專利名稱：一種利用生物相容的高分子修飾葡萄糖氧化酶表面以提高其壽命和穩(wěn)定性的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該方法涉及一種葡萄糖氧化酶的的改造方法，通過葡萄糖氧化酶表面的多個氨基基團，使一種具有生物相容性的高分子聚合物連接在其表面使之被改造。改造后的葡萄糖氧化酶具有更好的熱穩(wěn)定性及更長的 使用壽命，屬于生物酶研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
高純度葡萄糖氧化酶為淡黃色粉末，易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、丁醇等。分子量為160KDa左右，每分子葡萄糖氧化酶含有兩分子的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。固體酶制劑在0°C下保存至少穩(wěn)定兩年，在-15°C下穩(wěn)定8年。葡萄糖氧化酶穩(wěn)定的溫度范圍為30°C 60°C，最適PH為5。葡萄糖氧化酶在分子氧存在下能氧化葡萄糖生成D-葡萄糖酸內(nèi)酯，同時消耗氧生成過氧化氫。過氧化氫是一種強氧化劑，有殺菌消毒的作用。由于其具有催化專一性、高活性和催化高效性等優(yōu)點，在食品工業(yè)、醫(yī)藥、飼料添加劑等方面應(yīng)用非常廣泛，起到了去除葡萄糖、脫氧、殺菌等作用。其最主要的用途是生產(chǎn)葡萄糖酸及作為抗氧化劑而廣泛用于食品保鮮過程中。自從1928年Muller發(fā)現(xiàn)并命名葡萄糖氧化酶至今，每年都有許多人對葡萄糖氧化酶進行研究與探索，尤其是對它的輔基一黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。大量的文獻報道了有關(guān)FAD的固定或改造，例如用于制備葡萄糖傳感器、電化學方面的應(yīng)用以及酶活性等方面的研究。然而，有關(guān)通過對葡萄糖氧化酶的表面進行改造以調(diào)節(jié)其壽命和穩(wěn)定性的報道卻很少。本發(fā)明旨在對葡萄糖氧化酶的表面直接進行改造，通過在表面連接上具有生物相容性的高分子鏈，從而達到改善葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性及其壽命的目的，使改造后的葡萄糖氧化酶能夠更好的應(yīng)用于食品加工、食品保鮮以及防腐處理等領(lǐng)域。且在制備的過程中具有很低的毒性，是一種綠色環(huán)保的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了一種對葡萄糖氧化酶的表面進行改造的新方法，以期通過葡萄糖氧化酶表面的氨基基團對其進行改造，使其熱穩(wěn)定性和使用壽命得到提高。該方法用帶有巰基噻唑啉末端基的RAFT試劑，通過RAFT(可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移)聚合法合成了 α-(1-氧代-2-丙烯基)-ω-甲氧基聚(氧乙烯)(PEG-A)高分子聚合物。通過高分子鏈末端的巰基噻唑啉基團，與葡萄糖氧化酶表面的氨基進行酰胺化反應(yīng)，從而連接在其表面。改造后的葡萄糖氧化酶，其表面的高分子鏈把酶的活性中心(FAD)等組分部分包圍，對酶的結(jié)構(gòu)起到了穩(wěn)固和保護作用。因此，改造后的葡萄糖氧化酶具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性和更長的使用壽命O發(fā)明是通過下述方式實現(xiàn)的，包括下列步驟(I)合成帶有巰基噻唑啉末端基的RAFT試劑，然后聚合PEG-A得到帶有巰基噻唑啉末端基的高分子，使其聚合物鏈連接在葡萄糖氧化酶上。(附圖I)
(2)酶活性的測定通過紫外分光光度計分析法，對改造后酶的活性進行測定。(3)熱穩(wěn)定性的測定把酶溶解在去離子水中，在70°C下保溫3小時，每隔一段時間，取樣品進行(4)活性測試。測定得出結(jié)論，葡萄糖氧化酶在70°C下很快失去活性，而改造后的葡萄糖氧化酶在3小時后仍然具有活性。(附圖2)(4)使用壽命的測定把酶的水溶液放于室溫下60天，每隔一段時間，取樣品進行
(4)活性測試。測定得出結(jié)論，葡萄糖氧化酶在室溫下能儲存29天，而改造后的葡萄糖氧化酶在60天后仍然具有活性(附圖3)


圖I是聚合物鏈的合成及改造葡萄糖氧化酶示意圖。圖2是熱穩(wěn)定性測定結(jié)果圖。圖3是使用壽命的測定結(jié)果圖。
