專利名稱：基于金納米簇的腫瘤靶向活體多模態(tài)成像方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種靶向腫瘤納米探針的制備方法，通過在生命體病灶原位生長出具有腫瘤靶向性分子成像的金納米簇等納米生物探針，該功能納米探針將腫瘤靶向、熒光成像、拉曼成像、超聲成像多功能融為一體，能夠?qū)崿F(xiàn)多模態(tài)的同步監(jiān)測，而且這種原位活體成像方法不僅能夠進(jìn)行腫瘤早期診斷而且能夠在癌癥治療過程中進(jìn)行適時監(jiān)控。
背景技術(shù)：
腫瘤，尤其是惡性腫瘤——癌癥是人類死亡的主要原因。盡管腫瘤生物學(xué)和腫瘤醫(yī)學(xué)有了很大的發(fā)展，比如腫瘤生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，簡便的手術(shù)流程，放療和化療的發(fā)展， 但是總癌癥存活率多年來一直都沒有顯著的提高。為了提高腫瘤患者的存活率和生活質(zhì)量，我們繼續(xù)發(fā)展新的腫瘤早期診斷的方法和治療方法。當(dāng)今，腫瘤靶向性納米探針的發(fā)展存在很大挑戰(zhàn)，與腫瘤學(xué)領(lǐng)域最常規(guī)的方法相t匕，分子成像有可能更早地檢測疾病的進(jìn)展或治療效力。其中熒光成像和拉曼成像因為其具有高靈敏和能夠提供定量和動態(tài)的生物信息而受到醫(yī)學(xué)診斷的特別關(guān)注。隨著研究的不斷深入和系統(tǒng)的不斷改進(jìn)，熒光成像和拉曼成像技術(shù)可以快速的測量各種癌癥模型中腫瘤的生長，并可對癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行適時觀測評估；可以無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。如Hollingshead等利用人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251構(gòu)建U251-HRE細(xì)胞，將此腫瘤細(xì)胞植于裸鼠體內(nèi)，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)腫瘤達(dá)到了 300-500 mg時，局部組織出現(xiàn)低氧狀態(tài)，此時可監(jiān)測到熒光素酶顯著表達(dá)。這種方法不僅僅監(jiān)測腫瘤本身，更重要的是可以監(jiān)測腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境。另外，熒光成像和拉曼成像技術(shù)可以精確地提供細(xì)膩的細(xì)胞和組織中分子特征變化信息，能夠通過分子的結(jié)構(gòu)和位置的光譜指紋揭示組織形態(tài)和解剖學(xué)上的細(xì)節(jié)，從而能夠成為臨床診斷工具，幫助醫(yī)務(wù)人員檢測出分子水平上的疾病和治療反應(yīng)情況。納米科學(xué)和技術(shù)的發(fā)展帶動了用于分子細(xì)胞成像和癌癥治療的納米材料的發(fā)展，也帶動了用于癌癥檢測和篩查的納米器件的開發(fā)。納米材料不僅能提供癌癥病人的高靈敏和特異性成像信息，而且還能運(yùn)輸抗癌藥物到達(dá)腫瘤的位置，另外，更有意思同時也很重要的是有些納米材料本身可以作為奇妙的藥物來治療癌癥。當(dāng)今，我們在以下這些方面的認(rèn)識仍然是有限的一是適合用來成像的生物標(biāo)志物；二是成像靶標(biāo)和反差增強(qiáng)材料的選擇；三是用來是成像探針生物化的化學(xué)方法。我們在發(fā)展癌癥特異性成像試劑上同樣遇到很多困難，包括靶向組織或腫瘤的探針的運(yùn)輸不佳；生物毒性大；探針的穩(wěn)定性不佳；體內(nèi)信號增強(qiáng)強(qiáng)度低等。本發(fā)明已解決了這些問題。