專利名稱：云南番茄曲葉病毒基因組的分離鑒定及其農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及云南番茄曲葉病毒基因組的分離鑒定及其侵染性克隆構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
雙生病毒(Geminivirus)是世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的一類植物單鏈DNA病毒，病毒粒子為典型的雙聯(lián)體顆粒形態(tài)，大小約18 20 nmX30 nm，基因組為單鏈環(huán)狀DNA。一般發(fā)生在熱帶、亞熱帶地區(qū)，溫帶地區(qū)偶有發(fā)生，由昆蟲介體以持久性方式傳播，大多侵染寄主植物的韌皮部組織。依據(jù)基因組結(jié)構(gòu)、昆蟲介體、寄主范圍的不同，國際病毒分類委 員會(huì)將雙生病毒科劃分為四個(gè)屬玉米線條病毒屬甜菜曲頂病毒屬)、番爺偽曲頂病毒屬(Jopocuvirus')和菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)0大多具有經(jīng)濟(jì)危害性的雙生病毒屬于菜豆金色花葉病毒屬。大部分該屬病毒的基因組結(jié)構(gòu)是雙組份，含有DNA-A和DNA-B，DNA-A和DNA-B基因組大小為2. 5-3. Okb,DNA-A和DNA-B序列之間有一非常保守的共同區(qū)。還有一些病毒是單組份結(jié)構(gòu)，類似于雙組份的DNA-A，并且單組份足以引發(fā)病毒的成功侵染和致病癥狀，如番茄黃花葉病毒(Tomatoyellow mosaic virus, ToYMV),番爺花葉病毒(Tomato mosaic virus, ToMV)。近年來，在單組份雙生病毒上發(fā)現(xiàn)一種新型的衛(wèi)星DNAP分子，該分子大小約為輔助病毒DNA-A的一半，衛(wèi)星DNAP依賴輔助病毒進(jìn)行復(fù)制、移動(dòng)和包裹，但輔助病毒必須與衛(wèi)星DNAP分子共同侵染才能在寄主上引發(fā)典型的癥狀，如中國番爺黃化曲葉病毒(Tomato yellow leafcurl China virus, TYLCCNV)及其衛(wèi)星 DNAP 分子(Tomato yellow leaf curl Chinabetasatellite, TYLCCNB)。2004至2011年，在云南的元謀地區(qū)多次采集到黃脈、曲葉、葉脈突起癥狀的番茄樣品，經(jīng)基因組抽提、PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該病毒全長2749個(gè)核苷酸，具有典型的單組份雙生病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征，病毒鏈編碼外殼蛋白(AVl)和AV2蛋白，互補(bǔ)鏈編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(AC1)、轉(zhuǎn)錄激活蛋白(AC2)、復(fù)制增強(qiáng)蛋白(AC3)及癥狀相關(guān)蛋白(AOi),中間被一個(gè)277個(gè)核苷酸的非編碼區(qū)(IR)分隔。IR區(qū)含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)和保守九核苷酸序列TAATATT丨AC U是病毒滾環(huán)復(fù)制剪切位點(diǎn))、TATA盒及重復(fù)序列。根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)關(guān)于雙生病毒的分類標(biāo)準(zhǔn)，雙生病毒全基因組序列的同源性低于89%，則認(rèn)為是一個(gè)病毒新種。云南番茄曲葉病毒的全基因組序列與GenBank上所有已知雙生病毒的同源性最高為87%,因此,我們認(rèn)為這是一個(gè)病毒新種,命名為云南番爺曲葉病毒(Tomato leaf curlYunnan virus, ToLCYnVX植物病毒侵染性克隆是研究病毒功能基因組的至關(guān)重要的平臺(tái)。在分子生物學(xué)水平研究病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能、以及寄主與傳毒介體、病毒三者之間的互作，必須首先獲得病毒的侵染性克隆。在此基礎(chǔ)上才能獲得病毒野生型分子或者突變型分子的均一群體，進(jìn)而利用DNA重組技術(shù)進(jìn)行突變、插入、置換、缺失以及互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)對(duì)病毒基因組進(jìn)行功能區(qū)域的定位，才有可能在寄主植物表型水平上反映和評(píng)價(jià)基因功能的表達(dá)。根據(jù)雙生病毒科不同屬病毒的特征，雙生病毒侵染性載體構(gòu)建主要方法為磨擦接種法、基因槍法、農(nóng)桿菌注射法。磨擦接種法操作簡(jiǎn)單，但只適用于能夠機(jī)械傳播的病毒，而大部分雙生病毒都不能經(jīng)過磨擦接種侵染寄主植物，因此這一方法適用的病毒很少?