專利名稱：一種生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及ー種重組H5N1禽流感病毒5代以內(nèi)快速適應(yīng)MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的方法，適應(yīng)病毒株在生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。
背景技術(shù)：
H5N1 高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus,HP-AIV)在世界范圍內(nèi)廣泛存在，不僅可以感染禽類，而且可以跨越種間屏障感染多種哺乳動(dòng)物，尤其是可以直接感染人，并導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重的危害了養(yǎng)禽業(yè)和人類的健康，因此禽流感的防制是非常重要的。全群撲殺和生物安全防護(hù)是及時(shí)撲滅和控制高致病性禽流感(HPAI)的主要措施，而疫苗接種是防控禽流感最有效和最經(jīng)濟(jì)的方法。過去50年來，一直通過雞胚培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗。由于流感疫苗的生產(chǎn)需要使用大量雞胚，且生產(chǎn)周期長，易污染，不易于控制，生產(chǎn)效率較低。自從1996年以來，哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)發(fā)展到能夠自由擴(kuò)大培養(yǎng)并且用于エ業(yè)化生產(chǎn)，而禽流感疫苗也可以通過動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)制備。生物反應(yīng)器能夠有效地增加單位體積細(xì)胞培養(yǎng)的密度，從而為病毒性疫苗大規(guī)模生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前我國禽流感H5N1商品疫苗主要是通過流感病毒反向遺傳學(xué)操作技術(shù)構(gòu)建的重組疫苗株。但是以MDCK細(xì)胞增殖重組H5N1禽流感疫苗株存在很多困難1、病毒從雞胚到細(xì)胞兩種不同的培養(yǎng)基質(zhì)轉(zhuǎn)換需要適應(yīng)過程；2、因轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞量的限制，H5N1禽流感病毒HA效價(jià)不會(huì)高于29，不能滿足疫苗制備的要求；3、重組H5N1禽流感病毒HA自切割位點(diǎn)一般被去除，在病毒的吸附過程中必須更換添加TPCK-胰酶的無血清培養(yǎng)基，其エ藝復(fù)雜。因此，研發(fā)新的生產(chǎn)エ藝，使H5亞型禽流感病毒快速在MDCK細(xì)胞上適應(yīng)，從方瓶、轉(zhuǎn)瓶快速放大到操作簡單的固定床籃式攪拌系統(tǒng)生物反應(yīng)器，大規(guī)模生產(chǎn)重組H5亞型禽流感病毒是非常必要的。中國專利號(hào)02112013. 7的發(fā)明專利說明書公開了ー種利用Fibra-CeTMDisks為載體大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)病毒疫苗的方法，雖然該エ藝適合于狂犬疫苗、出血熱、こ腦、小兒脊髓灰質(zhì)炎病毒，但是卻不適合需要傳代適應(yīng)的流感病毒。中國專利號(hào)201010596058. 9的發(fā)明專利說明書公開了利用Cytodexl為載體在生物反應(yīng)器培養(yǎng)MDCK細(xì)胞增殖H9N2型禽流感病毒。中國專利號(hào)201010159741.6的發(fā)明專利說明書公開了生物反應(yīng)器培養(yǎng)MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)エ藝，以及增殖H9N2病毒制備疫苗的エ藝。中國專利號(hào)201010282155. O的發(fā)明專利說明書公開了利用Cytodexl為載體在生物反應(yīng)器培養(yǎng)MDCK或者細(xì)胞增殖エ業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感病毒。以上文獻(xiàn)資料都有不同程度的涉及禽流感病毒的生產(chǎn)エ藝方法。但是，對(duì)重組H5N1禽流病毒在MDCK細(xì)胞的快速適應(yīng)以及利用聚酯片為載體在固定床籃式攪拌系統(tǒng)反應(yīng)器的生產(chǎn)エ藝并未涉及