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是在于提供了一種原位生長并且集在體或離體腫瘤靶向、熒光、增強(qiáng)拉曼信息及超聲成像等多功能生物相容性好的金納米簇等納米生物探針，并能夠用于腫瘤的活細(xì)胞或活體的腫瘤靶向的熒光成像、拉曼成像及超聲成像的新方法，通過超聲成像可確定腫瘤的尺寸和位置，監(jiān)控治療過程以及治療后的恢復(fù)過程，另外，根據(jù)熒光成像的熒光分布情況和其熒光強(qiáng)度以及拉曼成像的圖譜中拉曼信號的波數(shù)位置及其強(qiáng)度對腫瘤部位的生物化學(xué)組分的分布以及數(shù)量進(jìn)行定性和定量分析，以便實現(xiàn)腫瘤的早期診斷以及腫瘤治療過程適時監(jiān)控。技術(shù)方案本發(fā)明的基于金納米簇的腫瘤靶向活體多模態(tài)成像方法為將氯金酸或其鹽溶液與腫瘤細(xì)胞共育，利用腫瘤細(xì)胞中特異性生成的大量的金納米簇，使用熒光顯微鏡、拉曼顯微鏡或超聲成像技術(shù)對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行高分辨顯微成像，通過超聲成像、熒光成像的熒光分布情況和其熒光強(qiáng)度以及拉曼成像的圖譜中拉曼信號的波數(shù)位置及其強(qiáng)度來對細(xì)胞結(jié)構(gòu)或化學(xué)組分進(jìn)行定性或定量分析。具體措施如下
首先在細(xì)胞水平進(jìn)行研究，其具體步驟是 1)選擇肝癌H印G2和白血病K562細(xì)胞作為研究對象，將這兩種細(xì)胞分別與f1000U mol/L的氯金酸或其鹽溶液進(jìn)行16 48小時細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育以得到原位生物合成的金納米簇；
2)與I 1000u mol/L的無菌氯金酸或其鹽溶液進(jìn)行16 48小時孵育的H印G2 (K562)細(xì)胞，用熒光顯微鏡表征金納米簇在細(xì)胞中的分布情況，用熒光顯微鏡或拉曼顯微鏡來探究腫瘤細(xì)胞內(nèi)原位生長的金納米簇用于腫瘤的活細(xì)胞的腫瘤靶向的熒光成像和拉曼成像；通過超聲成像、熒光成像的熒光分布情況和其熒光強(qiáng)度以及拉曼成像的圖譜中拉曼信號的波數(shù)位置及其強(qiáng)度來對細(xì)胞結(jié)構(gòu)或化學(xué)組分進(jìn)行定性或定量分析。該成像用于在體腫瘤成像時，將氯金酸或其鹽溶液注射到腫瘤組織周圍或腫瘤組織中，利用腫瘤細(xì)胞中特異性生成的大量的金納米簇，使用拉曼成像儀及活體熒光成像儀對腫瘤部位進(jìn)行拉曼成像或熒光成像，通過超聲成像確定腫瘤的尺寸和位置，監(jiān)控治療過程以及治療后的恢復(fù)過程，另外，根據(jù)拉曼及熒光信號的強(qiáng)度及分布情況從而對腫瘤部位的生物化學(xué)組分的分布以及數(shù)量進(jìn)行定性和定量分析；
然后在動物活體模型層面進(jìn)行研究，其具體步驟是
1)構(gòu)建移植肝癌腫瘤的裸鼠模型；
2)采用于腫瘤附近局部皮下注射0.ro. 5 mL無菌的濃度為f 1000 mmol/L的氯金酸或其鹽溶液，并且經(jīng)過12 36小時的孵育，在腫瘤組織內(nèi)原位生成集腫瘤靶向、熒光、拉曼以及超聲成像的多功能金納米簇；
3)利用過程2)中所生成的金納米簇，使用拉曼成像或熒光成像技術(shù)對腫瘤部位進(jìn)行拉曼成像或熒光成像，通過超聲成像確定腫瘤的尺寸和位置，監(jiān)控治療過程以及治療后的恢復(fù)過程，另外，根據(jù)熒光或拉曼信號的強(qiáng)度及分布情況從而對腫瘤部位的生物化學(xué)組分的分布以及數(shù)量進(jìn)行定性和定量分析。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，具有以下優(yōu)點和效果
本研究采用生命體內(nèi)原位生長多功能分子成像的金納米簇等納米生物探針的方法，這種方法既避免了傳統(tǒng)納米材料合成過程中引入的化學(xué)試劑以及納米材料穩(wěn)定劑對有機(jī)體造成的生物毒性，也避免了傳統(tǒng)納米材料易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲從而被清除而不能到達(dá)病灶組織的缺點，以便實現(xiàn)活體腫瘤靶向性熒光、拉曼及超聲成像。該功能性納米探針將腫瘤靶向、熒光成像、拉曼成像及超聲成像多功能融為一體，能夠?qū)崿F(xiàn)多模態(tài)的同步監(jiān)測，這種原位活體成像方法可望應(yīng)用于腫瘤臨床診斷的多功能適時成像以便實現(xiàn)腫瘤早期診斷以及腫瘤治療過程中的適時跟蹤。