；驑尫ㄖ恍杼峒儾《镜腄NA或簡(jiǎn)單的TA克隆,對(duì)病毒克隆的要求不聞,但聞度依賴于精密的基因槍等實(shí)驗(yàn)設(shè)備，且每次基因槍轟擊所消耗金粉的費(fèi)用昂貴，不同植物甚至同一植株不同部分的試驗(yàn)條件難以統(tǒng)一，這種成本高、儀器依賴性強(qiáng)、操作繁瑣、可控性差的基因槍法在實(shí)際應(yīng)用中難以推廣。農(nóng) 桿菌注射法首先在雙鏈DNA病毒花椰菜花葉病毒中成功應(yīng)用，并逐漸被應(yīng)用于雙生病毒。這種方法的關(guān)鍵步驟是通過分子生物學(xué)方法將1-2個(gè)重復(fù)的雙生病毒全基因組構(gòu)建到高效植物表達(dá)載體中，再轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌，注射植物進(jìn)行侵染接種。農(nóng)桿菌注射法是目前操作相對(duì)簡(jiǎn)單、應(yīng)用最廣和最有效的方法。但農(nóng)桿菌注射方法由于需要用接種緩沖液對(duì)菌液進(jìn)行后期處理，操作步驟繁瑣，降低了實(shí)驗(yàn)效率，并且注射接種法對(duì)于莖桿粗硬的植物可操作性差，影響了雙生病毒接種效率。本發(fā)明利用農(nóng)桿菌注射法的優(yōu)點(diǎn)，并對(duì)接種方法進(jìn)行了改造。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種雙生病毒新種云南番茄曲葉病毒基因組的分離鑒定及其農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆的構(gòu)建方法。雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組的分離鑒定方法包括如下步驟
O從云南采集葉片卷曲、黃化、葉脈外突癥狀的番茄病葉，用CTAB方法提取番茄基因組總DNA ；
2)以番茄基因組總DNA為模板，根據(jù)雙生病毒的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物I:5’ -TAATATTACCKGWKGVCCSC-3’ 和簡(jiǎn)并引物 2 :5’ -TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3’，PCR 擴(kuò)增病毒的部分序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至T-Vector，對(duì)克隆產(chǎn)物進(jìn)行陽性克隆的篩選及序列測(cè)定；
3)根據(jù)測(cè)得的部分序列設(shè)計(jì)特異全長引物Y194F:5’ - AATCATGGCCGCTCCTCAAAGC-3’和Y194R :5’ - GACATACGCGAATGCGGGAAC -3’，以番茄基因組總DNA為模板PCR擴(kuò)增病毒的全基因組DNA，病毒全長PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至T-Vector，篩選陽性克隆并進(jìn)行全序列測(cè)定；
4)序列測(cè)定結(jié)果通過DNAStar分析軟件進(jìn)行組合、拼接，獲得雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組DNA序列。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的新種云南番茄曲葉病毒侵染性克隆的構(gòu)建方法包括如下步驟
1)根據(jù)雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組DNA序列，利用PCR、限制性酶切、連接的方法把I. 4個(gè)正向重復(fù)的基因組DNA構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBinPLUS上，獲得帶有I. 4個(gè)正向重復(fù)基因組DNA的重組植物表達(dá)載體；
2)通過電擊方法將上述重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105；
3)帶有重組植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種YEP平板培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)24-48小時(shí)至形成菌落；
4)選用4-6葉充分展開的云南番茄苗齡期植株，用牙簽挑取固體菌落對(duì)植株進(jìn)行傷口感染，接種的具體方法和部位在距離根部1-2 cm莖干處取三點(diǎn)進(jìn)行扎刺接種；5)接種植株置于25°C隔離溫室培養(yǎng)，一周后觀察接種植株的癥狀；
