專利名稱：褐疣柄牛肝菌發(fā)酵產色素的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物工程技術領域，特別是涉及ー種褐疣柄牛肝菌發(fā)酵產色素的制備方法。
背景技術：
色素即著色劑，在食品、日化、醫(yī)藥、印染エ業(yè)中有廣泛應用。按來源不同，色素可分為天然色素和人工合成色素兩類，由于合成色素有一定毒性，人們更青睞天然色素。天然色素有三種主要來源，植物、動物、微生物。通過微生物的大規(guī)模培養(yǎng)，發(fā)酵生產色素，不受資源、環(huán)境和空間的限制，是高效率、低成本獲得色素的有效途徑，目前商品化利用的微生物色素僅紅曲紅、紅曲黃、法夫酵母色素等。我國大型真菌資源豐富，尤其某些大型真菌中色素含量較高，兼具營養(yǎng)和藥理活性，但被應用的非常少，開發(fā)潛力巨大。褐撫柄牛肝菌{Leccinum scabrum)隸屬于層菌綱、傘菌目、牛肝菌科、撫柄牛肝菌屬，是ー種經濟真菌，味道鮮美，菌肉細嫩，富含蛋白質、氨基酸、多糖及各種微量元素，食用和藥用價值都較高，可與樺、山毛棒、楊、柳、椴、棒、松等形成外生菌根，分布于黑龍江、吉林、河北、安徽、江蘇、浙江、陜西、青海、新疆、云南、四川等地。褐疣柄牛肝菌液體培養(yǎng)菌絲體呈黃色，該真菌發(fā)酵所產黃色素可廣泛應用于食品添加剤、エ業(yè)印染、生物制藥等領域，但目前未見褐疣柄牛肝菌發(fā)酵產色素的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種褐疣柄牛肝菌發(fā)酵產色素的制備方法，該方法首先將褐疣柄牛肝菌發(fā)酵產色素，然后通過超聲波輔助提取色素。超聲波輔助提取是ー種利用外場介入的強化提取過程，利用空化作用、機械作用和熱效應在溶媒中進行天然產物活性成分提取，可以加速有效成分的浸出和擴散釋放，提高提取效率。因此，利用超聲波輔助提取褐疣柄牛肝菌發(fā)酵所產色素，既可以縮短生產周期，又能夠減少溶劑用量，有利于實現(xiàn)對褐疣柄牛肝菌的綜合利用和精深加工，促進微生物工程領域的快速發(fā)展。本發(fā)明所述的褐疣柄牛肝菌發(fā)酵產色素的制備方法，通過以下步驟實現(xiàn)
(I)按下述比例配制褐疣柄牛肝菌液體培養(yǎng)基
取馬鈴薯150 200g、淀粉15 20g、牛肉膏I 2 g、KH2P040 . 4 O. 5 g 'K2HPO4O. I 0.2 g、MgSO4 · 7Η200· 2 O. 6 g，首先將馬鈴薯洗凈、去皮、稱量、切片，加水煮沸30min，過濾取濾液，在濾液中加入淀粉、牛肉膏、KH2PO4、Κ2ΗΡ04和MgSO4 ·7Η20，混勻定容至IOOOmL,121°C滅菌25min，冷卻得液體培養(yǎng)基；
(2)褐疣柄牛肝菌液體發(fā)酵將褐疣柄牛肝菌菌種接種至綜合PDA平板培養(yǎng)基上，25 27°C培養(yǎng)5 7天，獲得褐疣柄牛肝菌菌絲；將菌絲塊接種至液體培養(yǎng)基，接種比例為每100 mL液體培養(yǎng)基加入5塊直徑為IOmm的菌絲塊，25 27°C、130r/min、黑暗振蕩培養(yǎng)3天，獲得液體種子；將體積比8 10%的液體種子接種至液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵，25 27°C、130r/min、黑暗振蕩培養(yǎng)6 8天，獲得褐疣柄牛肝菌發(fā)酵液；
(3)褐疣柄牛肝菌菌絲粉的獲得發(fā)酵液離心5000r/min、20min，收集菌絲體，在相對真空度為-O. 08 -I. OMPa、溫度為50°C下真空干燥，粉碎至60目得菌絲粉；(4)超聲波輔助提取色素稱取菌絲粉，加入質量比濃度為80 90%的こ醇，在液料比65 75mL/g、超聲波功率400 500W、溫度40 50°C條件下提取20 30min ;取超聲波提取液離心5000r/min、20min,得沉淀物和離心上清液,沉淀物在相同條件下重復超聲提取2 3次；收集、合并離心所得上清液，在相對真空度為-O. 08 -I. OMPa、溫度為40 45°C下減壓蒸餾濃縮至浸膏狀，并回收こ醇；將浸膏在相對真空度為-O. 08 -I. OMPa、溫度為50°C下真空干燥，即獲得褐疣柄牛肝菌色素。上述方法中，綜合PDA培養(yǎng)基及褐疣柄牛肝菌菌種均可在市場上購得。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點①液體培養(yǎng)菌絲體繁殖速度快、色素產量高、營養(yǎng)價值豐富，極具發(fā)展前景培養(yǎng)設備簡單、原料來源廣、價格低，可進行大規(guī)模生產；③超聲波提取生產周期短，操作エ藝易控制，提取效率高，節(jié)能環(huán)保，經濟效益高，便于エ業(yè)化推廣。