具體實施例方式所述的離體腫瘤細(xì)胞成像的方法為，將氯金酸或其鹽溶液與腫瘤細(xì)胞共育，利用腫瘤細(xì)胞中特異性生成的大量的金納米簇，使用熒光成像、拉曼成像或超生成像技術(shù)便可對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或化學(xué)組分進(jìn)行分析。所述的在體腫瘤成像的方法為，將氯金酸或其鹽溶液注射到腫瘤組織周圍或腫瘤組織中，利用腫瘤細(xì)胞中特異性生成的大量的金納米簇，采用拉曼成像及活體熒光成像技術(shù)便可對腫瘤細(xì)胞的生物化學(xué)組分的分布及其數(shù)量進(jìn)行分析。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施 首先在細(xì)胞水平進(jìn)行研究，其具體步驟是
1)選擇肝癌H印G2和白血病K562細(xì)胞作為研究對象，將這兩種細(xì)胞分別與f1000U mol/L的氯金酸或其鹽溶液進(jìn)行16 48小時細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育以得到原位生物合成的金納米簇；
2)與1 1000u mol/L的無菌氯金酸或其鹽溶液進(jìn)行16 48小時孵育的H印G2 (K562)細(xì)胞，用熒光顯微鏡表征金納米簇在細(xì)胞中的分布情況，用熒光顯微鏡或拉曼顯微鏡來探究腫瘤細(xì)胞內(nèi)原位生長的金納米簇用于腫瘤的活細(xì)胞的腫瘤靶向的熒光成像和拉曼成像；通過超聲成像、熒光成像的熒光分布情況和其熒光強(qiáng)度以及拉曼成像的圖譜中拉曼信號的波數(shù)位置及其強(qiáng)度來對細(xì)胞結(jié)構(gòu)或化學(xué)組分進(jìn)行定性或定量分析。然后在動物活體模型進(jìn)行研究，其具體步驟是
I)構(gòu)建移植肝癌腫瘤的裸鼠模型。2)采用于腫瘤附近局部皮下注射0. ro. 5 mL無菌的濃度為f 1000 mmol/L的氯金酸或其鹽溶液，并且經(jīng)過12 36小時的孵育，在腫瘤組織內(nèi)原位生成集腫瘤靶向、熒光、拉曼以及超聲成像的多功能金納米簇。3)利用過程2)中所生成的金納米簇，使用拉曼成像或熒光成像技術(shù)對腫瘤部位進(jìn)行拉曼成像或熒光成像，通過超聲成像確定腫瘤的尺寸和位置，監(jiān)控治療過程以及治療后的恢復(fù)過程，另外，根據(jù)熒光或拉曼信號的強(qiáng)度及分布情況從而對腫瘤部位的生物化學(xué)組分的分布以及數(shù)量進(jìn)行定性和定量分析，以實現(xiàn)腫瘤的早期診斷以及腫瘤治療過程適時監(jiān)控。實例I基于細(xì)胞內(nèi)原位生物合成金納米簇的成像方法
首先將無菌的濃度為廣1000 u mol/L的氯金酸或其鹽溶液與IfepG2細(xì)胞共孵育16 48小時(37 ° C，5 % CO2, RH 95%)，即可得到有體內(nèi)原位生物合成的金納米簇。然后將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基小心移出，并用PH 7. 2的無菌PBS輕輕淋洗細(xì)胞，將其置于激光聚焦熒光顯微鏡下，采用波長為488 nm藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)即可采集到細(xì)胞的綠色熒光圖像，通過熒光斷層掃描技術(shù)可以清晰的觀察到這種金納米簇主要集中在細(xì)胞核區(qū)。實例2基于活體病灶原位生長金納米簇的腫瘤靶向成像方法
首先在已經(jīng)植入肝癌腫瘤模型裸鼠的腫瘤附近局部皮下注射0. ro. 5 mL無菌的濃度為f 1000 mmol/L的氯金酸或其鹽溶液，經(jīng)過12 36小時的孵育后，將該實驗裸鼠用5%異氟烷進(jìn)行氣體麻醉，然后將其置于小動物活體成像儀操作平臺上，選擇藍(lán)光激發(fā)即可采集 到腫瘤區(qū)域的圖像。
權(quán)利要求
