促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備和純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備和純化方法，該方法包括以下步驟：(1)將活化后的毛霉菌接種至固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)后的粗酶液加入無機(jī)絮凝劑沉淀，然后過濾得到半成品；(3)半成品經(jīng)鹽析和層析純化后得到乳糖酶成品。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)中的胞內(nèi)產(chǎn)酶相比較，其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、適合規(guī)?；a(chǎn)，耐熱性高、穩(wěn)定性好、安全穩(wěn)定無污染，作用pH更適宜人體的體內(nèi)生物環(huán)境。
【專利說明】促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備和純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及毛霉培養(yǎng)產(chǎn)酶的制備方法，尤其是一種促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備和純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳糖酶,又被稱為β -半乳糖苷酶(拉丁文名稱:β-Galactosidase),主要用于乳品工業(yè)，可使低甜度和低溶解度的乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)檩^甜的、溶解度較大的葡萄糖和半乳糖；使冰淇淋、濃縮乳、淡煉乳中乳糖結(jié)晶析出的可能性降低，同時(shí)增加甜度。但由于種種原因，大部分人的體內(nèi)缺少上述乳糖酶，造成很多人患有乳糖不耐癥，即人們?cè)陲嬘门Ｄ毯蟪?huì)引起對(duì)牛奶中的主要碳水化合物一乳糖的消化不良，出現(xiàn)腹?jié)q、腸鳴、急性腹痛甚至腹瀉等癥狀，在中國(guó)，根據(jù)科研人員的研究結(jié)果，成年人飲用牛奶后乳糖吸收不良的發(fā)生率高達(dá)86.7%，不耐受指數(shù)為0.9。而乳糖不耐癥的會(huì)導(dǎo)致胃腸失調(diào)，造成有價(jià)值的蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)損失，甚至影響到嬰幼兒的智力發(fā)育，故歐洲不少國(guó)家常將乳糖酶加入牛奶，供嬰兒飲用。
[0003]目前國(guó)內(nèi)乳糖酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還存在著很大的問題，乳糖酶并未得到廣泛應(yīng)用，其主要原因是:乳糖酶的單位產(chǎn)量較低，市場(chǎng)銷售的乳糖酶多為胞內(nèi)酶，需破碎細(xì)胞才能得到，其提取純化工藝復(fù)雜，成本高；酶的作用溫度低，耐熱性差，生產(chǎn)過程中很容易染雜菌，適用范圍窄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用毛霉菌株進(jìn)行胞外產(chǎn)酶的乳糖酶的制備和純化方法，該方法包括以下步驟:
[0005](I)將活化后的毛霉菌(拉丁文名稱=Mucor)接種至固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；
[0006](2)培養(yǎng)后的粗酶液加入無機(jī)絮凝劑沉淀，然后過濾得到半成品；
[0007](3)半成品經(jīng)鹽析和層析純化后得到乳糖酶成品。
[0008]步驟(I)中所述的活化后的毛霉菌株接種量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10~15%。
[0009]步驟(I)中固態(tài)培養(yǎng)基包括:
[0010](I)麩皮、黃豆粉或玉米粉中的一種、兩種或三種；
[0011](2)麥芽糖、蔗糖或乳糖中的一種；
[0012](3)牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的一種；
[0013](4) MnSO4, KH2PO4, NaH2PO4 或 CaCl2 中的一種；
[0014](5)水。
[0015]更優(yōu)選的固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4, NaH2PO4和水，其中麩皮與水的重量比為1: 1.0~2.0，乳糖添加量為0.05~0.lg/mL，蛋白胨添加量為0.04~0.08g/mL，KH2PO4加量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.05~0.15%，NaH2PO4添加量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.10~0.2%。[0016]上述固態(tài)培養(yǎng)基選用已經(jīng)經(jīng)過2-3次發(fā)酵培養(yǎng)后的固態(tài)培養(yǎng)基時(shí)，胞外產(chǎn)酶的效果更好。
[0017]步驟(I)中的培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)溫度為30-50°C，培養(yǎng)時(shí)間為60-80h，培養(yǎng)過程中每24-36h翻曲一次。
[0018]步驟(2)中的無機(jī)絮凝劑為明礬、硫酸鋁或氯化鎂中的一種。
[0019]步驟(3)中的鹽析使用的是硫酸銨分級(jí)沉淀法,層析純化包括Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果在于:
[0021]本發(fā)明以毛霉菌為出發(fā)菌株，在固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，通過單因素和正交試驗(yàn)確定了最佳的固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水、培養(yǎng)后得到的粗酶液經(jīng)無機(jī)絮凝劑硫酸鋁處理后，再經(jīng)過硫酸銨鹽析、Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化制得乳糖酶成品，該成品經(jīng)聚丙烯凝膠酰胺電泳檢驗(yàn)后，其最終比活力512.68±0.25U/mg，乳糖酶得率為44.38%，提純倍數(shù)為35.82，乳糖酶的作用PH為4.5-5.5，在30-60°C有較高的耐受性，在4°C冷藏條件下具有良好的穩(wěn)定性，同現(xiàn)有技術(shù)中的胞內(nèi)產(chǎn)酶相比較，其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、原料成本低、適合規(guī)?；a(chǎn)，制得的乳糖酶耐熱性高、穩(wěn)定性好、安全穩(wěn)定無污染，作用pH更適宜人體的體內(nèi)生物環(huán)境。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023]一種促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備純化方法包括以下步驟:
