專(zhuān)利名稱(chēng)：基于多重pcr的水中13種病原微生物同步快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境科學(xué)與工程、環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外常用于檢測(cè)和鑒定致病微生物的方法主要有傳統(tǒng)生化鑒定法、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、常規(guī)PCR等一些簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法。傳統(tǒng)生化鑒定法(如分離培養(yǎng)、生化鑒定等)應(yīng)用最廣泛，是《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)(GB/T 4789-2003 )等國(guó)標(biāo)檢測(cè)程序，該方法能夠得到樣品中細(xì)菌數(shù)量和特性等方面的定性及定量結(jié)果，由于操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)且準(zhǔn)確性好而被廣泛采用，但是大都需要經(jīng)過(guò)前增菌、增菌、選擇性平板分離、生物化學(xué)試驗(yàn)和血清學(xué)分型鑒定4個(gè)步驟，整個(gè)過(guò)程通常需要3^7天，檢測(cè)周期長(zhǎng)，并且要求所要檢測(cè)的細(xì)菌增殖為可見(jiàn)菌落，另外，培養(yǎng)基制備、細(xì)菌培 養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)和生化指標(biāo)的檢測(cè)都增加了實(shí)驗(yàn)室的工作量，并且檢測(cè)靈敏度低，不能實(shí)現(xiàn)有效的實(shí)時(shí)快速監(jiān)測(cè)和防控。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要是采用酶聯(lián)免疫分析(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay, ELISA), ELISA是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)地結(jié)合起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)，既可測(cè)抗原，也可測(cè)抗體，可進(jìn)行定性和定量測(cè)定，基本原理是預(yù)先結(jié)合在固相載體上的抗體或抗原分子與樣品中的抗原或抗體分子在一定條件下進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)。該方法可檢測(cè)沙門(mén)氏菌、軍團(tuán)菌、大腸桿菌0157等致病微生物。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)單、方便，較傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)迅速，但存在交叉反應(yīng)比較嚴(yán)重、假陽(yáng)性多、靈敏度偏低等不足之處。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Ploymerase Chain Reaction, PCR)是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，其基本原理是在體外適宜的條件(如鎂離子濃度)和Taq DNA聚合酶的作用下，利用游離的脫氧核糖核苷酸(dNTP)，以目標(biāo)基因組DNA上正、反相兩引物間的特定的雙鏈DNA片段(或稱(chēng)靶DNA)進(jìn)行高效擴(kuò)增，故又稱(chēng)基因體外擴(kuò)增法。一般的PCR需要經(jīng)過(guò)預(yù)變性，變性、退火、延伸的25 35次循環(huán)，可將靶DNA序列擴(kuò)增近百萬(wàn)倍，經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰氨凝膠電泳和染色劑如溴化乙錠(EB)染色后在紫外光下觀測(cè)到相應(yīng)的條帶。常規(guī)PCR雖為一種特異靈敏、簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)技術(shù)，但該方法需要較長(zhǎng)時(shí)間的樣品純化處理過(guò)程，且一旦有極少量外源性DNA污染，就可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增，各種實(shí)驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或非特異性產(chǎn)物；引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇不當(dāng)?shù)榷伎赡芙档推潇`敏度和特異性；同時(shí)，一次一般只能檢測(cè)一種致病微生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)和鑒定致病微生物方法存在的以上不足，提出一種基于多重PCR的水中13種病原微生物同步快速檢測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種基于多重PCR的水中13種病原微生物同步快速檢測(cè)方法，采用多重PCR —次性同時(shí)擴(kuò)增13種致病微生物的特異性基因片段大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、嗜肺軍團(tuán)菌、腸炎沙門(mén)菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、幽門(mén)螺旋桿菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌和鼠疫耶爾森菌，再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。所述方法具體包括以下步驟
