一種檢測(cè)線粒體a3243g雜合突變率的標(biāo)準(zhǔn)品、試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的標(biāo)準(zhǔn)品、試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明所述檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的標(biāo)準(zhǔn)品，包括：（1）含有3243位點(diǎn)為野生型A的線粒體DNA片段的載體；（2）含有3243位點(diǎn)為突變型G的線粒體DNA片段的載體。本發(fā)明提供的質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)方法及用于檢測(cè)數(shù)據(jù)校正的回歸方程能夠很方便、精確地檢測(cè)線粒體DNA中的A3243G雜合突變率，具有高效、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)于突變率低于5%的雜合突變也可以精確、定量地檢出，這是現(xiàn)有的其他突變檢測(cè)手段所不具備的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明也為科研和生產(chǎn)實(shí)踐上其他的雜合突變定量檢測(cè)提供了很好的借鑒意義。
【專利說明】一種檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的標(biāo)準(zhǔn)品、試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的標(biāo)準(zhǔn)品、試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]A3243G突變是線粒體基因組DNA(mito-chondrial DNA, mtDNA)上最常見的致病突變，其常以雜合形式存在，即在一個(gè)細(xì)胞中既存在野生型的mtDNA，也存在突變型的mtDNA。A3243G突變是早發(fā)性糖尿病及神經(jīng)性耳聾等疾病的致病因素之一，A3243G突變率與其引起臨床癥狀的輕重程度相關(guān)。因此，對(duì)于A3243G突變的準(zhǔn)確定量檢測(cè)具有非常重要的意義。mtDNA3243位點(diǎn)處于16S rRNA與tRNALeu(UUR)基因交界處，對(duì)mtDNA3243位點(diǎn)A/G突變的研究發(fā)現(xiàn)A堿基位于tR NALeu (UUR) 二級(jí)結(jié)構(gòu)的雙氫尿嗜陡環(huán)上，在進(jìn)化中高度保守。該位點(diǎn)的突變可能會(huì)使tRNALw(UUR)正常的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響到多肽鏈合成中亮氨酸的摻入。
[0003]目前常用的突變檢測(cè)方法主要有PCR-RFLP、PCR-SSCP, PCR-測(cè)序等，但是這些方法的檢測(cè)靈敏度較低，并且對(duì)于突變率〈5%的雜合突變一般無法檢出。由于應(yīng)用上的需求，目前急需開發(fā)一種新的用于定量檢測(cè)雜合突變的方法及檢測(cè)用試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)目前缺少定量檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品以及現(xiàn)有的對(duì)于A3243G突變的檢測(cè)方法不夠靈敏的現(xiàn)狀，提供一種靈敏度更高的A3243G突變檢測(cè)方法和在定量檢測(cè)中使用的標(biāo)準(zhǔn)品及其試劑盒。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之一為:一種檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的標(biāo)準(zhǔn)品，包括:
[0006](I)含有3243位點(diǎn)為野生型A的線粒體DNA片段的載體；和
[0007](2)含有3243位點(diǎn)為突變型G的線粒體DNA片段的載體。
[0008]本發(fā)明中，所述的3243位點(diǎn)是指人線粒體基因組DNA的第3243位核苷酸。在正常人的線粒體基因組DNA中，mt3243位點(diǎn)為A，病人mtDNA中常常會(huì)突變?yōu)镚。
[0009]本發(fā)明中，所述的含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段是指包括了 3243位點(diǎn)的線粒體基因組DNA片段。優(yōu)選的，所述的3243位點(diǎn)為野生型A的線粒體DNA片段長度為50-1OOObp，更優(yōu)選53bp ；3243位點(diǎn)為突變型G的線粒體DNA片段長度為50_1000bp，更優(yōu)選53bp。最優(yōu)選的，所述的3243位點(diǎn)為野生型A的線粒體DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，3243位點(diǎn)為突變型G的線粒體DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]本發(fā)明中，所述的載體可以是任何常規(guī)載體，如質(zhì)粒、粘粒(pHZ132)、噬菌體或病毒載體(反轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體)等。優(yōu)選的，所述的載體是質(zhì)粒。更優(yōu)選的，所述的載體是T-載體。更佳的是能夠在大腸桿菌中增殖的克隆載體，如pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pUC19，pBlueScriptll SK或pGEM系列載體。最優(yōu)選的，所述的載體是pGEM_T載體。
