專利名稱：大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于精細化工和醫(yī)藥領(lǐng)域。涉及分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法，具體為大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法。
背景技術(shù)：
目前從鴨膽汁中分離鵝去氧膽酸的方法，集中于溶劑萃取法，沉淀法、和離子交換樹脂法，分離エ藝繁雜，收率低，純度低。相關(guān)文獻有劉雁紅、胡祥正發(fā)表的“鴨膽膏中鵝去氧膽酸的提取エ藝”，天津科技大學(xué)學(xué)報2009 年 06 期; 2006年05月24日中國專利CN1775798公開的“ー種從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法”。該方法包括如下步驟a.皂化反應(yīng)將禽畜膽汁與氫氧化鈉溶液按一定比例及溫度下進行皂化反應(yīng)，反應(yīng)時間為20-30小時；b.中和反應(yīng)皂化反應(yīng)結(jié)束后加入稀鹽酸調(diào)節(jié)至酸性，然后過濾得到粗膽酸；c.柱層析將粗膽酸用稀氫氧化鈉溶液調(diào)至堿性，打入層析柱中，用堿性溶液洗脫，合并經(jīng)薄層層析檢測為單純的鵝去氧膽酸斑點的洗脫液；d.超濾用截留分子量為3K-100K的超濾膜超濾；e.超濾液用稀酸調(diào)至酸性，過濾，烘干，得純度為96%以上的鵝去氧膽酸。本發(fā)明生產(chǎn)エ藝簡單、產(chǎn)品純度高、成本低、綠色環(huán)保。2008年03月19日中國專利CN101143886公開的“禽類膽汁中鵝去氧膽酸的非有機溶劑提取法”。包括如下步驟a.皂化反應(yīng)將禽膽汁與氫氧化鈉按一定比例煮沸進行皂化，皂化時間20-24小時；b.中和反應(yīng)皂化液用鹽酸中和及調(diào)節(jié)PH2-4，沉淀得總膽汁酸；c.鈣鹽沉淀將總膽汁酸加氫氧鈉溶液溶解，加活性炭，回流，過濾，濾液加10% -14%的氯化鈣，得鈣鹽沉淀物；d.脫鈣鈣鹽按比例加入碳酸鈉10% -15%，加熱回流1-3小時，濾液用5% -10%的鹽酸液調(diào)節(jié)pH2. 0-3. 5得沉淀；e.收集沉淀物，真空干燥，得鵝去氧膽酸粗品O2011年01月19日中國專利CN101948496A公開的“ー種從家禽膽汁中提取鵝去氧酸的方法”。從新鮮或冷凍家禽膽汁中，利用皂化反應(yīng)，得到粗膽汁酸或粗膽汁酸鈣鹽，再將粗膽汁酸酷溶液與有機含氮化合物A水溶液共熱，利用有機含氮化合物A來除去粗膽汁酸中的大部份親水性雜質(zhì)，得到的粗膽汁酸酷溶液與有機含氮化合物B反應(yīng)，析出沉淀，過濾，并進行脫色、精制等步驟后，可得純度95%左右的鵝去氧膽酸。本發(fā)明具有操作簡便，生產(chǎn)設(shè)備通用性高，所用化學(xué)物質(zhì)低毒的特點；適用于鵝去氧膽酸的エ業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題的基本思路是依據(jù)膽汁酸在動物體內(nèi)屬于腸肝循環(huán)的原理，取動物回腸內(nèi)容物及大腸內(nèi)容物來培養(yǎng)提取其中的微生物，進而用大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是ー種大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法，其特征在于該エ藝分為兩步第一步為微生物溶液制作取動物回腸及大腸，刮出回腸和大腸中的內(nèi)容物；在刮出的內(nèi)容物中，添加內(nèi)容物體積O. 5-10倍的水稀釋混勻，過濾除掉固體雜質(zhì)，得到濾液；按濾液體積加入O. 1-0. 5倍的MRS培養(yǎng)基，保持溫度在35_42°C，培養(yǎng)24_72小吋，
