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法《轉(zhuǎn)基因成分檢測玉米檢測方法》SN/T 1196-2011和GB/T19495. 5-2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法》進(jìn)行測定轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系和定值。檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系特異性及玉米內(nèi)源zSSIIb基因的引物序列和探針序列見下表I。表I檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系特異性基因的引物序列和探針序列
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)樣品，其特征在于，制備方法包括 (1)將原料研磨成粉末，過100目篩，將過篩后的粉末收集，向粉末中加入等質(zhì)量的水，攪拌均勻后，靜置lh，棄上清，將沉淀物制備成凍干粉； (2)以轉(zhuǎn)基因玉米MIR162為原料，按照步驟(I)所述方法制備凍干粉； (3)以非轉(zhuǎn)基因玉米為原料，按照步驟(I)所述方法制備凍干粉； (4)將步驟(2)制備的凍干粉與步驟(3)制備的凍干粉按I: 100的重量比例混合，向混合粉末中加入等質(zhì)量的水，攪拌均勻后，靜置lh，棄上清，將沉淀物制備成凍干粉并分裝，(TC 4°C貯存； 上述步驟(I) (4)中任一項(xiàng)所述的凍干粉，其具體制備步驟包括 ①樣品預(yù)凍先把樣品在_80°C冷凍2h； ②冷凍過程關(guān)好冰凍干燥機(jī)的干燥室門，開始干燥室制冷；干燥室溫度降至_35°C時(shí)，開始冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至_40°C時(shí)，將步驟①處理的樣品迅速放入干燥室內(nèi)，關(guān)好干燥室門；啟動(dòng)真空泵開始抽真空；當(dāng)真空度降至O. 5Torr時(shí)，結(jié)束冷凍過程； ③樣品干燥干燥室的溫度設(shè)置為15°C，當(dāng)真空度降至O.ITorr時(shí)，樣品已干燥好； ④關(guān)閉真空泵，使干燥室與外界大氣相通，待內(nèi)外氣壓平衡后，打開干燥室門，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋。
2.—種轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的Real-Time PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括轉(zhuǎn)基因玉米MIR162檢測基因和陽性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品 陽性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品是權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)樣品； 轉(zhuǎn)基因玉米MIR162檢測基因，包括 品系鑒定基因的檢測引物和探針序列 正向引物SEQIDN0:1 反向引物SEQ ID NO :2 探針SEQ ID NO 3 zSSIIb基因的檢測引物和探針序列 正向引物SEQ ID NO :4 反向引物SEQ ID NO :5 探針SEQ ID NO :6。
全文摘要
本發(fā)明公開一種轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的標(biāo)準(zhǔn)樣品制備、其建立方法及其在檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162中的應(yīng)用，分別以轉(zhuǎn)基因玉米MIR162或非轉(zhuǎn)基因玉米為原料，將原料研磨、過篩、加水，攪拌、靜置、將沉淀物制備成凍干粉；再將二者以科學(xué)的比例混合，并重復(fù)“加水，攪拌、靜置、將沉淀物制備成凍干粉”的過程，分裝,0℃~4℃貯存；通過上述方法獲得轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的標(biāo)準(zhǔn)樣品，也可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的Real-Time PCR檢測試劑盒。這對(duì)全面深入的研究解決轉(zhuǎn)基因成分檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)和穩(wěn)定性保證技術(shù)，積極開展我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制，添補(bǔ)該測量領(lǐng)域的空白，具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102719534SQ20121017212
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者于兵, 徐君怡, 曹際娟, 趙昕 申請(qǐng)人:于兵, 徐君怡, 曹際娟, 趙昕