專利名稱：溶血性鏈球菌檢測用引物組及方法
溶血性鏈球菌檢測用弓I物組及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域，涉及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，具體涉及一種溶血性鏈球菌檢測用引物組及方法。
背景技術(shù)：
溶血性鏈球菌在自然界中分布較廣，存在于水、空氣、塵埃、糞便及健康人和動物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通過直接接觸、空氣飛沫傳播或通過皮膚、粘膜傷口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也會對人類進行感染。(I) a-溶血性鏈球菌菌落周圍有l(wèi)-2mm寬的草綠色溶血環(huán)，也稱甲型溶血，這類鏈球菌多為條件致病菌。(2) P -溶血性鏈球菌菌落周圍形成一個2-4mm寬、界限分明、完全透明的無色溶血環(huán)，也稱乙型溶血，因而這 類菌亦稱為溶血性鏈球菌，該菌的致病力強，常引起人類和動物的多種疾病。溶血性鏈球菌常可引起皮膚、皮下組織的化膿性炎癥、呼吸道感染、流行性咽炎的爆發(fā)性流行以及新生兒敗血癥、細菌性心內(nèi)膜炎、猩紅熱和風(fēng)濕熱、腎小球腎炎等變態(tài)反應(yīng)。溶血性鏈球菌的致病性與其產(chǎn)生的毒素及其侵襲性酶有關(guān)。上呼吸道感染患者、人畜化膿性感染部位常成為食品污染的污染源。一般來說，溶血性鏈球菌常通過以下途徑污染食品1、食品加工或銷售人員口腔、鼻腔、手、面部有化膿性炎癥時造成食品的污染；2、食品在加工前就已帶菌、奶?；蓟撔匀橄傺谆蛐笄菥植炕摃r，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包裝不善而使食品受到污染。雖然傳統(tǒng)溶血性鏈球菌檢測方法是可靠的，但卻很費力、耗時，需要4 7天才能完成。由于其檢測周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點已遠遠不能滿足現(xiàn)代檢測要求。因此，在需要及時、快速評價食品中微生物的安全性時，通常不被采用。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們已創(chuàng)建了不少快速、簡便、特異、敏感且適用的溶血性鏈球菌檢測方法，其中許多可以在48h內(nèi)檢出溶血性鏈球菌，這些方法通稱為快速檢測。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)是日本的榮研株式會的Notomi T等2000年在Nucleic. Acids. Res.雜志上報道的一種新的核酸擴增方法。LAMP方法是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異的引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件保溫幾十分鐘，完成核酸擴增反應(yīng)?？梢栽贗小時之內(nèi)，將靶基因DNA片段擴增109-1010倍，并且只要用肉眼觀察白色混濁沉淀，就能鑒定是否擴增，不需要電泳檢測過程。LAMP方法的原理決定了它具有許多其它DNA擴增方法無法比擬的優(yōu)點(I)操作簡單，無需特殊設(shè)備。LAMP反應(yīng)在等溫狀態(tài)下就能進行，無需預(yù)先進行雙鏈的變性。同時LAMP反應(yīng)不需要特殊儀器和試劑，只需要將PCR反應(yīng)中的Taq DNA聚合換成具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶。(2)靈敏度高。LAMP方法能檢測到比PCR方法還少的拷貝數(shù)，其靈敏度可以比PCR法高10 100倍。(3)特異性強。LAMP應(yīng)體系要求四條引物完全匹配才能進行擴增，信息量大，因此反應(yīng)體系中的其他模板對反應(yīng)的干擾很小。(4)速度快，耗時短。LAMP反應(yīng)不需要加熱變性，省去了熱循環(huán)步驟，40 60min即完成擴增反應(yīng)。(5)可直接擴增RNA。擴增RNA時，只要在擴增DNA試劑的基礎(chǔ)上加上逆轉(zhuǎn)錄酶和酶阻抑劑，就能一步實現(xiàn)RNA的擴增?？茖W(xué)家們已經(jīng)建立了逆轉(zhuǎn)錄LAMP (RT-LAMP)方，該方法的靈敏度是RT-PCR方法的100倍。(6)產(chǎn)物檢測方便、快捷。LAMP反應(yīng)只要用肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度就能夠判斷擴增與否，進行實時驗證。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的一個技術(shù)問題是，提供一種對溶血性鏈球菌具有特異性的引物組。上述技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種溶血性鏈球菌檢測用引物組，其特征在于，包括下列引物