[0011]本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的含3243位點(diǎn)為野生型A的線粒體DNA片段的載體和含3243位點(diǎn)為突變型G的線粒體DNA片段的載體組成混合物。優(yōu)選的，所述的混合物中含有3243位點(diǎn)為突變型G的線粒體DNA片段的載體的含量占載體總量的O-100%中的任一濃度，含有3243位點(diǎn)為野生型A的線粒體DNA片段的載體的含量為余量，所述的混合物之間形成一系列載體濃度比例梯度。更優(yōu)選的，所述的混合物中含有3243位點(diǎn)為突變型G的線粒體DNA片段的載體的含量分別占載體總量2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%，含有3243位點(diǎn)為野生型A的線粒體DNA片段的載體的含量為余量。
[0012]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的混合物中還包括溶解載體的介質(zhì)，所述的介質(zhì)是任何可以溶解載體的溶劑，較佳的包括水、TE、PBS或者生理鹽水。更優(yōu)選的，所述的混合物中，所述的載體在介質(zhì)中的濃度為各種可用的濃度，可以是Ing/ μ L-1OOng/ μ L,優(yōu)選50ng/ μ L。
[0013]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之二為:一種檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的試劑盒，包括所述的檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0014]其中，所述的標(biāo)準(zhǔn)品如上所述。
[0015]優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括擴(kuò)增含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段的擴(kuò)增引物和用于檢測(cè)含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段的焦磷酸測(cè)序引物中的一種或兩種。所述的擴(kuò)增引物是長度為25±15nt的寡核苷酸鏈，其與線粒體基因組DNA片段完全相同或互補(bǔ)，所述的擴(kuò)增引物只要是能夠擴(kuò)增含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段即可。較佳的，所述的擴(kuò)增引物的核苷酸序列分別如序列表中SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。所述的焦磷酸測(cè)序引物與線粒體基因組DNA片段序列完全相同，只需位于3243位點(diǎn)上游即可，優(yōu)選SEQ ID N0.5所示的引物。
[0016]優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括DNA提取試劑和/或TE緩沖液。
[0017]優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括說明書。該說明書記載了該試劑盒的使用方法，即定量檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的方法，該方法包括以下步驟:
[0018]I)以上述不同百分比的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，采用擴(kuò)增引物擴(kuò)增含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段；
[0019]2)對(duì)步驟I)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序；
[0020]3)根據(jù)步驟2)中焦磷酸測(cè)序的結(jié)果擬定用于數(shù)據(jù)校正的回歸方程；
[0021]4)從待檢樣本中提取DNA;
[0022]5)以步驟4)所得的DNA為模板，采用擴(kuò)增引物擴(kuò)增含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段；
[0023]6)對(duì)步驟5)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序；
[0024]7)對(duì)步驟6)所得的測(cè)序結(jié)果應(yīng)用步驟3)所得的回歸方程進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，即得待檢樣本的線粒體A3243G雜合突變率。
[0025]本發(fā)明中，所述的焦磷酸測(cè)序是本領(lǐng)域常規(guī)的焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)技術(shù)，該技術(shù)無須進(jìn)行電泳，DNA片段也無須進(jìn)行熒光標(biāo)記，操作極為簡(jiǎn)便。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號(hào)，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息，在峰值圖上顯示的峰值高度可以檢測(cè)出混合DNA模板中等位基因的頻率。但是本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，焦磷酸測(cè)序的結(jié)果和實(shí)際值會(huì)有一定的偏差，這種偏差和測(cè)序方法的最佳測(cè)定范圍有關(guān)，在雜合度為50%左右，檢測(cè)值和實(shí)際值基本相同，但是在雜合度越低或者越高的區(qū)域，檢測(cè)值和實(shí)際值的偏差越大；這種偏差和測(cè)序儀的運(yùn)行環(huán)境和運(yùn)行參數(shù)的設(shè)置也有關(guān)，在不同的測(cè)序儀上，這些偏差的程度有些微的區(qū)別。這些偏差的存在對(duì)于實(shí)際檢測(cè)的樣本而言，在結(jié)果分析和應(yīng)用上都會(huì)產(chǎn)生不良影響，有必要克服這些偏差，得到和實(shí)際值接近的檢測(cè)結(jié)果。因此，本發(fā)明人對(duì)焦磷酸測(cè)序的檢測(cè)值采用本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了數(shù)據(jù)校正，獲得了校正所采用的數(shù)據(jù)分析回歸方程，從而使樣本的檢測(cè)值經(jīng)過校正之后更接近于實(shí)際值，有利于結(jié)果的進(jìn)一步精確分析和應(yīng)用。
