專(zhuān)利名稱(chēng)：體外誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和增殖的紅桂木凝集素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用植物凝集素誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)成熟和増殖的方法，特別涉及紅桂木凝素誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和増殖的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
植物凝集素是ー類(lèi)具高度特異的糖結(jié)合活性的蛋白，其最大的特點(diǎn)在于識(shí)別糖蛋白和糖脂，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜結(jié)構(gòu)的糖鏈即細(xì)胞膜表面決定簇。植物凝集素能與動(dòng)物、植物、微生物細(xì)胞發(fā)生特異的作用，引起或增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)吞作用或細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)，誘發(fā)一定的生理效應(yīng)。它可以?xún)?chǔ)存物質(zhì)；抵御細(xì)菌、真菌、病毒等病原體的入侵；還作為促有絲分裂因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。由于凝集素能選擇性地識(shí)別細(xì)胞膜糖脂或糖蛋白糖鏈的不同糖基，在生化、醫(yī)學(xué)上，植物凝集素常用于細(xì)胞的分型、分離、糖蛋白和有絲分裂原的純化、癌化學(xué)的研究等。隨著基因工程的發(fā)展，植物凝集素已成為一種很有潛カ對(duì)抗疾病的工具，在免疫學(xué)、腫瘤、生物學(xué)等方面得到諸多應(yīng)用。紅桂木凝集素(Artocarpus LingnanensisLectin, ALL)是我們的相關(guān)研究人員對(duì)30多種生長(zhǎng)在廣西東南部地區(qū)的植物種子經(jīng)過(guò)精心篩選出來(lái)的植物凝集素，前期研究表明它具有很強(qiáng)的促進(jìn)T淋巴細(xì)胞増殖活性。在抗腫瘤免疫治療中，DC是目前已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，外周的DC攝取外來(lái)抗原后，保留并提呈此抗原，同時(shí)發(fā)生遷移，進(jìn)入淋巴結(jié)內(nèi)初始T細(xì)胞循環(huán)池，能顯著地刺激初始型T細(xì)胞増殖，啟動(dòng)、調(diào)控、維持免疫應(yīng)答；能遞呈抗原給MHCI類(lèi)限制性⑶8+和MHC II類(lèi)限制性⑶4+T淋巴細(xì)胞，把加工處理的抗原肽提呈在細(xì)胞膜表面上，并表達(dá)高水平的協(xié)同刺激分子和粘附分子，以保證與T細(xì)胞結(jié)合并促進(jìn)T細(xì)胞的有效激活，誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。DC在體內(nèi)分布廣泛，但數(shù)量少(僅占外周血單個(gè)核細(xì)胞的1%左右)且分散，但可由CD34+細(xì)胞或單核細(xì)胞誘導(dǎo)、衍生、增殖培養(yǎng)。目前培養(yǎng)DC的細(xì)胞因子組合方案有多種，在培養(yǎng)基中僅加入rhGM-CSF和rhIL-4，只能培養(yǎng)出不成熟的DC。目前通常采用TNF-α ,IFN-Y等在體外誘導(dǎo)DC的成熟，而TNF-α價(jià)格昂貴。為解決這ー問(wèn)題，我們從正常人外周血分離單核細(xì)胞，經(jīng)重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白細(xì)胞介素4 (rhIL-4)和紅桂木凝集素聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)8d，獲得成熟DC，為DC的進(jìn)ー步研究及應(yīng)用免疫治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。經(jīng)檢索，紅桂木凝集素誘導(dǎo)人外周血樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和増殖未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種體外誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和増殖的紅桂木凝集素。本發(fā)明的又一目的在于利用紅桂木凝集素制備成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的ー種體外誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和増殖的紅桂木凝集素，其特征在于添加紅桂木凝集素作為誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和増殖的專(zhuān)用培養(yǎng)基，是在樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)因子和紅桂木凝集素；所述樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)基是含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基；所述的專(zhuān)用培養(yǎng)基紅桂木凝集素的濃度是22-220 μ g/mL。以上所述的專(zhuān)用培養(yǎng)基紅桂木凝集素的濃度是44 μ g/mL。