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是在于提供了ー種生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)的方法，方法易行，操作簡便，適應(yīng)后病毒HA效價(jià)>27;該病毒從方瓶、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)エ藝快速轉(zhuǎn)換到操作簡單的固定床籃式攪拌系統(tǒng)反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)，其HA效價(jià)可以達(dá)到211，解決了目前重組H5N1禽流感病毒在MDCK細(xì)胞上培養(yǎng)病毒滴度不能滿足疫苗生產(chǎn)的難題。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案ー種生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)的方法(一種重組H5N1型禽流感病毒在MDCK細(xì)胞上的快速適應(yīng)方法和該適應(yīng)病毒的生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)エ藝)，其步驟是(I)重組H5N1禽流感病毒在MDCK細(xì)胞(見遺傳資源表)上的快速適應(yīng)，所述的步驟(I)病毒36. 5-37. 5°C吸附I 一 2小時(shí)，去除病毒液，病毒稀釋液清洗MDCK細(xì)胞2 — 4次后更換細(xì)胞維持液，取血凝效價(jià)>24且病毒稀釋倍數(shù)最高的病毒液或者致細(xì)胞最晚產(chǎn)生病變的最高稀釋倍數(shù)病毒作為種子病毒繼續(xù)適應(yīng)；病毒在5代以內(nèi)適應(yīng)MDCK細(xì)胞，且病毒血凝效價(jià)>27。
(2)經(jīng)過步驟(I)適應(yīng)MDCK細(xì)胞內(nèi)増殖的重組H5亞型禽流感病毒作為反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)的種子病毒，所述的步驟(2)種子病毒代次> F6 ;血凝效價(jià)> 28 ；EID50 ^ 107 5。所述病毒稀釋液為含TPCK-胰酶I. 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM ;病毒維持液為含TPCK-胰酶O. 5-lug/ml 高糖 DMEM。(3)以聚酯片為載體培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，所述的步驟(3)以聚酯片為載體，反應(yīng)器為籃式固定床，30-50g/L載體投放量，每克載體投放O. 5-4. 5*107個(gè)細(xì)胞；完全培養(yǎng)基為含8-10% (體積比)新生牛血清DMEM ;細(xì)胞20分鐘內(nèi)貼壁，此階段攪拌轉(zhuǎn)速45r/min，DO為60%,溫度為36 — 38°C，pH為7. 0-7. 3，通氣量為O. ISLPM ;細(xì)胞培養(yǎng)階段依據(jù)細(xì)胞耗氧，攪拌轉(zhuǎn)速控制50-120r/ml，通氣量O. 1-0. 5SLPM，pH7. 2，反應(yīng)器中糖濃度I. 8-2. 2g/L，調(diào)整灌流速度為5-40ml/min;細(xì)胞培養(yǎng)50-70小時(shí)生長至平臺(tái)期，此時(shí)平均每200g載體上的細(xì)胞糖耗為I. 7-2. 5g/h (具體見附圖I)。(4)上述步驟(3)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞接種病毒，所述的步驟(4)反應(yīng)器培養(yǎng)MDCK細(xì)胞接種病毒吋，PBS清洗細(xì)胞2 — 4次，病毒稀釋液清洗細(xì)胞I 一 2次，病毒接種MOI為O. 01-0. 00001 ;病毒吸附過程中TPCK-胰酶濃度I. 0-1. 5ug/ml，溫度36. 5-37. 