6)對(duì)有癥狀表型和沒有癥狀表型的云南番茄苗齡期植株分別進(jìn)行ELISA、PCR和Southern blot檢測(cè)以確定新種云南番爺曲葉病毒的侵染和積累量。雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組DNA序列用于田間云南番茄曲葉病毒的快速檢測(cè)。所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的新種云南番爺曲葉病毒侵染性克隆用于云南番爺曲葉病毒的致病性測(cè)定、病毒基因功能研究及寄主植物、傳毒介體與病毒三者之間的互作研究。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果是 I)分離鑒定了一個(gè)雙生病毒新種云南番茄曲葉病毒的基因組DNA ；2)提供了云南番茄曲葉病毒的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆的構(gòu)建方法，該方法操作簡(jiǎn)易、侵染效率高；3)利用本發(fā)明構(gòu)建的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆接種植株，避免了常規(guī)農(nóng)桿菌菌液接種方法上的缺陷，無需繁瑣的操作，對(duì)儀器的依賴性低，且重復(fù)性好、快速高效、簡(jiǎn)單易學(xué)、利于大規(guī)模推廣；4)利用本發(fā)明可以用于田間云南番茄曲葉病毒的快速檢測(cè)；5)利用本發(fā)明可以通過突變、缺失、插入、置換以及互補(bǔ)進(jìn)行病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能及病毒、寄主、傳毒介體互作機(jī)制研究。


圖I轉(zhuǎn)云南番茄曲葉病毒AC4基因的本氏煙癥狀；
圖2云南番茄曲葉病毒田間檢測(cè)的PCR結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過PCR擴(kuò)增、基因克隆、序列測(cè)定等實(shí)驗(yàn)分離鑒定了雙生病毒新種云南番茄曲葉病毒。以云南番茄曲葉病毒Y194分離物為例進(jìn)行侵染性克隆的構(gòu)建，在序列測(cè)定的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物把I. 4個(gè)正向重復(fù)的全長基因組DNA克隆到高復(fù)制量的植物表達(dá)載體上，重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿菌接種的方法使病毒基因組進(jìn)入植物細(xì)胞并開始自行復(fù)制，從而實(shí)現(xiàn)病毒對(duì)植物的高效感染，該方法快速高效、重復(fù)性好、適用性廣。雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組的分離鑒定方法包括如下步驟
1)從云南采集葉片卷曲、黃化、葉脈外突癥狀的番茄病葉，用CTAB方法提取番茄基因組總DNA ；
2)以番茄基因組總DNA為模板，根據(jù)雙生病毒的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物I:5’ -TAATATTACCKGWKGVCCSC-3’ 和簡(jiǎn)并引物 2 :5’ -TGGACYITRCAWGGBCCTTCACA-3’，PCR 擴(kuò)增病毒的部分序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至T-Vector，對(duì)克隆產(chǎn)物進(jìn)行陽性克隆的篩選及序列測(cè)定；
3)根據(jù)測(cè)得的部分序列設(shè)計(jì)特異全長引物Y194F:5’ - AATCATGGCCGCTCCTCAAAGC-3’和Y194R:5’ - GACATACGCGAATGCGGGAAC _3’，以番茄基因組總DNA為模板PCR擴(kuò)增病毒的全基因組DNA，病毒全長PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至T-Vector，篩選陽性克隆并進(jìn)行全序列測(cè)定；
4)序列測(cè)定結(jié)果通過DNAStar分析軟件進(jìn)行組合、拼接，獲得雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組DNA序列。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的新種云南番茄曲葉病毒侵染性克隆的構(gòu)建方法包括如下步驟
I)根據(jù)雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組DNA序列，利用PCR、限制性酶切、連接的方法把I. 4個(gè)正向重復(fù)的基因組DNA構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBinPLUS上，獲得帶有I. 4個(gè)正向重復(fù)基因組DNA的重組植物表達(dá)載體；
2)通過電擊方法將上述重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105；
3)帶有重組植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種YEP平板培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)24-48小時(shí)至形成菌落；