[0026]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之三為:一種所述的檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，包括如下步驟:
[0027]I)分別從確認(rèn)為A3243G突變的樣本中和非突變的正常樣本中提取DNA ；
[0028]2)采用擴(kuò)增引物對(duì)步驟I)所得的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中包括了線粒體DNA的3243位點(diǎn)；
[0029]3)將步驟2)所得PCR產(chǎn)物分別裝入載體中并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，從而得到野生型載體和突變型載體；
[0030]4)按照野生型和突變型載體的不同比例來制備各濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0031]其中，步驟I)從樣本中提取DNA的方法是常規(guī)方法。比如從病人的外周血樣本中提取DNA，采用基因組DNA提取方法即可提取完整的線粒體DNA。
[0032]步驟2)所述的擴(kuò)增引物是長度為25±15nt的寡核苷酸鏈，其與線粒體基因組DNA片段完全相同或互補(bǔ)，所述的擴(kuò)增引物只要是能夠擴(kuò)增含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段即可。較佳的，所述擴(kuò)增引物的核苷酸序列分別如序列表中SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。步驟2)所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)槌Ｒ?guī)，只要能夠特異性擴(kuò)增得到相應(yīng)的片段即可，較佳的為:① 94°C，5min ;d)94°C，20s ；?55oC,20s ；?72°C,20s ;步驟②至④的循環(huán)數(shù)為 40 ；⑤ 72。。，IOmin。
[0033]步驟3)所述的將PCR產(chǎn)物裝入載體的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，一般用限制性內(nèi)切酶分別酶切PCR產(chǎn)物和載體，然后用連接酶連接即可。所述的載體是本領(lǐng)域可以采用的各種用于裝載外源核酸片段的載體，如質(zhì)粒、粘粒(PHZ132)、噬菌體或病毒載體(反轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體)等。優(yōu)選的，所述的載體是質(zhì)粒。更優(yōu)選的，所述的載體是T-載體。更佳的是能夠在大腸桿菌中增殖的克隆載體，如口此19、？此18，？此118，？此119，？此19，pBlueScript II SK或pGEM系列載體。最優(yōu)選的，所述的載體是pGEM_T載體，測(cè)序的方法也是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，可以采用PCR擴(kuò)增引物中的任一條進(jìn)行測(cè)序。
[0034]步驟4)將兩種載體混合成各個(gè)濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)品，較佳的包括將兩種載體分別定量至一定的濃度，然后按比例混合即可。較佳的如將兩種載體分別定量至IO-1OOng/μ L，然后按比例混合，制備各濃度標(biāo)準(zhǔn)品。所述的濃度是指3243位點(diǎn)為G的突變型載體占全部載體(3243位點(diǎn)為G的突變型和3243位點(diǎn)為A的野生型載體的總和)總量的百分比濃度。
[0035]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之四為:一種定量檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的方法，包括如下步驟:
[0036]I)以上述不同百分比的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，采用擴(kuò)增引物擴(kuò)增含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段；
[0037]2)對(duì)步驟I)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序；
[0038]3)根據(jù)步驟2)中焦磷酸測(cè)序的結(jié)果擬定用于數(shù)據(jù)校正的回歸方程；
[0039]4)從待檢樣本中提取DNA;
[0040]5)以步驟4)所得的DNA為模板，采用引物PCR擴(kuò)增含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段；
[0041]6)對(duì)步驟5)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序；
[0042]7)測(cè)序結(jié)果應(yīng)用步驟3)所得的回歸方程進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，即得待檢樣本的線粒體A3243G雜合突變率。
[0043]其中，步驟4)所述從待檢樣本中提取DNA的方法是常規(guī)方法。比如從病人的外周血樣本中提取DNA，采用基因組提取方法即可提取完整的線粒體DNA。