5°C，攪拌轉(zhuǎn)速40-60r/min，D0為60%，pH為7. 6，病毒吸附2小時(shí)；病毒培養(yǎng)階段細(xì)胞維持和病毒培養(yǎng)溫度為33-35°C，攪拌轉(zhuǎn)速60-120r/min，通氣量為O. 2-0. 6SLPM, 4-6小時(shí)后更換細(xì)胞維持液。(5) MDCK細(xì)胞維持和病毒増殖，所述的步驟(5)病毒培養(yǎng)階段細(xì)胞維持和病毒培養(yǎng)溫度為33-35 °C，攪拌轉(zhuǎn)速60-120r/min，通氣量為O. 2-0. 6SLPM, 4-6小時(shí)后更換細(xì)胞維持液；灌流培養(yǎng)速度為10-50ml/min，糖濃度保持2. 0-2. 8g/L。所述病毒稀釋液為含TPCK-胰酶I. 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM ;病毒維持液為含TPCK-胰酶O. 5-lug/ml高糖DMEM。(6)監(jiān)測血凝效價(jià)收獲病毒，所述的步驟(6)病毒血凝效價(jià)最高為211，可以收獲7. 5-9個(gè)反應(yīng)器培養(yǎng)體積病毒液,其中4. 5-5個(gè)反應(yīng)器培養(yǎng)體積病毒液血凝效價(jià)大于29 ;另外3-4個(gè)反應(yīng)器培養(yǎng)體積病毒液血凝效價(jià)27Λ本發(fā)明提供最系統(tǒng)的重組Η5Ν1禽流感病毒的生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)，該方法從重組Η5Ν1禽流感病毒在細(xì)胞適應(yīng)到反應(yīng)器規(guī)模培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果①與傳統(tǒng)的Η5Ν1流感病毒在MDCK細(xì)胞上方法相比較，本發(fā)明提供以六孔板梯度適應(yīng)方法操作簡單，工作量??；病毒在5代以內(nèi)能夠適應(yīng)MDCK細(xì)胞并且穩(wěn)定的増殖，其HA效價(jià)大于27 ;該方法易于標(biāo)準(zhǔn)化，適用于所有的H5亞型流感病毒。②本發(fā)明提供的聚酯片為載體，運(yùn)用固定床生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，增殖H5亞型流感病毒，只需要每克載體投放O. 5-4. 5*107個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞增殖增殖快速，接毒エ藝簡單，易于エ業(yè)化大規(guī)模 操作。③本發(fā)明提供的方法病毒效價(jià)高、產(chǎn)量大，可以提供4. 5-5個(gè)反應(yīng)器培養(yǎng)體積的病毒液，其血凝效價(jià)大于29 ;該病毒免疫原性好，抗體水平維持時(shí)間長，在該病毒液制備疫苗免疫SPF雞后14天HI效價(jià)即可達(dá)到25 5，28天可以達(dá)到28 5。第11周時(shí)抗體仍在27以上。


圖I為ー種反應(yīng)器中MDCK細(xì)胞耗糖曲線示意圖。為200克片狀載體投放時(shí)，MDCK細(xì)胞每小時(shí)的糖耗曲線表。24_32小時(shí)，MDCK細(xì)胞糖耗低，并且增長緩慢，表明此階段為細(xì)胞生長的延遲期；35 — 58細(xì)胞糖耗值劇增，代表細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增長期，60-70小時(shí)細(xì)胞糖耗進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定，表明細(xì)胞生長進(jìn)入平臺(tái)期。圖2為ー種反應(yīng)器生產(chǎn)重組流感病毒液HA效價(jià)變化曲線示意圖。200克片狀載體投放，細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期以O(shè). 001-0. 0001接種重組H5亞型禽流感病毒后，以I %雞紅細(xì)胞檢測病毒HA血凝效價(jià)變化表明病毒在28小時(shí)檢測到HA效價(jià)，48小時(shí)效價(jià)達(dá)到最聞211。