得培養(yǎng)液；用離心機分離培養(yǎng)液，得到沉淀物； 加沉淀物重量1-100倍的無菌生理鹽水混懸，得到能水解結(jié)合型膽汁酸的微生物溶液；常溫保存微生物溶液，備用；第二步為大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸取鴨膽汁，按膽汁量體積添加微生物溶液O. 5ml-6ml/L混合均勻，得混合液；混合液在25°C _42°C溫度條件下，反應(yīng)24-72小時，得游離型膽汁酸溶液中間體；從中間體中過濾出濕游離型膽汁酸；按游離型膽汁酸濕重添加5-20倍水稀釋成稀釋液，并用碳酸鈉或氫氧化鈉調(diào)稀釋液PH值至8-10 ；按稀釋液重量的O. 1-0. 2倍加入水飽和的硫酸鎂，并混合均勻充分反應(yīng)，得到膽汁酸鎂鹽，再在膽汁酸鎂鹽中加鹽酸調(diào)PH值至4. 5-6. 5，過濾得到游離型膽汁酸鎂鹽；或按稀釋液重量的O. 1-0. 2倍加入水飽和的氯化鈣，并混合均勻充分反應(yīng)，得到膽汁酸鈣鹽，再在膽汁酸鈣鹽中加鹽酸調(diào)PH值至4. 5-6. 5，過濾得到游離型膽汁酸鈣鹽；按游離型膽汁酸鎂鹽或游離型膽汁酸鈣鹽重量4-10倍的比例加入濃度為60-90%的甲醇或こ醇回流溶解游離型膽汁酸鎂鹽或游離型膽汁酸鈣鹽得溶解液；將溶解液置于裝有大孔樹脂的層析柱中，層析柱中的大孔樹脂裝入量為每升層析柱體積裝入O. 5-0. 8kg大孔樹脂；然后第一歩用層析柱體積2-10倍量的濃度為35-55%甲醇或こ醇洗脫掉溶解液中的未水性雜質(zhì)；第二步再用層析柱體積5-10倍量的濃度為60-80%甲醇或こ醇洗脫層析柱得到鵝去氧膽酸溶液；鵝去氧膽酸溶液按每升加入l_4g碳酸鈉或氫氧化鈉，加熱回收鵝去氧膽酸溶液中的甲醇或こ醇，至鵝去氧膽酸溶液中的甲醇或こ醇濃度在10 %以下，冷卻至常溫后過濾，濾液按l-5g/L的量加入エ業(yè)用雙氧水脫色10-24小時后，用鹽酸調(diào)pH值至2. 5-4. 5，再過濾，濾餅用水洗至PH值至中性，低溫烘干濾餅，就得到鵝去氧膽酸。進ー步的方案是在第二步洗脫層析柱后，按層析柱體積5-10倍量的濃度為90%以上甲醇或こ醇再次洗脫層析柱，洗脫后的層析柱下次備用。本發(fā)明的具體エ藝流程可以是鴨膽一去膽度一鴨膽汁一水解以鴨膽汁O. 5ml-6ml/L微生物溶液加入該鴨膽液中，升溫至25°C -42°C反應(yīng)24h-72h —游離膽汁酸一NaoH, NaC03調(diào)pH8_10 —飽和硫酸鎂溶液按其濕重游離膽汁酸的O. 1-0. 2倍加入水飽和的硫酸鎂溶液混合均勻一過濾一膽汁酸鎂鹽一上大孔樹脂一45% -90%甲醇洗脫一分段收集得到較純的鵝去氧膽酸(⑶CA)本發(fā)明結(jié)合微生物溶液的水解作用，得到游離膽汁酸后，調(diào)PH8-10，加水飽和硫酸鎂溶液生成膽汁酸鎂鹽，膽汁酸鎂鹽調(diào)PH4. 5-6. 5，用甲醇溶解后，上于大孔樹脂，此大孔樹脂是由苯こ烯或丙烯酸為原料的ー種，用45%-90%甲醇洗脫，分段收集用G型薄層硅膠板定性，(展開劑為異辛烷醋酸こ酷冰醋酸正丁醇；10 5 1.5 1.5),(顯色劑為10%磷鑰酸こ醇溶液)收集純的⑶CA洗脫段，得到較高收率的，純度大于95%的⑶CA。拋去了原有的溶劑汽油脫脂，反復(fù)沉淀、結(jié)晶等エ藝，實現(xiàn)了簡便、安全易控、穩(wěn)定性好的エ業(yè)化生產(chǎn)鴨膽中鵝去氧膽酸方法。