紅桂木凝集素的誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和增殖的方法，是在樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)基中加入樹(shù)突狀細(xì)胞的前體細(xì)胞和誘導(dǎo)因子，培養(yǎng)到第6天時(shí)，加入紅桂木凝集素，繼續(xù)培養(yǎng)2天，制備成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞；所述的前體細(xì)胞來(lái)自人外周血單個(gè)核細(xì)胞。以上所述的誘導(dǎo)因子為GM-CSF和IL-4，誘導(dǎo)因子在加入樹(shù)突狀細(xì)胞的前體細(xì)胞的第一天加入，所述的GM-CSF的濃度為15ng/mL，所述的IL-4的濃度為15ng/mL。以上所述的培養(yǎng)溫度為37°C，CO2濃度為5%，濕度為飽和濕度，每2天換一次新鮮的培養(yǎng)基。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果 I.本發(fā)明利用本教研室自行發(fā)現(xiàn)的紅桂木凝集素誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和増殖，所獲得的樹(shù)突狀細(xì)胞高表達(dá)⑶83、⑶86、⑶40、HLA-DR等，抗原遞呈能力增強(qiáng)，因此本發(fā)明為進(jìn)ー步開(kāi)展對(duì)DC的深入研究及臨床免疫治療打下了基礎(chǔ)，為臨床實(shí)體腫瘤的生物治療提供一條新的路徑，也為進(jìn)一歩開(kāi)發(fā)疫苗增強(qiáng)劑提供了新型有效的途徑。2.本發(fā)明紅桂木凝集素在體外能誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12和TNF- α，從而誘導(dǎo)ThO細(xì)胞向Thl方向分化。Thl細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，在誘發(fā)器官特異性自身免疫病，器官移植排斥反應(yīng)和抗感染免疫中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。3.本發(fā)明的誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和増殖的專(zhuān)用培養(yǎng)基，克服了目前在培養(yǎng)基中僅加入rhGM-CSF和rhIL-4，只能培養(yǎng)出不成熟的DC和采用TNF α、IFN- Y等在體外誘導(dǎo)DC的成熟而TNF-α和IFN-Y價(jià)格昂貴的問(wèn)題。4.本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，方便實(shí)用，與現(xiàn)有的方法相比利用的細(xì)胞因子少，費(fèi)用低，且細(xì)胞成熟度高，功能強(qiáng)，在樹(shù)突狀細(xì)胞的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用具有廣泛的前景。


圖I :細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)圖片；圖I 的說(shuō)明a-ALL 濃度為 O ;b_ALL 濃度為 44 μ g/mL ;c_ALL 濃度為 220 μ g/mL ；d-TNF α 濃度為 50ng/mL。圖2 =ELISA法檢測(cè)TNF a的含量。圖3 =ELISA法檢測(cè)IL-12的含量。圖4 :流式細(xì)胞術(shù)鑒定DC表面標(biāo)志；圖4的說(shuō)明a_CDla的表達(dá)；b_CD83的表達(dá)；c_CD86的表達(dá)；d_CD40的表達(dá)；e-HLA-DR的表達(dá)。圖5 =ALL誘導(dǎo)的DC促進(jìn)異體T細(xì)胞増殖。圖6 :ALL促進(jìn)DC增殖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)ー步具體的說(shuō)明。實(shí)施例I紅桂木凝集素的獲得紅桂木凝集素的分離純化的所有操作，均在4°C下進(jìn)行。先取紅桂木種子30g，粉碎研磨，按1:5的比例加入O. Olmol/L含O. lmol/L NaCl,pH7. 2的磷酸鹽緩沖溶液150mL,磁力攪拌器攪拌2h，浸泡抽提24h。抽提液凝血活力在29-2n之間。將抽提液過(guò)濾，濾液以3000rpm離心15min,于上清液中加入硫酸銨至30%飽和度。3000rpm離心20min,棄沉淀物。上清液同上法加入硫酸銨至60%飽和度，放置12h。3000rpm離心20min。棄上清液，用少量O. 01mol/L含O. lmol/L NaCl,pH7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖溶液溶解沉淀。將粗提液依次對(duì)流水、蒸餾水透析，最后對(duì)O. Olmol/L含O. lmol/L NaCl,pH7. 2的磷酸鹽緩沖溶液透析至無(wú)NH4+。3000rpm離心20min,將上清液上Gal-Sepharose 6B親和層析柱，以O(shè). Olmol/L磷酸鹽緩沖溶液洗脫，當(dāng)A 280降至O. 05后，換O. 2m0l/m0L半乳糖溶液繼續(xù)洗脫。收集洗脫峰，透析及超濾除去半乳糖。超濾液經(jīng)冷凍干燥備用。所得紅桂木凝集素凍干粉經(jīng)O. Olmol/L磷酸鹽緩沖液溶解，O. 22 um過(guò)濾器除菌，用BCATM試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，并配制不同濃度的 ALL 溶液22 μ g/mL>44 μ g/mL、220 μ g/mL。