專利名稱：篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物信息學(xué)及生物檢疫鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鱷梨日斑類病毒屬類病毒(AvsunviiOid)屬于鱷梨日斑類病毒科(Avsunviroidae),目前只包括鱷梨日斑類病毒(Avocado sunblotch viroid, ASBVd) 一個種。該類病毒侵染鱷梨(Persea Americana)，在果實上引起黃色、白色或粉紅色的斑紋，有時水果上能形成下陷的火山口狀病斑，病斑可為黃色、綠色和深紅色，受害果實不能上市，造成經(jīng)濟損失。該類病毒是2007年發(fā)布的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名 錄》中的檢疫性有害生物，需要依法對其寄主植物及其產(chǎn)品進(jìn)行檢疫。隨著國內(nèi)外植物及其產(chǎn)品貿(mào)易的增加，該屬出現(xiàn)“新”類病毒的頻率越來越高，這種“新”主要表現(xiàn)在(1)發(fā)現(xiàn)該屬內(nèi)新的類病毒種；(2)發(fā)現(xiàn)鱷梨日斑類病毒新的寄主植物；(3)類病毒種間可能的變異；這3種情況都會導(dǎo)致該屬內(nèi)出現(xiàn)新的具有檢疫風(fēng)險性的類病毒。對于這些潛在的新類病毒需要建立廣譜性篩查技術(shù)，以便達(dá)到快速(一次反應(yīng)可檢測同一樣品中該屬的所有類病毒)、廣譜(不會因為變異等出現(xiàn)漏檢)篩查的目的。而現(xiàn)有的技術(shù)如生物學(xué)測定、正反向聚丙烯酰胺凝膠電泳及RT-PCR等通量低，一次只能檢測樣品中的一種類病毒，而且屬于特異性檢測，無法對變異大且變異位點多的類病毒進(jìn)行檢測。為了解決這些問題，國內(nèi)外研究人員開展了廣普性高通量篩查技術(shù)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定鱷梨日斑類病毒屬類病毒的探針組。本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定鱷梨日斑類病毒屬類病毒的探針組，由探針I(yè)-探針5共5條探針組成，所述探針I(yè)-探針5的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-5。上述探針中，所述鱷梨日斑類病毒屬類病毒為鱷梨日斑類病毒。本發(fā)明的另一個目的是提供一種篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的基因芯片。本發(fā)明提供的篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的基因芯片，為將上述的探針組固定在片基表面得到的基因芯片。在上述基因芯片中，所述片基為醛基化玻璃片基，在本發(fā)明的實施例中采用的是博奧生物有限公司晶芯》微陣列基片，產(chǎn)品目錄號420022。在上述基因芯片中，所述鱷梨日斑類病毒屬類病毒為鱷梨日斑類病毒。本發(fā)明的第三個目的是提供一種篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的基因芯片。上述試劑盒還包括所述試劑盒還包括用于擴增所述鱷梨日斑類病毒屬類病毒的cDNA的引物對，所述引物對具體由序列表中序列6和序列表中序列7所示的DNA分子組成；所述鱷梨日斑類病毒屬類病毒為鱷梨日斑類病毒。上述探針組、上述基因芯片或上述試劑盒在如下1)-4)中的應(yīng)用，也是本發(fā)明保護(hù)的范圍I)鑒定或輔助鑒定鱷梨日斑類病毒屬類病毒；2)制備鑒定或輔助鑒定鱷梨日斑類病毒屬類病毒產(chǎn)品；3)鑒定或輔助鑒定待測植物感染鱷梨日斑類病毒屬類病毒；4)制備鑒定或輔助鑒定待測植物感染鱷梨日斑類病毒屬類病毒產(chǎn)品。上述應(yīng)用中，所述待測植物為鱷梨；所述鱷梨日斑類病毒屬類病毒為鱷梨日斑類病毒。 本發(fā)明的第四個目的是提供一種篩查或輔助篩查待測植物感染鱷梨日斑類病毒屬類病毒的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)將待測植物的組織的cDNA進(jìn)行標(biāo)記，得到標(biāo)記后產(chǎn)物；2)將步驟I)得到的標(biāo)記后產(chǎn)物與上述的基因芯片進(jìn)行雜交，得到雜交后芯片；3)將步驟2)得到的雜交后芯片掃描，若所述基因芯片上的至少一條所述探針的信號絕對值不小于600且信噪比不小于3. 0，則待測植物感染或候選感染鱷梨日斑類病毒屬類病毒。上述方法中，步驟I)中，所述標(biāo)記為以所述cDNA為模板，以上述的試劑盒中的引物對進(jìn)行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，再將所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行Klenow酶標(biāo)記，得到標(biāo)記后產(chǎn)物；步驟2)中，所述雜交的溫度為42°C，所述雜交的時間為12h ；在所述步驟2)后和步驟3)前還包括將所述雜交后芯片進(jìn)行洗滌的步驟；所述至少一條所述探針為上述探針組中的任意一條；所述待測植物為鱷梨，所述組織為葉片； 所述鱷梨日斑類病毒屬類病毒為鱷梨日斑類病毒。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒芯片中的探針具有鱷梨日斑類病毒屬類病毒水平上的兼容性，所需的樣品量少，一般僅需O. lg。另外數(shù)據(jù)的分析與計算機圖像處理軟件相結(jié)合，達(dá)到分析結(jié)果能夠直觀化、可視化。本發(fā)明采用生物信息學(xué)方法對鱷梨日斑類病毒屬類病毒的核苷酸序列進(jìn)行分析，設(shè)計了該屬的兼容性探針，標(biāo)準(zhǔn)類病毒樣品驗證結(jié)果證明探針效果良好。本發(fā)明的鱷梨日斑類病毒屬類病毒芯片可用于鱷梨日斑類病毒屬類病毒的檢疫鑒定。


