專利名稱：生產(chǎn)安絲菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到一種改進的生產(chǎn)安絲菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基，屬于生物工程與技術領域。
背景技術：
安絲菌素(Ansamitocin)是珍貴束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)產(chǎn)生的美登素類(Maytansinoid)抗腫瘤抗生素。其母核為19-C的大環(huán)內(nèi)酰胺環(huán)(安莎類)或I型多聚酮類，C-3側鏈連接有不同長度的碳鏈，主要成分為AP3，其側鏈為異丁?；?本說明書中用AP3代指安絲菌素P3)。AP3的分子量為635.2，分子式為C32H43ClN2O9，難溶于水(純水中溶解度20mg/L，室溫常壓)，易溶于甲醇、乙醇，丙酮，氯仿，乙腈等溶劑。AP3分之式見附圖1。安絲菌素具有很強的真核細胞毒性和抗腫瘤活性，作用機理是覆蓋微管的長春花堿結合點，從而阻止了微管的聚合。無論臨床前、臨床研究還是最終藥物生產(chǎn)，都需要足夠的安絲菌素原料，因此大規(guī)模高產(chǎn)工藝也是研究的重點之一。目前報道的安絲菌素AP3最高產(chǎn)量是，使用的是基因突變株 Actinosynnema pretiosum PF4-4 (ATCC PTA-3921)在 900L 發(fā)酵罐規(guī)模中 304mg/L,20mL/250-mL 搖床中 435mg/L (專利 CN 101103120A, WO 03/064610A2)。對于常用的標準菌種 Actinosynnema Pretiosum Ssp.Aurantium (ATCC 31565),報道的最高產(chǎn)量是 86mg/L，最大規(guī)模是1100L (CN 1432068A);搖床階段，標準菌種的400多例的搖瓶統(tǒng)計學效價為61±35mg/L，極大值最高不超過 221mg/L (W0 03/064610A2)。在中國，安絲菌素的發(fā)酵技術研究文獻很少，主要是采用固體發(fā)酵(CN101319241A,2008 ；CN 1490322A，2003，沒有效價報道和效價低于40mg/L)。最近的文獻是搖瓶液體發(fā)酵效價68mg/L (韓國配方)(JINXIA LIN，2010)。對AP3 發(fā)酵配方的研究，文獻(CN 101103120A,2005 ；W003/064610 A2，2003)列舉
了很多配方，其主要培養(yǎng)基組分是:糊精、麥芽糖、Proflo (棉籽粉)、大豆粉、玉米漿蛋白等，并公開部分突變株在各種配方中的AP3效價表現(xiàn)，但沒有詳述各組分的最佳濃度范圍。韓國有幾篇文獻(BANDI等，2005，2006)公開了培養(yǎng)基配方組份篩選的研究過程。韓國2005年發(fā)表的論文中，作者先用Plackett-Burman法篩選因子，11個組分入選:葡萄糖、麥芽糖、糊精、蔗糖、酵母抽提物、豆餅粉、酸水解酪素、Polypeptone (多聚肽粉)、玉米漿、棉籽粉、豆胨。從中選出四個:蔗糖、糊精、多聚肽粉、酵母抽提物，經(jīng)過2輪RSM CCD(響應曲面法中心組合設計)篩選出最佳濃度范圍:4.5%蔗糖、4.5%糊精、0.16%多聚肽粉和0.86%酵母抽提物。搖瓶30mL/250mL使用ATCC 31565標準菌種的表達效價是45.2mg/L。韓國2006年發(fā)表的論文中，使用了突變改造的asm-菌種，用2輪RSMCCD篩選出最佳濃度范圍:糊精6.0%、麥芽糖3.0%、棉籽粉0.53%和酵母抽提物0.45%。30mL/250mL搖瓶asm-菌種AP3效價最高點79.0mg/Lo而韓國(Ychang, 2004)在更早的時候還發(fā)表了會議論文，有顯著影響的培養(yǎng)基成分是葡萄糖、酵母抽 提物、麥芽抽提物、乳糖、KH2PO4和CaCO3,沒有報道實際的AP3效價。
總的來看，培養(yǎng)基的主要C源是糊精、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖；而主要N源則很多:棉籽粉、大豆粉、玉米漿、多聚肽粉、酵母抽提物。明顯，C源成分比較穩(wěn)定，而N源都是有機復合物，成分復雜，不同來源和批號的N源很難保持發(fā)酵原料質(zhì)量的穩(wěn)定。珍貴束絲放線菌也能代謝硝酸鹽(USP 4356265，1982)和銨鹽。專利(WO 03/064610A2，2003)中一個配方也含有(NH4)2SO40.05%w/v。然而，林錦霞等(JINXIA LIN，2010)研究了培養(yǎng)基中銨離子對AP3產(chǎn)率、關鍵酶活和轉錄活率的影響。其結論是銨離子能顯著降低AP3效價，但對生物量、糖耗、異丁醇的消耗影響不大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是探索一種安絲菌素AP3高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中包含簡單氮源。具體是指含乙酸銨的培養(yǎng)基，此乙酸銨可在發(fā)酵的前中期加入。而單獨的氨(銨根)對AP3起抑制作用，而單獨使用其他乙酸鹽不能顯著提高產(chǎn)量，但是兩者結合卻能顯著提高AP3效價。本發(fā)明的基礎培養(yǎng)基經(jīng)過優(yōu)化后，平均效價能達到100到220mg/L，顯著高于現(xiàn)有技術采用標準菌種發(fā)酵所能達到的效價(86mg/L)。本發(fā)明的第一方面提供一種生產(chǎn)安絲菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含銨根離子和乙酸根離子。在一個實施方案中，所述培養(yǎng)基包含乙酸銨。在一個優(yōu)選實施方案中，所述培養(yǎng)基包含0.35w/v%的乙酸銨。在一個實施方案中，所述培養(yǎng)基包含硫酸銨和乙酸鈉。