本發(fā)明的有益效果是，創(chuàng)造了ー種新的從鴨膽汁中用大孔樹脂分離其中的鵝去氧、膽酸(CDCA)方法，使其方法簡單易控，收率和純度高，適合エ業(yè)化從鴨膽汁中分離鵝去氧膽酸，使得大量的鴨膽得到真正有效地利用。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明進ー步說明。本發(fā)明的應(yīng)用范圍不限于該實例。ー種大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法，其特征在于該エ藝分為兩步第一步為微生物溶液制作取動物回腸及大腸，刮出回腸和大腸中的內(nèi)容物；在刮出的內(nèi)容物中，添加內(nèi)容物體積5倍的水稀釋混勻，過濾除掉固體雜質(zhì)，得到濾液；按濾液體積加入O. 2倍的MRS培養(yǎng)基，保持溫度在37°C，培養(yǎng)72小時，得培養(yǎng)液；用離心機分離培養(yǎng)液，得到沉淀物；加沉淀物重量10倍的無菌生理鹽水混懸，得到能水解結(jié)合型膽汁酸的微生物溶液；常溫保存微生物溶液，備用；第二步為大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸取鴨膽汁IOOOml，按膽汁量體積添加微生物溶液3ml/L混合均勻，得混合液；混合液在37°C溫度條件下，反應(yīng)48小時，得游離型膽汁酸溶液中間體；從中間體中過濾出濕游離型膽汁酸；按游離型膽汁酸濕重添加10倍水稀釋成稀釋液，并用碳酸鈉或氫氧化鈉調(diào)稀釋液PH值至8-10 ；按稀釋液重量的O. 2倍加入水飽和的硫酸鎂，并混合均勻充分反應(yīng)，得到膽汁酸鎂鹽，再在膽汁酸鎂鹽中加稀鹽酸調(diào)PH值至4. 5-6. 5，過濾得到游離型膽汁酸鎂鹽；或按稀釋液重量的O. I倍加入水飽和的氯化鈣，并混合均勻充分反應(yīng)，得到膽汁酸鈣鹽，再在膽汁酸鈣鹽中加稀鹽酸調(diào)PH值至4. 5-6. 5，過濾得到游離型膽汁酸鈣鹽；按游離型膽汁酸鎂鹽或游離型膽汁酸鈣鹽重量4倍的比例加入濃度為80%的甲醇或こ醇回流溶解游離型膽汁酸鎂鹽或游離型膽汁酸鈣鹽得溶解液；將溶解液置于裝有1000克大孔樹脂的層析柱中，層析柱中的大孔樹脂裝入量為每升層析柱體積裝入O. 7kg大孔樹脂；層析柱的徑高比為(I 10)。然后第一歩用層析柱體積5倍量的濃度為45%甲醇或こ醇洗脫掉溶解液中的親水性雜質(zhì)；第二步再用層析柱體積10倍量的濃度為70%甲醇或こ醇洗脫層析柱得到鵝去氧膽酸溶液；鵝去氧膽酸溶液按每升加入3g碳酸鈉或氫氧化鈉，加熱回收鵝去氧膽酸溶液中的甲醇或こ醇，至鵝去氧膽酸溶液中的甲醇或こ醇濃度在10%以下，冷卻至常溫后過濾，濾液按3g/L的量加入エ業(yè)用雙氧水脫色12小時后，用稀鹽酸調(diào)pH值至2. 5-4. 5，再過濾，濾餅用水洗至PH值至中性，低溫烘干濾餅，就得到24克含量為95%以上的鵝去氧膽酸。
在第二步洗脫層析柱后，按層析柱體積10倍量的濃度為90%以上甲醇或こ醇再次洗脫層析柱，洗脫后的層析柱下次備用。
權(quán)利要求