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :重組H5N1禽流感病毒毒株rC4/Wl株快速適應(yīng)MDCK細(xì)胞rC4/Wl株(見遺傳資源表)該病毒是全禽源性H5亞型禽流感病毒，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為=CCTCC NO :V201029，其快速適應(yīng)MDCK細(xì)胞步驟如下I)取I個(gè)MDCK細(xì)胞長成致密單層的T75細(xì)胞瓶，細(xì)胞消化后平均鋪入3個(gè)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。2)將雞胚尿囊液毒液以10倍倍比稀釋至10_6。3)取10-3、10-4、10-5、10-6各稀釋度毒液200111，并用細(xì)胞維持液補(bǔ)充至31111，分別加入長滿MDCK細(xì)胞單層的6孔板中，每個(gè)稀釋濃度做ー個(gè)重復(fù)，取200ul稀釋液用細(xì)胞維持液補(bǔ)充至3ml，加入長滿MDCK細(xì)胞單層的作為陰性對(duì)照。4)在37°C條件下，病毒吸附I. 5小時(shí)后去除病毒液，以病毒稀釋液清洗MDCK細(xì)胞3次后，每孔加入細(xì)胞維持液3ml，24小時(shí)后每6個(gè)小時(shí)觀測細(xì)胞病變，測HA效價(jià)，48小時(shí)后每3個(gè)小時(shí)觀測細(xì)胞病變，測HA效價(jià)，接毒84小時(shí)后6孔板于一 80°C凍融一次，均未檢測到HA效價(jià)，但是10_3、10_4分別在36-48小時(shí)和55 — 65小時(shí)出現(xiàn)了典型流感病毒導(dǎo)致脫落型的細(xì)胞病變。5)以65小時(shí)收獲的Kr4稀釋度病毒為H)代繼續(xù)在MDCK細(xì)胞上適應(yīng)培養(yǎng)。6)取FO代病毒重復(fù)步驟1、2，取10'10'10'10'按照步驟3、4操作，在48小時(shí)10_2接種孔MDCK細(xì)胞出現(xiàn)病變，在60小時(shí)10_3、10_4稀釋度接種孔出現(xiàn)明顯的病變，測HA效價(jià)發(fā)現(xiàn)10_3稀釋度效價(jià)最高可以達(dá)到27_8，其他的稀釋度液均達(dá)到26左右(見表I )，以60小時(shí)收獲的10_4病毒為Fl代病毒，按照步驟3、4操作繼續(xù)在MDCK細(xì)胞上適應(yīng)培養(yǎng)。7)按照上述方法連續(xù)傳至F4代，接種10_4、10_5稀釋度病毒的MDCK細(xì)胞在36 —52小時(shí)出現(xiàn)典型病變，HA效價(jià)>27。表I :rC4/Wl株R)_F4代在MDCK細(xì)胞適應(yīng)增殖表
權(quán)利要求
1.ー種生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其步驟是 (1)重組H5N1禽流感病毒在MDCK細(xì)胞上適應(yīng)，所述的病毒36.5-37. 5°C吸附I 一 2小吋，去除病毒液，病毒稀釋液清洗MDCK細(xì)胞2 — 4次后更換細(xì)胞維持液，取血凝效價(jià)>24病毒稀釋倍數(shù)的病毒液或者致細(xì)胞產(chǎn)生病變的稀釋倍數(shù)病毒作為種子病毒繼續(xù)適應(yīng)；病毒在5代以內(nèi)適應(yīng)MDCK細(xì)胞，病毒血凝效價(jià)>27 ； (2)步驟I適應(yīng)病毒株作為反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)病毒種子批制備，所述的種子批病毒代次≥F6 ;血凝效價(jià)≥28 ；EID50≥107 5，所述病毒稀釋液為含TPCK-胰酶L 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM ;病毒維持液為含TPCK-胰酶O. 5-lug/ml高糖DMEM ； (3)以聚酯片為載體培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，所述的以聚酯片為載體，反應(yīng)器為籃式固定床，30-50g /L載體投放量，每克載體投放O. 5-4. 5*107個(gè)細(xì)胞；培養(yǎng)基為含8-10%新生牛血清DMEM ;細(xì)胞20分鐘內(nèi)貼壁，階段攪拌轉(zhuǎn)速45r/min，DO為60%，溫度為36 — 38°C，Ph為.7. 0-7. 