圖I為鱷梨日斑類病毒屬類病毒篩查芯片探針點陣示意圖(6X5)圖2為鱷梨日斑類病毒屬類病毒篩查芯片檢測結(jié)果圖3為應(yīng)用鱷梨日斑類病毒樣品驗證屬篩查芯片的靈敏度結(jié)果圖4為PCR靈敏度檢測結(jié)果
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的芯片的制備I、屬級高兼容性寡核苷酸探針的設(shè)計從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)及國際病毒學(xué)分類委員會(ICTV)數(shù)據(jù)庫下載類病毒屬全基因組及核酸序列；去除90%以上長度與其它序列有95%相似度的核酸序列；以5個堿基作為間隔，連續(xù)提取所有40mer的核酸序列；以40% ( GC含量< 60%、單個堿基含量< 50%、連續(xù)重復(fù)堿基數(shù)目< 4，且無大于6個堿基的發(fā)卡結(jié)構(gòu)為標(biāo)準(zhǔn)對核酸序列進(jìn)行篩選，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較以保證所獲得探針的特異性。根據(jù)上述原則設(shè)計了鱷梨日斑類病毒屬類病毒的5條探針(探針I(yè)-探針5)，其核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1-5所示?？梢匀斯ず铣缮鲜?條探針。 2、芯片的制備將上述I得到的5條探針分別用點樣緩沖液(博奧生物有限公司晶芯·》芯片點樣液，產(chǎn)品目錄號440010)溶解，濃度為50 μ M，每條探針橫向重復(fù)3點點在醛基化玻璃片基芯片(博奧生物有限公司晶芯》微陣列基片，產(chǎn)品目錄號420022)上，每點約O. 25nL，點直徑約180 μ m,點間距為300 μ m,點樣均勻度的標(biāo)準(zhǔn)方差為15%。將芯片點有探針的一面在65°C水浴鍋上水合IOs,芯片距水面距離為3cm,在空氣中室溫自然干燥,在進(jìn)行一次水合。將點有探針的一面向上，放在紫外交聯(lián)儀中250mJ交聯(lián)。將芯片放在42°C預(yù)熱，O. 5% SDS清洗lOmin。將芯片轉(zhuǎn)移到42°C預(yù)熱蒸餾水中清洗2min。把芯片放在50mL錐形離心管中，2000rpm離心lmin，以去除芯片表面的液體，獲得篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的芯片。篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的芯片如圖I所示，圖I中1-5為鱷梨日斑類病毒屬類病毒篩查芯片探針1-5 (分別對應(yīng)序列l(wèi)-5)，Hex為芯片固定陽性質(zhì)控，PC為雜交陽性質(zhì)控，NC為雜交陰性質(zhì)控。實施例2、篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的芯片的應(yīng)用一、篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的芯片檢測樣品I、用于檢測的樣品總RNA提取I)取感染鱷梨日斑類病毒的鱷梨葉片(鱷梨日斑類病毒拉丁名Avocadosunblotch viroid,購自 American type culture collection 簡稱 ATCC, PV_663)0. lg,用液氮研磨成粉末狀后，按照納米磁珠植物病毒RNA提取試劑盒(武漢哇哇噻納技術(shù)開發(fā)有限公司，產(chǎn)品目錄號EX1011)說明進(jìn)行樣品總RNA提取，-20°C保存?zhèn)溆谩?、樣品標(biāo)記與雜交將上述得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR擴增，即在O. 2mL的反應(yīng)管中加入cDNA產(chǎn)物2 μ L、上游引物O. 5 μ L (終濃度為 0. 5mmol/L)、下游引物 0. 5μ L (終濃度為 0. 5mmoL/L)、dNTP Mix (10mmol/L) O. 5 μ L、Taq 酶(5U/ μ L) O. 5 μ L、PCR 緩沖液(10 X ) 2 μ L 及 DEPC-H2O 14 μ L，然后按照 PCR 反應(yīng)程
序進(jìn)行擴增。上游引物5’-AGTTCACTCGTCTTCAATCTC-3’(序列 6)；下游引物5，-CTGAAGAGACGAAGTGATCAA-3，(序列7)；