[0024](I)將活化后的毛霉 菌株接種至固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；
[0025]1.用接種環(huán)直接取凍存的亮色毛霉菌株DZ251，在LB培養(yǎng)基平板表面劃線，于25-32°C培養(yǎng) 36-42 小時(shí)。
[0026]2.挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到3-5ml LB培養(yǎng)基中，于25-32°C培養(yǎng)36-42小時(shí)。
[0027]3.將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)36-42小時(shí)，到0D600 = 0.2-
0.4。
[0028]步驟(I)中的活化后的毛霉菌株接種量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10-15%。
[0029]步驟(I)中的固態(tài)培養(yǎng)基包括:
[0030]①麩皮、黃豆粉或玉米粉中的任意一種；
[0031 ] ②麥芽糖、蔗糖或乳糖中的任意一種；
[0032]③牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的任意一種；
[0033]④MnS04、KH2PO4, NaH2PO4 或 CaCl2 中的任意一種；
[0034]⑤水。
[0035]經(jīng)過單因素和正交試驗(yàn)確定了更優(yōu)選的固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮、乳糖、蛋白胨、ΚΗ2Ρ04、NaH2PO4和水，其中麩皮與水的重量比為1: 1.0-2.0，乳糖添加量為0.05-0.lg/mL，蛋白胨添加量為0.04-0.08g/mL, KH2PO4添加量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.05-0.15%，NaH2PO4添加量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.10-0.2%。
[0036]上述固態(tài)培養(yǎng)基選用已經(jīng)經(jīng)過2-3次發(fā)酵培養(yǎng)后的固態(tài)培養(yǎng)基時(shí)，胞外產(chǎn)酶的效果更好，可提高40~55%的乳糖酶產(chǎn)量。
[0037]步驟(I)中的培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)溫度為30~50°C，培養(yǎng)時(shí)間為60~80h，培養(yǎng)過程中每24~36h翻曲一次，可提高乳糖酶的產(chǎn)量，通過適當(dāng)翻曲可以使物料接種和溫度保持均勻，有利于原料的利用，同時(shí)翻曲也可以延遲孢子出現(xiàn)的時(shí)間，使菌絲分泌更多的酶類。
[0038](2)培養(yǎng)后的粗酶液加入無機(jī)絮凝劑沉淀，然后過濾得到半成品；
[0039]步驟(2)中的無機(jī)絮凝劑為明礬、硫酸鋁或氯化鎂中的一種，其不僅絮凝效果好，而且酶的回收率也高。
[0040]絮凝率的測(cè)定方法是:
[0041]取IOOmL乳糖酶粗酶液置于500mL燒杯中，室溫和自然pH條件下，加入硫酸鋁，快速混勻Imin, 2~3min后再慢速混勻Imin,靜置60min,空白不添加絮凝劑。取上層液稀釋一定倍數(shù)，在620nm處以蒸餾水為參比測(cè)定吸光度OD值。絮凝率(FR)計(jì)算如下:
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備和純化方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)將活化后的毛霉菌接種至固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)； (2)培養(yǎng)后的粗酶液加入無機(jī)絮凝劑沉淀，然后過濾得到半成品； (3)半成品經(jīng)鹽析和層析純化后得到乳糖酶成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備和純化方法，其特征在于:步驟(1)中所述的活化后的毛霉菌株接種量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10-15%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備和純化方法，其特征在于:步驟(I)中所述固態(tài)培養(yǎng)基包括: (1)鉄皮、黃豆粉或玉米粉中的一種、兩種或二種； (2)麥芽糖、蔗糖或乳糖中的一種； (3)牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的一種；
(4)MnSO4, KH2PO4, NaH2PO4 或 CaCl2 中的一種； (5)水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備和純化方法，其特征在于:步驟(1)中所述固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4, NaH2PO4和水，其中麩皮與水的重量比為I: 1.0-2.0，乳糖添加量為0.05-0.lg/mL，蛋白胨添加量為0.04-0.08g/mL，KH2PO添加量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.05-0.15% ,NaH2PO添加量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.10-0.2%。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備和純化方法，其特征在于:所述固態(tài)培養(yǎng)基為經(jīng)過2-3次發(fā)酵培養(yǎng)后的固態(tài)培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備和純化方法，其特征在于:步驟(I)中所述培養(yǎng)的條件是:培養(yǎng)溫度為30-50°C，培養(yǎng)時(shí)間為60-80h，培養(yǎng)過程中每24-36h翻曲一次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備和純化方法，其特征在于:步驟(2)中所述的無機(jī)絮凝劑為明礬、硫酸鋁或氯化鎂中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)毛霉產(chǎn)乳糖酶的制備和純化方法，其特征在于:步驟(3)中所述的鹽析使用的是硫酸銨分級(jí)沉淀法，層析純化包括Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化。
【文檔編號(hào)】C12N9/38GK103451167SQ201210176579
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月31日
【發(fā)明者】劉鼎闊 申請(qǐng)人:鼎正生物藥業(yè)(天津)有限公司