[0044]步驟I)或5)所述擴(kuò)增的方法同常規(guī)。所述的擴(kuò)增引物是長度為25±15nt的寡核苷酸鏈，其與線粒體基因組DNA片段完全相同或互補(bǔ)，所述的擴(kuò)增引物只要是能夠擴(kuò)增含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段即可。較佳的，所述的擴(kuò)增引物的核苷酸序列分別如序列表中SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。所述PCR擴(kuò)增的條件為常規(guī)，只要能夠特異性擴(kuò)增得到擴(kuò)增片段即可，較佳的為:①94°C，5min ;d)94°C，20s ；?55oC,20s ；?72°C,20s ;步驟②至④的循環(huán)數(shù)為40 72°C，lOmin。
[0045]步驟2)或6)所述焦磷酸測(cè)序的方法也是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，可以采用如SEQ IDN0.5所示的焦磷酸測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。
[0046]步驟7)所述數(shù)據(jù)校正是對(duì)待測(cè)樣本的焦磷酸測(cè)序結(jié)果采用所述的回歸方程進(jìn)行數(shù)值校正，從而得出最終的計(jì)算結(jié)果；該校正方程優(yōu)選為Y=-0.0000737578382X3+0.01054497865X2+0.71548332X-0.63357639446。
[0047]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供的線粒體A3243G雜合突變率的檢測(cè)方法靈敏度高，定量準(zhǔn)確，更可以檢測(cè)出其他常規(guī)檢測(cè)方法無法檢測(cè)的突變率低于5%的雜合突變，具有極大的應(yīng)用價(jià)值和理論意義，也為科研和生產(chǎn)實(shí)踐中其他的突變檢測(cè)提供了很好的啟
/Jn ο【專利附圖】

【附圖說明】[0048]以下結(jié)合【專利附圖】

【附圖說明】本發(fā)明的特征和有益效果。[0049]圖1為0%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖；[0050]圖2為2%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖；[0051]圖3為5%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖；[0052]圖4為10%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖；[0053]圖5為20%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖；[0054]圖6為30%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖；[0055]圖7為40%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖；[0056]圖8為50%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖；[0057]圖9為60%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖；
[0058]圖10為70%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖
[0059]圖11為80%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖
[0060]圖12為90%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖
[0061]圖13為95%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖
[0062]圖14為100%標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖；
[0063]圖15為利用軟件校正后的結(jié)果和回歸方程；
[0064]圖16為陰性檢測(cè)樣本F932-4的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖；
[0065]圖17為陽性檢測(cè)樣本F1096-8的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖；
[0066]圖18為弱陽性檢測(cè)樣本F625-5的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖。 【具體實(shí)施方式】
[0067]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0068]實(shí)施例1標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0069]1、分別從確認(rèn)為A3243G突變的病人和非突變的正常人外周血中提取DNA，采用QIAGEN公司的外周血DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。
[0070]2、采用擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中包括了 A3243G突變所在的位點(diǎn)；
[0071]引物序列分別為:
[0072]MT3243-F (序列表中 SEQ ID N0.3):
[0073]5， -AGAACAGGGTTTGTTAAGATGGC-3，；
[0074]MT3243-R (序列表中 SEQ ID N0.4):
[0075]5’ -GTTTTAAGTTTTATGCGATTACCG-3’
[0076]弓丨物MT3243-R的5’采用了生物素標(biāo)記。
[0077]PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?