(1)水樣處理
采集水樣，用無(wú)菌塑料瓶封裝，室溫靜置，取上清液加入濃縮儀進(jìn)行濃縮集菌(濃縮儀采用Milliflex Plus濃縮儀)，然后抽干濾膜，取出放入離心管內(nèi)，剪成細(xì)末狀；(2)DNA模板提取
采用E. Z. N. A. Bacterial DNA Kit (D3350-01)試劑盒或者與之有同等作用的其他商業(yè)化DNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，取IOuL樣本DNA進(jìn)行下一步程序；
(3)多重PCR擴(kuò)增目的片段
采用15 ii L的PCR體系，包括10 X PCR Taq酶緩沖液I. 0 — 2. Oii L，濃度為2. 5 mmol/L dNTP 0. I - 0.3 UL,濃度為10 - 20 u mo I/L的各種(即13種病原微生物)引物混合液0. 4 - 0. 8 u L, 50 X T-Taq DNA 聚合酶 0. I — 0. 5 y L，DNA 模板 0. 5 — I. 5 y L，雙蒸水補(bǔ)至15u L ；
PCR循環(huán)參數(shù)95°C預(yù)變性3 min，接著作30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30s，68°C退火并延伸30s ;循環(huán)結(jié)束后68°C延伸5 min ;4°C保存?zhèn)溆茫?br> (4)電泳檢測(cè)
對(duì)三組多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察，第一組產(chǎn)物的電泳圖中含有5個(gè)不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物片段，分別為志賀菌113bp ;金黃色葡萄球菌283bp ;腸出血性大腸桿菌0157:H7 366bp ;大腸埃希菌471bp ;腸炎沙門(mén)氏菌679bp ;第二組產(chǎn)物的電泳圖中含有4個(gè)不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物片段，分別為單核細(xì)胞增生李斯特菌155bp ;嗜肺軍團(tuán)菌252bp，肺炎克雷伯菌319bp ;幽門(mén)螺旋桿菌364bp ;第三組產(chǎn)物的電泳圖中含有5個(gè)不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物片段，分別為結(jié)合分枝桿菌135bp ;鼠疫耶爾森菌184bp ;炭疽芽孢桿菌275bp ;霍亂弧菌465bp ；16S:370bp。其中16S做為檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性質(zhì)控。發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果
本檢測(cè)方法采用的多重PCR技術(shù)，具有較強(qiáng)的特異性、靈敏度和實(shí)際檢測(cè)的適用性，本方法多重基因組DNA檢測(cè)靈敏度為2 X 10_2 ng/yL。用常規(guī)的方法檢測(cè)上述13種致病菌，需要的時(shí)間至少為兩天，而對(duì)于李斯特菌的常規(guī)檢測(cè)方法全過(guò)程至少需要四至七天，本檢測(cè)方法可將整個(gè)檢測(cè)時(shí)間縮短至8小時(shí)以?xún)?nèi)，比現(xiàn)有的細(xì)菌學(xué)診斷更快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用，并且同時(shí)檢測(cè)多種致病菌。通常水體中的致病微生物含量相對(duì)較少，尤其是水源水體，有時(shí)部分致病微生物處于亞致死狀態(tài)，這就需要一個(gè)前增菌過(guò)程以達(dá)到系統(tǒng)的檢測(cè)限。本檢測(cè)方法采用Milliflex Plus微生物過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)水樣進(jìn)彳丁如期濃縮集囷后，就可以快速地完成微量致病微生物的快速檢測(cè)。通過(guò)對(duì)水樣的濃縮集菌，多重PCR對(duì)致病菌的檢出率達(dá)到103cfu/mL，較原來(lái)提高了 100倍。因此，本檢測(cè)方法具備重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度及特異性高、操作簡(jiǎn)單、高通量及快速檢測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn)，為水體致病菌檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供了良好的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。


圖I同時(shí)進(jìn)行13中病原微生物檢測(cè)的電泳 圖2腸炎沙門(mén)氏菌菌液梯度稀釋提取DNA的多重PCR結(jié)果；