其PCR 反應(yīng)程序為94°C 5min;94°C 30s、53°C 30s,72°C 30s;共 30 個循環(huán)；72°C延伸8min，得到PCR產(chǎn)物。Klenow酶標(biāo)記體系為25 μ L，即在O. 2mL的PCR反應(yīng)管中加入PCR產(chǎn)物5 μ L，9N隨機引物(invitrogen，Cat. No. 48190-011)( 100 μ mol/L)2 μ L 及 H2O 12μ L，95°C變性 3min,冰浴5min。然后向反應(yīng)管中加入IOXKlenow酶緩沖液2.5 μ L，dNTP (2. 5mmol/L) 2μ L,cy3~dCTP O. 5 μ L (Amersham, Cat. No. PA 53021 終濃度為 5nmol/L), klenow 酶(5U/ μ L)I μ L。37°C反應(yīng)I. 5h，70°C變性5min，冰浴5min，得到標(biāo)記樣品。雜交體系為16 μ L，包括 2. 4μ L SSC (終濃度 3Χ )、0· 32 μ LSDS (終濃度 O. 2% )、4μ L 甲酰胺(終濃度 25%)、1· 6μ L Denhardt，s (Ameresco, Cat. No. Ε717，終濃度 5Χ )和標(biāo)記樣品7. 68 μ L0 95°C變性3min，冰浴5min，瞬時離心。將雜交液加到芯片上，蓋玻片蓋好，42°C水浴雜交過夜(12h)，得到雜交后的芯片(鱷梨日斑類病毒)。3、洗滌、掃描清洗體系及程序如下
權(quán)利要求
1.一種鑒定或輔助鑒定鱷梨日斑類病毒屬類病毒的探針組，由探針I(yè)-探針5共5條探針組成，所述探針I(yè)-探針5的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-5。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的探針組，其特征在于所述鱷梨日斑類病毒屬類病毒為鱷梨日斑類病毒。
3.—種篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的基因芯片，為將權(quán)利要求I或2所述的探針組固定在片基表面得到的基因芯片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述片基為醛基化玻璃片基；所述鱷梨日斑類病毒屬類病毒為鱷梨日斑類病毒。
5.一種篩查鱷梨日斑類病毒的試劑盒，包括權(quán)利要求3或4所述的基因芯片。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括用于擴增所述鱷梨 日斑類病毒屬類病毒的cDNA的引物對，所述引物對具體由序列表中序列6和序列表中序列7所示的DNA分子組成；所述鱷梨日斑類病毒屬類病毒為鱷梨日斑類病毒。
7.權(quán)利要求I或2所述探針組、權(quán)利要求3或4所述的基因芯片、權(quán)利要求5或6所述的試劑盒在如下I) -4)中的應(yīng)用 O鑒定或輔助鑒定鱷梨日斑類病毒屬類病毒； 2)制備鑒定或輔助鑒定鱷梨日斑類病毒屬類病毒產(chǎn)品； 3)鑒定或輔助鑒定待測植物感染鱷梨日斑類病毒屬類病毒； 4 )制備鑒定或輔助鑒定待測植物感染鱷梨日斑類病毒屬類病毒產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述鱷梨日斑類病毒屬類病毒為鱷梨日斑類病毒；所述待測植物為鱷梨。
9.一種篩查或輔助篩查待測植物感染鱷梨日斑類病毒屬類病毒的方法，包括如下步驟 1)將待測植物的組織的cDNA進(jìn)行標(biāo)記，得到標(biāo)記后產(chǎn)物； 2)將步驟I)得到的標(biāo)記后產(chǎn)物與權(quán)利要求3或4所述的基因芯片進(jìn)行雜交，得到雜交后芯片； 3)將步驟2)得到的雜交后芯片掃描， 若所述基因芯片上的至少一條所述探針的信號絕對值不小于600且信噪比不小于3.0，則待測植物感染或候選感染鱷梨日斑類病毒屬類病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述標(biāo)記為以所述cDNA為模板，以權(quán)利要求6所述的試劑盒中的引物對進(jìn)行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，再將所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行Klenow酶標(biāo)記，得到標(biāo)記后產(chǎn)物； 步驟2)中，所述雜交的溫度為42°C，所述雜交的時間為12h ； 在所述步驟2)后和步驟3)前還包括將所述雜交后芯片進(jìn)行洗滌的步驟； 所述至少一條所述探針為權(quán)利要求I或2所述探針組中的任意一條； 所述待測植物為鱷梨，所述組織為葉片； 所述鱷梨日斑類病毒屬類病毒為鱷梨日斑類病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的芯片及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定鱷梨日斑類病毒屬類病毒的探針組，由5條探針組成，所述5條探針的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-5。還提供了篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的基因芯片，為將上述的探針組固定在片基表面得到的基因芯片。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明采用生物信息學(xué)方法對鱷梨日斑類病毒屬類病毒的核苷酸序列進(jìn)行分析，設(shè)計了該組的兼容性探針，標(biāo)準(zhǔn)類病毒樣品驗證結(jié)果證明探針效果良好。本發(fā)明的篩查鱷梨日斑類病毒屬類病毒的芯片可用于鱷梨日斑類病毒屬類病毒的檢疫鑒定。
文檔編號C12N15/11GK102719559SQ20121019339
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者張永江, 朱水芳, 李明福, 李桂芬, 趙文軍, 辛言言, 魏梅生 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院