4)選用4-6葉充分展開的云南番茄苗齡期植株，用牙簽挑取固體菌落對(duì)植株進(jìn)行傷口感染，接種的具體方法和部位在距離根部1-2 cm莖干處取三點(diǎn)進(jìn)行扎刺接種；
5)接種植株置于25°C隔離溫室培養(yǎng)，一周后觀察接種植株的癥狀；
6)對(duì)有癥狀表型和沒有癥狀表型的云南番茄苗齡期植株分別進(jìn)行ELISA、PCR和Southern blot檢測(cè)以確定新種云南番爺曲葉病毒的侵染和積累量。 雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組DNA序列用于田間云南番茄曲葉病毒的快速檢測(cè)。所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的新種云南番爺曲葉病毒侵染性克隆用于云南番爺曲葉病毒的致病性測(cè)定、病毒基因功能研究及寄主植物、傳毒介體與病毒三者之間的互作研究。下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例I云南番茄曲葉病毒Y194基因組DNA的克隆和測(cè)定 I)植物總DNA的抽提
稱取O. 5-1. O g田間云南番茄曲葉病毒發(fā)病葉片，加液氮研磨至粉末狀，將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)入50 ml加有4-8 ml CTAB抽提液[含2% (v/v) 2-巰基乙醇(2_Me)]的離心管中。65°C水浴加熱，每20-30分鐘顛倒混勻，I h后加入等體積的24:1的氯仿/異戊醇，上下顛倒混勻后4°C 10, 000 rpm離心5 min。取上清轉(zhuǎn)入另一新的50 ml離心管中，加入1/10上清體積的CTAB/NaCl以及等體積的24 I的氯仿/異戊醇混勻，再4°C 10，000 rpm離心5 min。取上清轉(zhuǎn)入另一新的50 ml離心管中，加入1/10上清體積的3 M NaAc (pH5.2)和等體積的_20°C預(yù)冷的異丙醇，_20°C放置I h。4°C 12，000 rpm離心5 min ;棄上清。沉淀用70%酒精洗一次，S卩加入2 ml 70%酒精，4°C 10, 000 rpm離心5 min。將塊狀DNA沉淀用干凈的槍頭轉(zhuǎn)移至I. 5 ml離心管中，適度干燥后用200-500 μ L ddH20溶解即得植物總DNA。2) PCR擴(kuò)增、克隆以及全基因組序列測(cè)定和分析
以上述提取的植物總DNA為模板，用簡(jiǎn)并引物1(5’ -TAATATTACCKGWKGVCCSC-3’ )和簡(jiǎn)并引物 2(5’ -TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3’ )對(duì) DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為94°C3 min;94°C變性 45 sec，52°C退火 30 sec，72°C延伸 45 sec，30 個(gè)循環(huán)后，72°C延伸 10 min, PCR獲得約500 bp長的條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)QiaGen膠純化Kit回收后克隆至pGEM_TVector,陽性克隆經(jīng)PCR或酶切鑒定進(jìn)行序列測(cè)定和分析。在序列測(cè)定和分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)另一對(duì)背靠背的全長引物 Y194F (5，- AATCATGGCCGCTCCTCAAAGC-3’)和 Y194R (5，-GACATACGCGAATGCGGGAAC -3’ )進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物為約2. 7kb的條帶。經(jīng)QiaGen膠純化Kit回收后克隆至pGEM-T Easy Vector，獲得陽性克隆pGEM_T_DNA。測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，并用DNAstar的Seqman進(jìn)行序列拼接得到194 DNA的全長基因組序列如SEQ ID NO: I,共 2749 bp ο實(shí)施例2云南番茄曲葉病毒Y194侵染性克隆的構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙生病毒的侵染性克隆需要I. 3 — 2. O個(gè)重復(fù)以上的全長基因組，并且必須包括2個(gè)基因間隔區(qū)(IR區(qū))。以病毒基因組DNA為模板，以含有及I單酶切位點(diǎn)的Y194EF(5，_ GCGGAATTCCTTAAAGTGCTTTAG -3，)與 Y194ER (5，- TAGGAATTCATGGGAGCCCAAAG-3’)為引物,PCR擴(kuò)增并克隆至pGEM-T Vector，獲得pGEM_T_Y194，用漢·Η I和&oR I對(duì)PGEM-T-Y194進(jìn)行酶切，得到O. 4個(gè)全長DNA，插入用BanM I和&oR I雙酶切的雙元載體pBinPLUS 獲得 pBinPLUS_Y194_0. 4A ;用 &oR I 從 pGEM_T_Y194 切出一個(gè)完整的全長 DNA后插入pBinPLUS-Y194-0. 4A的相應(yīng)位點(diǎn)，得到pBinPLUS-Y194_l. 4A的侵染性克隆。實(shí)施例3重組載體電 擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