3，通氣量為O. ISLPM ;細(xì)胞培養(yǎng)階段依據(jù)細(xì)胞耗氧，攪拌轉(zhuǎn)速控制50_120r/ml，通氣量O. 1-0. 5 SLPM，Ph7. 2，反應(yīng)器中糖濃度I. 8-2. 2g/L，調(diào)整灌流速度為5_40ml/min ;細(xì)胞培養(yǎng)50-70小時(shí)生長至平臺(tái)期，平均每200g載體上的細(xì)胞糖耗為I. 7-2. 5g/h ； (4)步驟3培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞接種病毒，所述的反應(yīng)器培養(yǎng)MDCK細(xì)胞接種病毒吋，PBS清洗細(xì)胞2 — 4次，病毒稀釋液清洗細(xì)胞I 一 2次，病毒接種MOI為O. 01-0. 00001 ;病毒吸附過程中TPCK-胰酶濃度I. 0-1. 5ug/ml，溫度36. 5-37. 5°C，攪拌轉(zhuǎn)速40_60r/min，DO為60%，Ph為7. 6，病毒吸附2小時(shí)；病毒培養(yǎng)階段細(xì)胞維持和病毒培養(yǎng)溫度為33-35°C，攪拌轉(zhuǎn)速60-120r/min，通氣量為O. 2-0. 6SLPM, 4-6小時(shí)后更換細(xì)胞維持液； (5)MDCK細(xì)胞維持和病毒増殖，所述的步驟5病毒培養(yǎng)階段細(xì)胞維持和病毒培養(yǎng)溫度為33-35°C，攪拌轉(zhuǎn)速60-120r/min，通氣量為O. 2-0. 6SLPM, 4-6小時(shí)后更換細(xì)胞維持液；灌流培養(yǎng)速度為10-50ml/min，糖濃度保持2. 0-2. 8g/L，所述病毒稀釋液為含TPCK-胰酶I. 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM ;病毒維持液為含TPCK-胰酶O. 5-lug/ml高糖DMEM ； (6)監(jiān)測血凝效價(jià)收獲病毒，所述的病毒血凝效價(jià)最高為211，收獲7.5-9個(gè)反應(yīng)器培養(yǎng)體積病毒液，其中4. 5-5個(gè)反應(yīng)器培養(yǎng)體積病毒液血凝效價(jià)大于29 ;另外3-4個(gè)反應(yīng)器培養(yǎng)體積病毒液血凝效價(jià)27_8。
全文摘要
本發(fā)明一種生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)的方法,其步驟:(1)重組H5N1禽流感病毒在MDCK細(xì)胞上適應(yīng)；(2)病毒株作為反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)病毒種子批制備，種子批病毒代次≥F6；血凝效價(jià)≥28；EID50≥107.5；(3)以聚酯片為載體培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，以聚酯片為載體，反應(yīng)器為籃式固定床，每克載體投放細(xì)胞；培養(yǎng)基為新生牛血清DMEM；(4)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞接種病毒，病毒稀釋液清洗細(xì)胞，病毒接種；吸附后更換細(xì)胞維持液；(5)MDCK細(xì)胞維持和病毒增殖，攪拌，更換細(xì)胞維持液；(6)監(jiān)測血凝效價(jià)收獲病毒，收獲反應(yīng)器培養(yǎng)體積病毒液。方法易行，操作簡便，適應(yīng)后病毒HA效價(jià)>27，解決了目前重組H5亞型禽流感病毒在MDCK細(xì)胞上培養(yǎng)病毒滴度不能滿足疫苗生產(chǎn)的難題。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102732487SQ20121019336
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月13日
發(fā)明者周明光, 左靜, 徐玲莉, 徐高原, 李俊平, 李國紅, 洪燈, 涂加剛, 蔣桃珍, 邸海波, 金梅林, 陳煥春, 韋大坤 申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所, 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司