[0078]①94°C，5min ;@94°C，20s ;@55°C，20s ;@72°C，20s ;步驟②至④的循環(huán)數(shù)為40 ；? 72°C, IOmin0
[0079]3、將PCR產(chǎn)物分別裝入pGEM-T載體中，由于PCR產(chǎn)物末端均帶有一個(gè)突出的A，而pGEM-T載體帶有一個(gè)突出的T，因此PCR產(chǎn)物無需經(jīng)過酶切即可直接與pGEM-T載體進(jìn)行粘性末端連接。
[0080]4、采用常規(guī)測(cè)序方法驗(yàn)證裝入載體中的3243位點(diǎn)序列，分別取野生型和突變型的載體作為0%和100%的標(biāo)準(zhǔn)品；
[0081]I)擴(kuò)增正常人的外周血樣本獲得的PCR產(chǎn)物全序列為序列表中SEQ IDN0.1所示。含有該序列的載體命名為MT3243-0。
[0082]2)擴(kuò)增突變病人的外周血樣本獲得的PCR產(chǎn)物全序列為序列表中SEQID N0.2所示。含有該序列的載體命名為MT3243-100。
[0083]5、將上述兩種載體純化后分別用TE進(jìn)行稀釋，并定量到50ng/ μ L。
[0084]6、按照一定的比例混合MT3243-0和MT3243-100兩種載體，分別制備2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%的標(biāo)準(zhǔn)品；配制各濃度標(biāo)準(zhǔn)品所使用的MT3243-0和MT3243-100載體用量如下表所示:
[0085]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于，包括:(1)含有3243位點(diǎn)為野生型A的線粒體DNA片段的載體；和(2)含有3243位點(diǎn)為突變型G的線粒體DNA片段的載體。
2.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于，所述的3243位點(diǎn)為野生型A的線粒體DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的3243位點(diǎn)為突變型G的線粒體DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于，所述的載體是質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于，所述的含有3243位點(diǎn)為野生型A的線粒體DNA片段的載體和含有3243位點(diǎn)為突變型G的線粒體DNA片段的載體組成混合物；所述的混合物中含有3243位點(diǎn)為突變型G的線粒體DNA片段的載體的含量占載體總量的O-100%中的任一濃度，含有3243位點(diǎn)為野生型A的線粒體DNA片段的載體的含量為余量，所述的混合物之間形成一系列載體濃度比例梯度。
5.如權(quán)利要求4所述的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于，所述的混合物中還包括溶解載體的介質(zhì)。
6.一種檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的試劑盒，其特征在于，其包括如權(quán)利要求f 5任一項(xiàng)所述的檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的標(biāo)準(zhǔn)品。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括擴(kuò)增含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段的擴(kuò)增引物、含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段的焦磷酸測(cè)序引物、DNA提取試劑、TE緩沖液和說明書中的任何一種或多種。
8.—種如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:O分別從確認(rèn)為A3243G突變的樣本中和非突變的正常樣本中提取DNA ；2)采用擴(kuò)增引物對(duì)步驟I)所得的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中包括了線粒體DNA的3243位點(diǎn)；3)將步驟2)所得的PCR產(chǎn)物分別裝入載體中并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，從而得到野生型載體和突變型載體；4)按照野生型和突變型載體的不同比例來制備各濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)品。
9.一種定量檢測(cè)線粒體A3243G雜合突變率的方法，其特征在于，包括如下步驟:1)以權(quán)利要求4-5任一項(xiàng)所述的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，采用擴(kuò)增引物擴(kuò)增含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段；2)對(duì)步驟I)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序；3)根據(jù)步驟2)中焦磷酸測(cè)序的結(jié)果擬定用于數(shù)據(jù)校正的回歸方程；4)從待檢樣本中提取DNA;5)以步驟4)所得的DNA為模板，采用擴(kuò)增引物擴(kuò)增含3243位點(diǎn)的線粒體DNA片段；6)對(duì)步驟5)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序；7)測(cè)序結(jié)果應(yīng)用步驟3)所得的回歸方程進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，即得待檢樣本的線粒體A3243G雜合突變率。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟I)或5)所述擴(kuò)增引物的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示；所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?①94°C，5min ;②94°C，20s ;@55°C，20s ;@72°C，20s ;步驟②至④的循環(huán)數(shù)為40 ;?72°C，IOmin ;所述的回歸方程為Y=0.000073757382X3+0.01054497865X2+0.71548332X-0.63357639446。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103451268SQ201210178055
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月31日
【發(fā)明者】曾溢滔, 顏景斌, 曾凡一, 方彧聃 申請(qǐng)人:上海市兒童醫(yī)院, 上海凡翼生物科技有限公司