實(shí)施例2成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)I.分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC):抽取健康人靜脈血50ml，注入到含有肝素鈉溶 液的無(wú)菌采血管中緩慢搖勻，再加入等量的無(wú)菌PBS緩沖液混勻。取5ml淋巴細(xì)胞分離液加入到15ml離心管中，將血液稀釋液沿管壁緩緩疊加于分離液上，形成清晰的界面。血液稀釋液與分離液的容積比例以2:1-3:1為宜，靜置IOmin后，2000rpm常溫離心20min。用滴管吸取單個(gè)核細(xì)胞層并置于另ー離心管中，加入2-3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，混勻，冰上靜置3min，加入10倍體積的PBS緩沖液，充分混勻后，1500rpm, 4°C離心5min。離心后傾棄上清液，再用PBS緩沖液洗2次。用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。去除非貼壁細(xì)胞，剩下的貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞。2.用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng)PBMC,同時(shí)加入GM-CSF 15ng/mL和IL_415ng/mL，每2天進(jìn)行一次半量換液，第六天加入紅桂木凝集素22-220 μ g/ml，作用48小吋。所得上層細(xì)胞即為成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞?？瞻讓?duì)照組的培養(yǎng)基是含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，同時(shí)加入GM-CSF 15ng/mL和IL_415ng/mL，每2天進(jìn)行一次半量換液，培養(yǎng)8天。TNF- α對(duì)照組的培養(yǎng)基是含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，同時(shí)加入GM-CSF 15ng/mL和IL_415ng/mL，每2天進(jìn)行一次半量換液，第六天加入TNF- a 50ng/mL,作用48小時(shí)。實(shí)施例3樹(shù)突狀細(xì)胞的鑒定I.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察如圖I所示，加入不同濃度ALL培養(yǎng)2天后，各組細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，呈不規(guī)則狀態(tài)，大部分呈懸浮或半貼壁狀態(tài)，細(xì)胞表面都有長(zhǎng)短不等的突起，単獨(dú)生長(zhǎng)或聚集成較大的細(xì)胞集落，為典型的樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面標(biāo)志計(jì)數(shù)細(xì)胞,調(diào)整DC濃度至I X 106/mL,加入Ep管,PBS洗一次，1500rpm離心5min ；棄上清，殘留100 μ L，混勻細(xì)胞，分別加入單克隆抗體⑶la、⑶83、⑶86、⑶40和HLA-DR ；4°C避光反應(yīng)30min，PBS洗一次，加入500 μ L PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的表面標(biāo)志。
空白對(duì)照組和TNF α對(duì)照組的DC經(jīng)同樣步驟分別上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的表面
O檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，可以看出ALL能增強(qiáng)DC表面分子⑶Ia的表達(dá)，表明ALL在一定程度上促進(jìn)單核細(xì)胞向樹(shù)突狀細(xì)胞的分化，同時(shí)ALL明顯增強(qiáng)DC表面分子⑶83、⑶86、⑶40、HLA-DR的表達(dá)，表明ALL可促進(jìn)DC成熟。3. ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌收集實(shí)施例2的DC培養(yǎng)上清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分析細(xì)胞因子TNF-α 和 IL-12 含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3 =ALL明顯促進(jìn)DC分泌TNF- α和IL-12。
4.混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DC的功能(I)計(jì)數(shù)實(shí)施例2中收集的DC，調(diào)濃度至lX106/ml，加入絲裂霉素C 25 μ g/mL,37°C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次，再用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為2X 106/mL。(2)按常規(guī)法分離人外周血T淋巴細(xì)胞，并用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至5X 105/ml ο(3)按DC T比例梯度1:5，1:10，1:20，1:50接種細(xì)胞至96孔圓底培養(yǎng)板，200 μ L/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h。