通過電擊的方法將重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌宿主細(xì)胞EHA105。首先，需要制備EHA105的感受態(tài)細(xì)胞。挑取農(nóng)桿菌EHA105的單菌落接種于5mL含40 μ g/mL利福平(Rif)的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C 200 rpm，培養(yǎng)至0D600 &0. 6，用1.5 mL離心管收集足夠的菌，4°C 8, 000 rpm離心I min,棄盡上清；菌體用200 μ L ddH20充分重懸,4°C 8, 000 rpm離心I min，棄盡上清，重復(fù)三次后，棄盡上清；最后菌體再用200 μ L ddH20充分重懸，即為農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。取10 4 1^重組質(zhì)粒？811^1^3-￥194-1.44加入到200 μ L根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，轉(zhuǎn)入電擊杯中，置于冰上10 min。調(diào)節(jié)電擊裝置(BIO-RAD)至電壓2400 V，按儀器指示進(jìn)行電擊。電擊完后，室溫靜置2 min后加入800 μ L YEP恢復(fù)培養(yǎng)基，28°C靜置I h，然后在28°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)2 h。最后取200 μ L涂布于含50 μ g/mL卡那霉素(Kan)和40 μ g/mL利福平(Rif)的YEP固體培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中28 °C倒置培養(yǎng)48 h。實(shí)施例4農(nóng)桿菌扎刺接種植株
pBinPLUS-Y194-l. 4A在含50 μ g/mL卡那霉素和40 μ g/mL利福平的YEP固體平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，28°C下培養(yǎng)48小時(shí)。接種植株選用4-6葉期充分展開的幼苗為宜。接種本氏煙、番茄、心葉煙、三生煙、普通煙。具體接種方法如下，取一根滅菌牙簽，挑取固體菌落，在距離根部l-2cm處取三點(diǎn)進(jìn)行韌皮部扎刺接種，接種植株置于25°C隔離溫室培養(yǎng)。實(shí)施例5云南番爺曲葉病毒侵染性克隆的侵染性測(cè)定
對(duì)接種植株進(jìn)行癥狀觀察，并對(duì)所有接種植株進(jìn)行PCR及ELISA檢測(cè)。接種4周后癥狀觀察表明，接種后的本氏煙呈現(xiàn)嚴(yán)重葉上卷、葉脈增厚的癥狀；番茄表現(xiàn)出葉下卷、葉脈增厚的癥狀；心葉煙有葉脈增厚的表型；三生煙呈現(xiàn)葉下卷癥狀；矮牽牛具有葉上卷、葉脈增厚及葉表面針狀突起的癥狀。Y194 DNA侵染不同寄主上的侵染效率都非常高，在94%以上(見表I)。表I. Y194 DNA對(duì)不同寄主的侵染性及侵染效率檢測(cè)
94ΡΝΑI本氏煙I番茄I心葉煙I三生煙I矮牽牛
i病株數(shù) / 接種株數(shù)而/66 59/60 31/32 30/3~ 32/32 侵染效率(%)100 98 97 94 100
EILSA檢測(cè)—陽性 ΙΙΓ陽性陽性陽性
PCR檢測(cè)I陽性 I陽性I陽性 I陽性 I陽性
實(shí)施例6田間病毒病樣品特異性檢測(cè)
針對(duì)云南番茄曲葉病毒的外殼蛋白堿基序列，設(shè)計(jì)云南番茄曲葉病毒的特異引物 ToLCYnVF (5， -GTCCCGCCGATATAGTCATTTCC-3’)和 ToLCYnVR(5’ -GAGAATCATAAAAATAGATACGG-3’)。采集田間葉片卷曲、黃化、葉脈外突等疑似云南番茄曲葉病毒病癥狀的番茄、煙草、辣椒、及雜草等48個(gè)樣品，用CTAB法提取DNA后，用此特異引物對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C 2 min ;94°C變性45 sec，48°C退火30 sec，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸10 min。PCR產(chǎn)物用I. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若有750 bp的目的條帶，則表明樣品感染了云南番茄曲葉病毒。圖2電泳結(jié)果表明，部分番茄和煙草樣品檢測(cè)到云南番茄曲葉病毒。實(shí)施例7云南番茄曲葉病毒AC4基因功能研究