1.一種基于金納米簇的腫瘤靶向活體多模態(tài)成像方法，其特征在于該成像的方法為將氯金酸或其鹽溶液與腫瘤細(xì)胞共育，利用腫瘤細(xì)胞中特異性生成的大量的金納米簇，使用熒光顯微鏡、拉曼顯微鏡或超聲成像技術(shù)對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行高分辨顯微成像，通過超聲成像、熒光成像的熒光分布情況和其熒光強(qiáng)度以及拉曼成像的圖譜中拉曼信號的波數(shù)位置及其強(qiáng)度來對細(xì)胞結(jié)構(gòu)或化學(xué)組分進(jìn)行定性或定量分析； 具體措施如下 首先在細(xì)胞水平進(jìn)行研究，其具體步驟是 O選擇肝癌ifepG2和白血病K562細(xì)胞作為研究對象，將這兩種細(xì)胞分別與f 1000umol/L的氯金酸或其鹽溶液進(jìn)行16 48小時細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育以得到原位生物合成的金納米簇； 2)與1 1000 μ mo I/L的無菌氯金酸或其鹽溶液進(jìn)行16 48小時孵育的H印G2 (K562)細(xì)胞，用熒光顯微鏡表征金納米簇在細(xì)胞中的分布情況，用熒光顯微鏡或拉曼顯微鏡來探 究腫瘤細(xì)胞內(nèi)原位生長的金納米簇用于腫瘤的活細(xì)胞的腫瘤靶向的熒光成像和拉曼成像；通過超聲成像、熒光成像的熒光分布情況和其熒光強(qiáng)度以及拉曼成像的圖譜中拉曼信號的波數(shù)位置及其強(qiáng)度來對細(xì)胞結(jié)構(gòu)或化學(xué)組分進(jìn)行定性或定量分析。
2.一種基于金納米簇的腫瘤靶向活體多模態(tài)成像分析方法，其特征在于該成像用于在體腫瘤成像時，將氯金酸或其鹽溶液注射到腫瘤組織周圍或腫瘤組織中，利用腫瘤細(xì)胞中特異性生成的大量的金納米簇，使用拉曼成像儀及活體熒光成像儀對腫瘤部位進(jìn)行拉曼成像或熒光成像，通過超聲成像確定腫瘤的尺寸和位置，監(jiān)控治療過程以及治療后的恢復(fù)過程，另外，根據(jù)拉曼及熒光信號的強(qiáng)度及分布情況從而對腫瘤部位的生物化學(xué)組分的分布以及數(shù)量進(jìn)行定性和定量分析； 然后在動物活體模型層面進(jìn)行研究，其具體步驟是 O構(gòu)建移植肝癌腫瘤的裸鼠模型； 2)采用于腫瘤附近局部皮下注射O.Γ0. 5 mL無菌的濃度為f 1000 mmol/L的氯金酸或其鹽溶液，并且經(jīng)過12 36小時的孵育，在腫瘤組織內(nèi)原位生成集腫瘤靶向、熒光、拉曼以及超聲成像的多功能金納米簇； 3)利用過程2)中所生成的金納米簇，使用拉曼成像或熒光成像技術(shù)對腫瘤部位進(jìn)行拉曼成像或熒光成像，通過超聲成像確定腫瘤的尺寸和位置，監(jiān)控治療過程以及治療后的恢復(fù)過程，另外，根據(jù)熒光或拉曼信號的強(qiáng)度及分布情況從而對腫瘤部位的生物化學(xué)組分的分布以及數(shù)量進(jìn)行定性和定量分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于金納米簇的腫瘤靶向活體多模態(tài)成像分析方法首先通過體外細(xì)胞(包括不同種類腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞)實驗，將相關(guān)細(xì)胞與一定濃度的氯金酸及其鹽溶液在生理條件下孵育產(chǎn)生金納米簇，實現(xiàn)了實時非侵入性的高分辨腫瘤細(xì)胞熒光成像、拉曼成像及超聲成像。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用局部皮下注射方法，在移植腫瘤裸鼠模型上實現(xiàn)了實時原位活體腫瘤靶向熒光、拉曼和超聲成像。該功能性納米探針將腫瘤靶向、熒光成像、拉曼成像以及超聲成像多功能融為一體，能夠?qū)崿F(xiàn)多模態(tài)的同步監(jiān)測；同時，這種金納米簇的原位活體成像方法能夠進(jìn)行準(zhǔn)確定位與腫瘤靶向成像分析。
文檔編號C12Q1/02GK102735752SQ20121019024
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者姜暉, 李奇維, 王建玲, 王雪梅 申請人:東南大學(xué)