1.ー種大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法，其特征在于該エ藝分為兩步 第一步為微生物溶液制作 取動物回腸及大腸，刮出回腸和大腸中的內(nèi)容物； 在刮出的內(nèi)容物中，添加內(nèi)容物體積O. 5-10倍的水稀釋混勻，過濾除掉固體雜質(zhì)，得到濾液； 按濾液體積加入O. 1-0. 5倍的MRS培養(yǎng)基，保持溫度在35-42°C，培養(yǎng)24-72小時，得培養(yǎng)液； 用離心機分離培養(yǎng)液，得到沉淀物； 加沉淀物重量1-100倍的無菌生理鹽水混懸，得到能水解結(jié)合型膽汁酸的微生物溶液； 常溫保存微生物溶液，備用； 第二步為大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸 取鴨膽汁，按膽汁量體積添加微生物溶液O. 5ml-6ml/L混合均勻，得混合液； 混合液在25°C _42°C溫度條件下，反應(yīng)24-72小時，得游離型膽汁酸溶液中間體； 從中間體中過濾出濕游離型膽汁酸； 按游離型膽汁酸濕重添加5-20倍水稀釋成稀釋液，并用碳酸鈉或氫氧化鈉調(diào)稀釋液pH 值至 8-10 ； 按稀釋液重量的O. 1-0. 2倍加入水飽和的硫酸鎂，并混合均勻充分反應(yīng)，得到膽汁酸鎂鹽，再在膽汁酸鎂鹽中加鹽酸調(diào)PH值至4. 5-6. 5，過濾得到游離型膽汁酸鎂鹽； 或按稀釋液重量的O. 1-0. 2倍加入水飽和的氯化鈣，并混合均勻充分反應(yīng)，得到膽汁酸鈣鹽，再在膽汁酸鈣鹽中加鹽酸調(diào)PH值至4. 5-6. 5，過濾得到游離型膽汁酸鈣鹽； 按游離型膽汁酸鎂鹽或游離型膽汁酸鈣鹽重量4-10倍的比例加入濃度為60-90%的甲醇或こ醇回流溶解游離型膽汁酸鎂鹽或游離型膽汁酸鈣鹽得溶解液； 將溶解液置于裝有大孔樹脂的層析柱中，層析柱中的大孔樹脂裝入量為每升層析柱體積裝入O. 5-0. 8kg大孔樹脂； 然后 第一歩用層析柱體積2-10倍量的濃度為35-55%甲醇或こ醇洗脫掉溶解液中的親水性雜質(zhì)； 第二步再用層析柱體積5-10倍量的濃度為60-80%甲醇或こ醇洗脫層析柱得到鵝去氧膽酸溶液； 鵝去氧膽酸溶液按每升加入l_4g碳酸鈉或氫氧化鈉，加熱回收鵝去氧膽酸溶液中的甲醇或こ醇，至鵝去氧膽酸溶液中的甲醇或こ醇濃度在10%以下，冷卻至常溫后過濾，濾液按l_5g/L的量加入エ業(yè)用雙氧水脫色10-24小時后，用鹽酸調(diào)pH值至2. 5-4. 5，再過濾，濾餅用水洗至PH值至中性，低溫烘干濾餅，就得到鵝去氧膽酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法，其特征在于在第ニ步洗脫層析柱后，按層析柱體積5-10倍量的濃度為90%以上甲醇或こ醇再次洗脫層析柱，洗脫后的層析柱下次備用。
全文摘要
一種大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法，其特征在于第一步為微生物溶液制作取動物回腸及大腸，刮出內(nèi)容物；添加水稀釋過濾得到濾液；濾液加入MRS培養(yǎng)基得培養(yǎng)液；分離培養(yǎng)液得沉淀物；加生理鹽水混懸得微生物溶液；第二步為分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸取鴨膽汁，添加微生物溶液得混合液；混合液反應(yīng)過濾出濕游離型膽汁酸；添加水稀釋成稀釋液，加入水飽和的硫酸鎂或氯化鈣反應(yīng)過濾得到游離型膽汁酸鹽；加入甲醇或乙醇回流溶解游離型膽汁酸鹽得溶解液；將溶解液置于裝有大孔樹脂的層析柱中，洗脫層析柱得鵝去氧膽酸溶液；鵝去氧膽酸溶液加入碳酸鈉或氫氧化鈉加熱過濾，濾餅用水洗至pH值中性，低溫烘干就得到鵝去氧膽酸。
文檔編號C12P33/00GK102703556SQ20121017530
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者吳憲君, 吳昱隆, 寧玉蓉, 干文冬 申請人:綿陽勁柏生物科技有限責(zé)任公司