具體實施例方式實施例I
(I)配制褐疣柄牛肝菌液體培養(yǎng)基
取馬鈴薯 180g、淀粉 20g、牛肉膏 2 g、KH2PO4O. 4 g、K2HPO4O. I g、MgSO4 · 7Η200· 6 g,首先將馬鈴薯洗凈、去皮、稱量、切片，加水煮沸30min，過濾取濾液，在濾液中加入淀粉、牛肉膏、KH2PO4、K2HPO4和MgSO4 · 7H20，混勻定容至lOOOmL，121°C滅菌25min，冷卻得液體培
養(yǎng)基;
(2)褐疣柄牛肝菌液體發(fā)酵將褐疣柄牛肝菌菌種接種至綜合PDA平板培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)5天，獲得褐疣柄牛肝菌菌絲；將菌絲塊接種至液體培養(yǎng)基，接種比例為每100 mL液體培養(yǎng)基加入5塊直徑為IOmm的菌絲塊，26°C、130r/min、黑暗振蕩培養(yǎng)3天，獲得液體種子；將體積比8%的液體種子接種至液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵，26°C、130r/min、黑暗振蕩培養(yǎng)7天，獲得褐疣柄牛肝菌發(fā)酵液；
(3)褐疣柄牛肝菌菌絲粉的獲得發(fā)酵液離心5000r/min、20min，收集菌絲體，在相對真空度為-O. 08 -I. OMPa、溫度為50°C下真空干燥，粉碎至60目得菌絲粉；
(4)超聲波輔助提取色素稱取菌絲粉，加入質量比濃度為80%的こ醇，在液料比75mL/g、超聲波功率400W、溫度45°C條件下提取20min ;取超聲波提取液離心5000r/min、20min，得沉淀物和離心上清液，沉淀物在相同條件下重復超聲提取3次；收集、合并離心所得上清液，在相對真空度為-0. 08 -I. OMPa、溫度為45°C下減壓蒸餾濃縮至浸膏狀，并回收こ醇；將浸膏在相對真空度為-0. 08 -I. OMPa、溫度為50°C下真空干燥，即獲得褐疣柄牛肝菌色素。實施例2
(I)配制褐疣柄牛肝菌液體培養(yǎng)基
取馬鈴薯 2000g、淀粉 150g、牛肉膏 10 g、KH2P045 g、K2HP042 g、MgSO4 · 7H204 g，首先將馬鈴薯洗凈、去皮、稱量、切片，加水煮沸30min，過濾取濾液，在濾液中加入淀粉、牛肉膏、KH2PO4、K2HPO4和MgSO4 · 7H20，混勻定容至10L，121°C滅菌25min，冷卻得液體培養(yǎng)基；
(2)褐疣柄牛肝菌液體發(fā)酵將褐疣柄牛肝菌菌種接種至綜合PDA平板培養(yǎng)基上，27°C培養(yǎng)5天，獲得褐疣柄牛肝菌菌絲；將菌絲塊接種至液體培養(yǎng)基，接種比例為每100 mL液體培養(yǎng)基加入5塊直徑為IOmm的菌絲塊，27°C、130r/min、黑暗振蕩培養(yǎng)3天，獲得液體種子；將體積比10%的液體種子接種至液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵，27°C、130r/min、黑暗振蕩培養(yǎng)6天，獲得褐疣柄牛肝菌發(fā)酵液；
(3)褐疣柄牛 肝菌菌絲粉的獲得發(fā)酵液離心5000r/min、20min，收集菌絲體，在相對真空度為-O. 08 -1. OMPa、溫度為50°C下真空干燥，粉碎至60目得菌絲粉；
(4)超聲波輔助提取色素稱取菌絲粉，加入質量比濃度為90%的こ醇，在液料比65mL/g、超聲波功率500W、溫度50°C條件下提取30min ;取超聲波提取液離心5000r/min、20min，得沉淀物和離心上清液，沉淀物在相同條件下重復超聲提取2次；收集、合并離心所得上清液，在相對真空度為-O. 08 -I. OMPa、溫度為40°C下減壓蒸餾濃縮至浸膏狀，并回收こ醇；將浸膏在相對真空度為-O. 08 -I. OMPa、溫度為50°C下真空干燥，即獲得褐疣柄牛肝菌色素。實施例3
(I)配制褐疣柄牛肝菌液體培養(yǎng)基
取馬鈴薯 1500g、淀粉 180g、牛肉膏 15 g、KH2P045 g、K2HP042 g、MgSO4 · 7H202 g，首先將馬鈴薯洗凈、去皮、稱量、切片，加水煮沸30min，過濾取濾液，在濾液中加入淀粉、牛肉膏、KH2PO4、K2HPO4和MgSO4 · 7H20，混勻定容至10L，121°C滅菌25min，冷卻得液體培養(yǎng)基；