圖3腸炎沙門(mén)氏菌菌液梯度稀釋?zhuān)瑵饪s富集后提取DNA的多重PCR結(jié)果。
具體實(shí)施例方式I、檢測(cè)對(duì)象
本方法主要針對(duì)水中可能存在的和突發(fā)公共事件發(fā)生時(shí)可能進(jìn)入水中的13種致病微生物，分別是大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、嗜肺軍團(tuán)菌、腸炎沙門(mén)菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、幽門(mén)螺旋桿菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌。2、檢測(cè)過(guò)程
2.I水樣處理
采集適量水樣，用無(wú)菌塑料瓶封裝，當(dāng)日送往實(shí)驗(yàn)室。室溫靜置Ihlh后，取上清液加AMilliflex Plus微生物過(guò)濾系統(tǒng)濾清漏斗裝置的漏斗內(nèi)。開(kāi)啟濃縮儀進(jìn)行濃縮集菌，時(shí)間3分鐘。濃縮完成后，抽干濾膜，將整個(gè)漏斗開(kāi)口放入4°C冰柜，30mirT60min后待濾膜表面完全干燥后取出，用鑷子將含有細(xì)菌的濾膜從濃縮儀濾瓶?jī)?nèi)取下，放入1.5mL離心管內(nèi)，用已經(jīng)滅菌過(guò)的手術(shù)剪剪成細(xì)末狀。采用E. Z. N. A. Bacterial DNA Kit (D3350-01)試劑盒進(jìn)行核酸提取，按試劑盒說(shuō)明書(shū)所述的試劑量的3倍進(jìn)行加樣和提取，DNA最后溶解于50uL ddH20中。取每份水樣中提取的核酸IOyL分別進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，觀察核酸提取質(zhì)量；取IOuL樣本DNA進(jìn)行下一步程序。2. 2多重PCR擴(kuò)增目的片段
采用15 ii L的PCR體系，包括10XPCR Taq酶緩沖液I. 5 ii L，濃度為2. 5 mmol/L dNTP
0.L，濃度為20iimol/L的各種(13種致病微生物)引物混合液0. 6 y L (每對(duì)引物各加入
0.6u L),50 XT-Taq DNA 聚合酶 0. 2 y L，DNA 模板 I. 0 y L，ddH20 11. 5u L0 PCR 循環(huán)參數(shù):95°C預(yù)變性3 min,接著作30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30s，68°C退火并延伸30s ;循環(huán)結(jié)束后68°C延伸5 min ;4°C保存?zhèn)溆谩?.3樣本檢測(cè)
所有多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物都要經(jīng)過(guò)3%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。從每個(gè)多重PCR樣品中取出2iiL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入5 ii L 2 X Loading Buffer上樣緩沖液混合均勻，用I X TAE作為緩沖溶液，150 V電壓下電泳20 min，通過(guò)紫外成像系統(tǒng)拍攝電泳圖，參見(jiàn)圖1，從左至右
1.金葡菌，2.0157菌,3.志賀菌,4.大腸桿菌,5.沙門(mén)菌,6.第I組多重,7. Marker, 8.軍團(tuán)菌，9.克雷伯菌，10.李斯特菌，11.幽門(mén)菌，12.第2組多重，13.結(jié)核，14.霍亂，15.炭疽，16.鼠疫，17. 16S，18.第3組多重，19. Marker。根據(jù)電泳圖上產(chǎn)物條帶大小，判斷樣本中所含有的微生物種類(lèi)。3實(shí)施例
以腸炎沙門(mén)氏菌為例，標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液經(jīng)10倍梯度稀釋后，提取DNA進(jìn)行多重PCR，所 得結(jié)果如圖2所示。電泳結(jié)果顯示，在I泳道至5泳道均出現(xiàn)明顯的條帶，6泳道以后沒(méi)有條帶出現(xiàn)，說(shuō)明該方法可檢測(cè)細(xì)菌的量為IO5 cfu/mL。圖中每個(gè)泳道的細(xì)菌量分別為A: IO9cfu/mL; B: IO8 cfu/mL; C: IO7 cfu/mL; D: IO6 cfu/mL; E: IO5 cfu/mL; F: IO4 cfu/mL; G: IO3 cfu/mL; H: IO2 cfu/mL; I: water; M: Marker。為提高檢測(cè)水平，通過(guò)Milliflex Plus濃縮儀對(duì)稀釋后的菌液進(jìn)行濃縮富集后再提取DNA,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。由電泳圖可以看出，使用Milliflex Plus濃縮儀濃縮集菌后，可以顯著提高多重PCR的檢測(cè)水平，可檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌的量達(dá)到IO3 cfu/mL。圖中每個(gè)泳道的菌液濃度分別為M: Marker ;A: IO7 cfu/mL; B: IO6 cfu/mL; C: IO5 cfu/mL; D:IO4 cfu/mL; E: IO3 cfu/mL; F: IO2 cfu/mL。本發(fā)明中，13種細(xì)菌的引物和探針序列見(jiàn)《水體中致病菌快速檢測(cè)的 基因芯片技術(shù)研究》(解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010年第9期，1117-1120)