1300rpm, 5min,棄去100 μ L上清液，每孔加入MTT 10 μ L (5g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，1300rpm, min棄上清液，每孔加入DMSO100 μ I充分溶解結(jié)晶，用Bio-Rad酶標(biāo)儀檢測(cè)0D570nm。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5 :DC與T淋巴細(xì)胞比例為1:5時(shí)，其促進(jìn)T細(xì)胞增殖的能力最強(qiáng)，而且ALL濃度為44 μ g/mL和220 μ g/mL時(shí)的作用明顯強(qiáng)于空白組，結(jié)果表明ALL能增強(qiáng)DC的抗原遞呈能力。實(shí)施例4樹(shù)突狀細(xì)胞的增殖檢測(cè)將PBMC調(diào)整濃度為I X 106/mL,接種于96孔板。按實(shí)施例2的處理方法，培養(yǎng)8天后，每孔中加入CCK-8溶液10 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)2h，用Bio-Rad酶標(biāo)儀檢測(cè)0D450nm，計(jì)算細(xì)
胞增殖率。增殖率(％)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組的OD值)/空白組的OD值X 100%檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6 :紅桂木凝集素顯著促進(jìn)DC的増殖，増殖率隨著紅桂木凝集素濃度的增加而升高。
權(quán)利要求
1.ー種體外誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和増殖的紅桂木凝集素，其特征在于添加紅桂木凝集素作為誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和増殖的專(zhuān)用培養(yǎng)基，是在樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)因子和紅桂木凝集素；所述樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)基是含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基；所述的專(zhuān)用培養(yǎng)基紅桂木凝集素的濃度是22-220 μ g/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和増殖的紅桂木凝集素，其特征在于所述的專(zhuān)用培養(yǎng)基紅桂木凝集素的濃度是44 μ g/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅桂木凝集素的誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和増殖的方法，其特征在于在樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)基中加入樹(shù)突狀細(xì)胞的前體細(xì)胞和誘導(dǎo)因子，培養(yǎng)到第6天時(shí)，カロ入紅桂木凝集素，繼續(xù)培養(yǎng)2天，制備成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞；所述的前體細(xì)胞來(lái)自人外周血單個(gè)核細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和増殖的方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)因子為GM-CSF和IL-4，誘導(dǎo)因子在加入樹(shù)突狀細(xì)胞的前體細(xì)胞的第一天加入，所述的GM-CSF的濃度為15ng/mL,所述的IL-4的濃度為15ng/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和増殖的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)溫度為37°C，CO2濃度為5%，濕度為飽和濕度，每2天換一次新鮮的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種能體外誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)成熟和增殖的紅桂木凝集素及其誘導(dǎo)DC成熟和增殖的專(zhuān)用培養(yǎng)基和制備方法。所述紅桂木凝集素以紅桂木種子為原料，采用常規(guī)分離方法分離純化。所述專(zhuān)用培養(yǎng)基是是在DC培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)因子和紅桂木凝集素。所述的制備方法是在DC培養(yǎng)基中加入DC的前體細(xì)胞和誘導(dǎo)因子，培養(yǎng)到第6天時(shí)，加入紅桂木凝集素，繼續(xù)培養(yǎng)2天，制備獲得成熟DC。所述前體細(xì)胞為外周血單個(gè)核細(xì)胞。所述誘導(dǎo)因子為GM-CSF和IL-4。本發(fā)明建立了穩(wěn)定的誘導(dǎo)DC成熟和增殖的培養(yǎng)技術(shù)體系，操作簡(jiǎn)單，方便實(shí)用，所需的細(xì)胞因子少，費(fèi)用低，且DC成熟度高，功能強(qiáng)。本發(fā)明提供的紅桂木凝集素為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)疫苗增強(qiáng)劑提供了新型有效的途徑。
文檔編號(hào)C12N5/0784GK102690783SQ20121018516
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者曾麒燕, 李璐, 王婧娉 申請(qǐng)人:廣西醫(yī)科大學(xué)