(2)褐疣柄牛肝菌液體發(fā)酵將褐疣柄牛肝菌菌種接種至綜合PDA平板培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)7天，獲得褐疣柄牛肝菌菌絲；將菌絲塊接種至液體培養(yǎng)基，接種比例為每100 mL液體培養(yǎng)基加入5塊直徑為IOmm的菌絲塊，25°C、130r/min、黑暗振蕩培養(yǎng)3天，獲得液體種子；將體積比9%的液體種子接種至液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵，25°C、130r/min、黑暗振蕩培養(yǎng)8天，獲得褐疣柄牛肝菌發(fā)酵液；
(3)褐疣柄牛肝菌菌絲粉的獲得發(fā)酵液離心5000r/min、20min，收集菌絲體，在相對真空度為-O. 08 -I. OMPa、溫度為50°C下真空干燥，粉碎至60目得菌絲粉；
(4)超聲波輔助提取色素稱取菌絲粉，加入質量比濃度為85%的こ醇，在液料比70mL/g、超聲波功率450W、溫度45°C條件下提取25min ;取超聲波提取液離心5000r/min、20min，得沉淀物和離心上清液，沉淀物在相同條件下重復超聲提取2次；收集、合并離心所得上清液，在相對真空度為-O. 08 -I. OMPa、溫度為40°C下減壓蒸餾濃縮至浸膏狀，并回收こ醇；將浸膏在相對真空度為-0. 08 -I. OMPa、溫度為50°C下真空干燥，即獲得褐疣柄牛肝菌色素。
權利要求
1.褐疣柄牛肝菌發(fā)酵產色素的制備方法，其特征在于首先配制褐疣柄牛肝菌液體培養(yǎng)基，然后將褐疣柄牛肝菌液體發(fā)酵并獲得褐疣柄牛肝菌菌絲粉，最后用超聲波輔助提取得到褐疣柄牛肝菌色素。
2.根據權利要求I所述的褐疣柄牛肝菌發(fā)酵產色素的制備方法，其特征在于通過以下步驟實現(xiàn) (I)按下述比例配制褐疣柄牛肝菌液體培養(yǎng)基 取馬鈴薯150 200g、淀粉15 20g、牛肉膏I 2 g、KH2P040 . 4 0. 5 g 'K2HPO4O. I 0.2 g、MgSO4 7H200. 2 0. 6 g，首先將馬鈴薯洗凈、去皮、稱量、切片，加水煮沸30min，過濾取濾液，在濾液中加入淀粉、牛肉膏、KH2PO4、K2HP04和MgSO4 *7H20，混勻定容至IOOOmL,121°C滅菌25min，冷卻得液體培養(yǎng)基； (2)褐疣柄牛肝菌液體發(fā)酵將褐疣柄牛肝菌菌種接種至綜合PDA平板培養(yǎng)基上，25 27°C培養(yǎng)5 7天，獲得褐疣柄牛肝菌菌絲；將菌絲塊接種至液體培養(yǎng)基，接種比例為每100 mL液體培養(yǎng)基加入5塊直徑為IOmm的菌絲塊，25 27°C、130r/min、黑暗振蕩培養(yǎng)3天，獲得液體種子；將體積比8 10%的液體種子接種至液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵，25 27°C、130r/min、黑暗振蕩培養(yǎng)6 8天，獲得褐疣柄牛肝菌發(fā)酵液； (3)褐疣柄牛肝菌菌絲粉的獲得發(fā)酵液離心5000r/min、20min，收集菌絲體，在相對真空度為-0. 08 -I. OMPa、溫度為50°C下真空干燥，粉碎至60目得菌絲粉； (4)超聲波輔助提取色素稱取菌絲粉，加入質量比濃度為80 90%的乙醇，在液料比65 75mL/g、超聲波功率400 500W、溫度40 50°C條件下提取20 30min ;取超聲波提取液離心5000r/min、20min,得沉淀物和離心上清液,沉淀物在相同條件下重復超聲提取2 3次；收集、合并離心所得上清液，在相對真空度為-0. 08 -I. OMPa、溫度為40 45°C下減壓蒸餾濃縮至浸膏狀，并回收乙醇；將浸膏在相對真空度為-0. 08 -I. OMPa、溫度為50°C下真空干燥，即獲得褐疣柄牛肝菌色素。
全文摘要
褐疣柄牛肝菌發(fā)酵產色素的制備方法，通過配制液體培養(yǎng)基、褐疣柄牛肝菌發(fā)酵并獲得菌絲粉、超聲波輔助提取褐疣柄牛肝菌菌絲粉色素等一系列步驟實現(xiàn)。該方法液體培養(yǎng)菌絲體繁殖速度快、色素產量高、營養(yǎng)價值豐富；培養(yǎng)設備簡單、原料來源廣、價格低，可進行大規(guī)模生產；超聲波提取生產周期短，操作工藝易控制，提取效率高，節(jié)能環(huán)保，經濟效益高，便于工業(yè)化推廣。
文檔編號C12R1/645GK102660583SQ20121017299
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月30日 優(yōu)先權日2012年5月30日
發(fā)明者劉朝貴, 方瓊, 陳仁玉 申請人:西南大學