F3 引物CAGTCAATCCTCGGTCAG ；B3 引物GAITTCACATAAGGATGTGTCTA ；FIP 引物:CAGTATGTATGGCAGGTATCGAAGTAAACAGGTCTTGATGTTAGCCTG ；BIP 引物GCGTGGGCTTGATAGGTGGACGTTTATACGGTCCTTCGTAAAGC。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是，提供一種利用上述引物組基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法檢測溶血性鏈球菌的方法。上述技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種溶血性鏈球菌的檢測方法，具體為(101)對待檢樣品提取待檢I旲板DNA待檢樣品用增菌液進行培養(yǎng)，得待檢增菌液，取ImL待檢增菌液，7000Xg離心2min，盡量吸棄上清液；加入80 ii L DNA提取液，混勻后沸水浴lOmin，置冰上IOmin ；7000 X g離心2min，取上清液作為待檢模板DNA ；(102)溶血性鏈球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增按下述LAMP反應(yīng)體系，在反應(yīng)管中加入相應(yīng)反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶，混勻，然后加入穩(wěn)定液，最后在反應(yīng)管中加入待檢模板DNA，進行65°C環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)60min ；LAMP反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.一種溶血性鏈球菌檢測用引物組，其特征在于，包括下列引物 F3 引物CTC ACA ATC GTC TTA GTA ； B3 引物CAT AAC ACA CTG GGT TCT TGA AT ； FIP引物CTC TAT GAA TCG CCG GTC TAG ATG TAG ACT GCT CAT GTT GTT AGC CTG ； BIP引物CTT CGT GCA TGA TAG GTG GAC GTG AAT CGG GTC AAT CCT ATA GC。
2.—種溶血性鏈球菌的檢測方法，其特征在于，具體為 (101)對待檢樣品提取待檢模板DNA 待檢樣品用增菌液進行培養(yǎng)，得待檢增菌液，取ImL待檢增菌液，7000 X g離心2min，吸棄上清液；加入80iiL DNA提取液，混勻后沸水浴lOmin，置冰上IOmin ;7000 X g離心2min，取上清液作為待檢模板DNA ； (102)溶血性鏈球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 按下述LAMP反應(yīng)體系，在反應(yīng)管中加入相應(yīng)的引物、dNTPs、ThermoPol緩沖液、MgS04、Bst DNA聚合酶、水,混勻,然后加入甜菜堿,最后在反應(yīng)管中加入待檢模板DNA,進行65°C環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)60min ；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的溶血性鏈球菌的檢測方法，其特征在于，當(dāng)LAMP反應(yīng)體系的總體積為25 u L, LAMP反應(yīng)體系具體為
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的溶血性鏈球菌的檢測方法，其特征在于，所述標準菌株模板DNA，通過如下方法取得將溶血性鏈球菌標準菌株接種于葡萄糖肉浸液肉湯中36°C ±1°C培養(yǎng)18h 24h，用無菌生理鹽水稀釋至約IO6 108CFU/mL(約麥氏濁度0. 4)，得稀釋液，然后取ImL稀釋液加到I. 5mL無菌離心管中，7000 X g離心2min,吸棄上清液；加入80 y LDNA提取液，混勻后沸水浴lOmin，置冰上IOmin ;7000Xg離心2min，取上清液作為標準菌株模板 DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種溶血性鏈球菌檢測用引物組，包括下列引物F3引物CTC ACAATC GTC TTA GTA；B3引物CAT AAC ACA CTG GGT TCT TGAAT；FIP引物CTC TAT GAA TCG CCG GTC TAG ATG TAG ACT GCT CATGTT GTT AGC CTG；BIP引物CTT CGT GCA TGA TAG GTG GAC GTGAAT CGG GTC AAT CCT ATA GC。本發(fā)明還提供一種使用上述引物組檢測溶血性鏈球菌的方法。本發(fā)明的檢測方法具有特異性高、重復(fù)性好、快速可靠的優(yōu)點，為溶血性鏈球菌的檢測提供一強力有效的手段。
文檔編號C12N15/11GK102747149SQ20121017919
公開日2012年10月24日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者馮家望, 唐食明, 游淑珠, 王小玉, 胡松楠, 鄺筱珊 申請人:馮家望, 唐食明, 王小玉