用于檢測(cè)13種細(xì)菌的引物和探針序列
權(quán)利要求
1.一種基于多重PCR的水中13種病原微生物同步快速檢測(cè)方法，所述方法是采用多重PCR同時(shí)擴(kuò)增13種病原微生物的特異性基因片段大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、嗜肺軍團(tuán)菌、腸炎沙門(mén)菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、幽門(mén)螺旋桿菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌和鼠疫耶爾森菌，再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)13種病原微生物同步快速檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法具體包括以下步驟 (1)水樣處理 采集水樣，用無(wú)菌塑料瓶封裝，室溫靜置，取上清液加入濃縮儀進(jìn)行濃縮集菌，然后抽干濾膜，取出放入離心管內(nèi)，剪成細(xì)末狀；(2)DNA模板提取 采用E. Z. N. A. Bacterial DNA Kit (D3350-01)試劑盒或者與之有同等作用的其他商業(yè)化DNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，取IOuL樣本DNA進(jìn)行下一步程序； (3)多重PCR擴(kuò)增目的片段 采用15 ii L的PCR體系，包括10 X PCR Taq酶緩沖液I. 0 — 2. Oii L，濃度為2. 5 mmol/L 的 dNTP 0. I — 0. L，濃度為 10 — 20iimol/L 的引物各 0. 4 — 0. 8 u L, 50 X T-Taq DNA聚合酶0. I - 0. L，DNA模板0. 5 — I. 5 y L，雙蒸水補(bǔ)至15 y L ;多重PCR循環(huán)參數(shù)95°C預(yù)變性3 min,接著作30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30s，68°C退火并延伸30s ;循環(huán)結(jié)束后68°C延伸5 min ;4°C保存?zhèn)溆茫?3種病原微生物的檢測(cè)分為三組多重PCR進(jìn)行；上述引物是指權(quán)利要求I的13種病原微生物的引物； (4)電泳檢測(cè) 對(duì)三組多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察，第一組產(chǎn)物的電泳圖中含有5個(gè)不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物片段，分別為志賀菌113bp ;金黃色葡萄球菌283bp ;腸出血性大腸桿菌0157:H7 366bp ;大腸埃希菌471bp ;腸炎沙門(mén)氏菌679bp ;第二組產(chǎn)物的電泳圖中含有4個(gè)不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物片段，分別為單核細(xì)胞增生李斯特菌155bp ;嗜肺軍團(tuán)菌252bp，肺炎克雷伯菌319bp ;幽門(mén)螺旋桿菌364bp ;第三組產(chǎn)物的電泳圖中含有5個(gè)不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物片段，分別為結(jié)合分枝桿菌135bp ;鼠疫耶爾森菌184bp ;炭疽芽孢桿菌275bp ;霍亂弧菌465bp ；16S 370bp ;其中16S做為檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性質(zhì)控。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(4)中的電泳檢測(cè)使用3%瓊脂糖凝膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(I)的濃縮儀采用Milliflex Plus微生物過(guò)濾系統(tǒng)。
全文摘要
一種基于多重PCR的水中13種病原微生物同步快速檢測(cè)方法，所述方法是采用多重PCR同時(shí)擴(kuò)增13種病原微生物的特異性基因片段大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7、嗜肺軍團(tuán)菌、腸炎沙門(mén)菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、幽門(mén)螺旋桿菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌和鼠疫耶爾森菌，再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)13種病原微生物同步快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102703588SQ201210172849
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月9日
發(fā)明者張春秀, 敖漉, 方振東, 王大勇, 謝朝新, 陳金絲, 馬穎 申請(qǐng)人:上海生物芯片有限公司, 中國(guó)人民解放軍后勤工程學(xué)院