具體實施例方式實施例I.取RAFT試劑O. 527g，2_巰基噻唑啉O. 238g，溶于IOml的ニ氯甲烷中。再加入脫水劑ニ環(huán)己基碳ニ亞胺(DCC)O. 497g，和催化劑4- ニ甲氨基吡啶(DMAP) 24. 5mg,在室溫下攪拌7小吋。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾除去固體顆粒，然后通過硅膠柱提純產(chǎn)物。將帶有巰基噻唑啉末端基的RAFT試劑7. 6mg, α-(I-氧代-2-丙烯基)-ω-甲氧基聚(氧こ烯)(PEG-A) 2g，偶氮ニ異丁氰(AIBN) lmg，溶解在4ml ニ氧六環(huán)中，其中，RAFT試劑與PEG-A的摩爾比為I : 100。通氮氣除氧40min，然后密封反應(yīng)體系，在75°C的油浴中反應(yīng)5小時。反應(yīng)結(jié)束后，用こ醚沉淀提純聚合物，得到預(yù)期的產(chǎn)物。把5mg的葡萄糖氧化酶溶液在5ml磷酸鹽緩沖液中(pH = 7)，按照摩爾比I : 30的比例加入合成的聚合物，室溫下攪拌48小吋。反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量10萬的透析袋進行透析除去過量的高分子，將改造的葡萄糖氧化酶冷凍干燥。然后進行酶活性、熱穩(wěn)定性及使用壽命測試。實施例2.將I中摩爾比改為RAFT試劑PEG-A = I 50，其他如實施例I。實施例3.將I中摩爾比改為RAFT試劑PEG-A = I 200，其他如實施例I。實施例4.將I中質(zhì)量比改為RAFT試劑PEG-A = I 400，其他如實施例I。
權(quán)利要求
1.ー種利用生物相容的高分子修飾葡萄糖氧化酶表面以提高其壽命和穩(wěn)定性的新方法 (1)帶有巰基噻唑啉末端基的RAFT試劑的合成取RAFT試劑O.527g，2-巰基噻唑啉O.238g，溶于IOml ニ氯甲烷中，再加入ニ環(huán)己基碳ニ亞胺(DCC)O. 497g，和4-ニ甲氨基吡啶(DMAP) 24. 5mg，在室溫下攪拌7小時，反應(yīng)結(jié)束后，抽濾除去固體顆粒，然后通過硅膠柱提純產(chǎn)物。
(2)PEG-A聚合物的合成將帶有巰基噻唑啉末端基的RAFT試劑7.6mg, α-(1-氧代-2-丙烯基)-ω-甲氧基聚(氧こ烯)(PEG-A) 2g,偶氮ニ異丁氰(AIBN) Img,溶解在4mlニ氧六環(huán)中。其中，RAFT試劑與PEG-A的摩爾比為I : 100。通氮氣除氧40min，然后密封反應(yīng)體系，在75°C的油浴中攪拌反應(yīng)5小吋，反應(yīng)結(jié)束后，用こ醚沉淀提純聚合物，得到預(yù)期的產(chǎn)物。
(3)高分子聚合物鏈連接在葡萄糖氧化酶上把5mg的葡萄糖氧化酶溶液在5ml磷酸鹽緩沖液中(pH = 7)，按照摩爾比I : 30的比例加入合成的聚合物，室溫下攪拌48小時，反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量10萬的透析袋進行透析提純，提純后冷凍干燥，得到產(chǎn)物，然后進行酶活性、熱穩(wěn)定性及儲存性的測試。
2.按照權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在干步驟(2)中聚合物分子量并非固定，可以根據(jù)聚合物分子量的需要按比例改變單體用量。
3.按照權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中反應(yīng)溫度是可以調(diào)節(jié)的，.60 90°C范圍內(nèi)均可。
4.按照權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中RAFT試劑與AIBN的比例并非固定，RAFT/AIBN = 2_8。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種對葡萄糖氧化酶的表面進行改造的新方法，以期通過葡萄糖氧化酶表面的氨基基團對其進行改造，使其熱穩(wěn)定性和壽命得到提高。該方法用帶有巰基噻唑啉末端基的RAFT試劑，通過RAFT(可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移)聚合法合成了α-(1-氧代-2-丙烯基)-ω-甲氧基聚(氧乙烯)(PEG-A)高分子聚合物。通過高分子鏈末端的巰基噻唑啉基團，與葡萄糖氧化酶表面的氨基進行酰胺化反應(yīng)，從而連接在其表面。改造后的葡萄糖氧化酶，其表面的高分子鏈把酶的活性中心(FAD)等組分部分包圍，對酶的結(jié)構(gòu)起到了穩(wěn)固和保護作用。因此，改造后的葡萄糖氧化酶具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性和更長的使用壽命。
文檔編號C12N9/96GK102719423SQ20121017361
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者劉敬權(quán), 王蕊, 羅雄 申請人:青島大學