在一個優(yōu)選實施方案中，所述培養(yǎng)基包含0.22w/v%的硫酸銨和0.07w/v%的乙酸鈉。在一個實施方案中，所述培養(yǎng)基還包含以下組分:麥芽糊精、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、玉米蛋白、CaC03、NaOH, K2HPO4.3H20和異丁醇，其中異丁醇在接種之前加入。在一個優(yōu)選實施方案中，麥芽糊精的量為0.1-1.5w/w%、可溶性淀粉的量為0.1-1.0w/w%、蔗糖的量為0.1-1.0w/w%、葡萄糖的量為0.1-1.5w/w%、麥芽糖的量為0.5-10.0w/w%,玉米蛋白的量為 0.5-10.0w/w%、CaCO3 的量為 0.1-1.0w/w%、NaOH 的量為 0.01-0.4w/w%、K2HPO4.3H20 的量為 0.01-0.4w/w%，異丁醇的量為 0.01-0.60v/v%。本發(fā)明的第二方面提一種生產(chǎn)安絲菌素的方法，其特征在于，包含以下步驟:I)挑取標準菌種 Actinosynnema Pretiosum Ssp.Aaurantium (ATCC 31565)的平板種子培養(yǎng)為種子液；2)將種子液在包含本發(fā)明第一方面培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)；3)收獲發(fā)酵液；4)純化、精制得到安絲菌素。在一個實施方案中，使用的菌種為標準菌種Actinosynnema Pretiosum Ssp.Aaurantium (ATCC 31565)。以下實例僅是列舉典型情況，同領域的專家應能擴展和延伸其發(fā)酵條件。


圖1安絲菌 素的分子結構。圖2顯示的是搖瓶中各種銨鹽和乙酸鹽各自單獨添加對AP3發(fā)酵效價的影響。
圖3顯示的是5-L發(fā)酵的AP3生產(chǎn)曲線。圖4顯示的是IO-L發(fā)酵的AP3生產(chǎn)曲線。圖5是AP3參照品的三波長HPLC圖譜。這也是最后純化、精制的AP3純品。圖6是IO-L發(fā)酵收獲的發(fā)酵液HPLC圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明使用的菌株是標準菌種Actinosynnema Pretiosum Ssp.Aurantium (ATCC31565)。菌株用甘油凍存管_20°C保存。使用3級菌種庫保存，保存方法參見文獻(SENCHITANIDA, 1980)。菌種復蘇和擴增使用的是種子培養(yǎng)基(BANDI等，2005，2006)，見表I。種子培養(yǎng)是搖瓶接種后培養(yǎng)2-3天，轉接。培養(yǎng)條件同搖瓶發(fā)酵條件。表1.種子培養(yǎng)VT肉湯培養(yǎng)基
權利要求
1.一種生產(chǎn)安絲菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含銨離子和乙酸根。
2.權利要求I的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含乙酸銨。
3.權利要求I或2的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含O.1-1. Ow/v%的乙酸銨。
4.權利要求I的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含硫酸銨和乙酸鈉。
5.權利要求4的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含O.l-1.0w/v%的硫酸銨和O.1-1. Ow/v%的乙酸鈉。
6.權利要求1-5任一項的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基還包含以下組分麥芽糊精、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、玉米蛋白、CaC03、NaOH, K2HPO4. 3H20和異丁醇，其中異丁醇在接種之前加入。
7.權利要求6的培養(yǎng)基，其特征在于，麥芽糊精的量為O.1-1. 5w/w%、可溶性淀粉的量為O. 1-1. 0w/w%、蔗糖的量為O. 1-1. 0w/w%、葡萄糖的量為O. 1-1. 5w/w%、麥芽糖的量為O.5-10. 0w/w%、玉米蛋白的量為 O. 5-10. 0w/w%、CaC03 的量為 O. 1-1. 0w/w%、NaOH 的量為O.01-0. 4w/w%、K2HPO4. 3H20 的量為 O. 01-0. 4w/w%，異丁醇的量為 O. 01-0. 60v/v%。
8.—種生產(chǎn)安絲菌素的方法，其特征在于，包含以下步驟 1)將發(fā)酵菌種培養(yǎng)為種子液； 2)將種子液接種于包含權利要求1-6任一項的培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)； 3)收獲發(fā)酵液； 4)純化、精制得到安絲菌素。
9.權利要求8的方法，其特征在于，使用的發(fā)酵菌種為標準菌種ActnosynnemaPretiosum Ssp. Aurantium (ATCC 31565)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包含銨離子和乙酸根或者包含乙酸銨的高效產(chǎn)生抗生素安絲菌素AP3的發(fā)酵新培養(yǎng)基，優(yōu)選地，該發(fā)酵新培養(yǎng)基中乙酸銨的量為0.1-1.0w/v%。以及利用該發(fā)酵新培養(yǎng)基高效生產(chǎn)安絲菌素AP3的發(fā)酵生產(chǎn)的方法。
文檔編號C12P17/18GK103255184SQ20121017827
公開日2013年8月21日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權日2012年2月15日
發(fā)明者丁靖志, 倪穗佳, 孟銳奇, 李勝峰 申請人:百奧泰生物科技(廣州)有限公司