為了明確云南番茄曲葉病毒AC4的功能，設(shè)計(jì)特異性引物AC4F(5，-ATGGGTCACTGCATCTCCATG-3，)和 AC4R (5，-TTAGGGCCTCTGCAGCAGCATC-3，)，PCR 擴(kuò)增AC4片段，并將AC4構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBin438上。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化本氏煙，獲得轉(zhuǎn)云南番茄曲葉病毒AC4基因的轉(zhuǎn)基因本氏煙。轉(zhuǎn)AC4基因本氏煙表現(xiàn)出葉片皺縮、上卷等典型云南番茄曲葉病毒病的癥狀(圖I)。轉(zhuǎn)基因結(jié)果說明，AC4是云南番茄曲葉病毒的癥狀決定因子。
序列表 (I) 一般資料
(1)申請(qǐng)人謝艷，周雪平，矯曉陽，吳建祥
(ii)發(fā)明主題云南番茄曲葉病毒基因組的分離鑒定及其農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆
構(gòu)建
(iii)序列數(shù)1
(2)SEQ ID NO: I 的資料
(i)序列特征
(A)長度2749堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈
(D)幾何結(jié)構(gòu)線性
(ii )分子類型云南番茄曲葉病毒Y194基因組DNA
(iii)推測(cè)非 (iv )反義非
(V )序列描述SEQ ID NO: I
accggatggccgcgcgattttttttaaagtggttcccgcattcgcgtatgtccaatcatggccgctcctcaaagcttaattattaaatggtcccctatataacttaggccccaagtatttacgttaaacatgtgggatcctttactcaacgagttcccggataccgtacatgggttcaggtgtatgcttgcaataaaatacctgcagcttgtagaaaatacgtattctcccgatacgttgggatacgatctaatacgcgatctcatacttgttatacgggtgagggattatgtcgaagcgtcccgccgatatagtcatttccactcccgcctccaaggtgcgtcgccgtctgaacttcgacagcccttacacacgtcgtgctgctgtccccactgtccgcgtcaccagaagacaaatatggaacaacaggcccatgtatcgaaagcccatgatgtaccggatgtacagaagccctgatgttccgaagggttgtgaaggcccatgtaaggtgcagtcatatgaggcccgtcatgatgtatctcatactggtaaggtgatatgtgtcacggatgttacacgtggtaatggtattacgcatcgagttggtaagaggttttgtgtgaaatctatttacgtcattgggaagatatggatggatgaaaatattaaattgaagaatcacaccaatacagttatgtttttccttgttagagatcggcgtccgagtggtactccgatggattttcaacaggtgtttaattgttatgacaatgagccaagcaccggtactgtgaagaatgatcttagagataggtttcaagtgattcgcaagttcaattatatggttactggtgggcaatatgcgtccaaagaacaagcagtggtgaagaagttcttgcgggttaatacccatgttgtgtataatcatcaagaacaggcgaagtatgaaaatcatactgagaatgcgttgttgttgtatatggtgtgtactcatgctagtaatcctgtatatgcgactttgaaagtccgtatctatttttatgattctcaaatgaattaataaatatttagttttatatcatgatcttcaattacatcaatcgtgccttctaggacattgtataatacatgagatattgctctaattacattgttgatgctaatcactcccaatctatctaaatatttaatacattgatacttaaatactcttaagaaacgcaatgtctgaggatgtaaacgagtccagattttgcaggttagaaaacatttgtgtatccccaacgctttcctcaggttgtagttgaattggacttgtaatgtgattatgtcgtggttcctcagaaatggtcgctctaggtgtttggttatcttgaaataaaggggatttttgaccgtccaaatataaacgccattctctgcttgagctgcagtgagtagttcccctgtgcgtgaatccattatcgtgacagccaatggcgagaaagtatgaacagccacagggtagatcaactctccgtcgtctggttgtcttcttggcgattcggtgttgcaccttgataggaacctgagtagagtgggccttggagggtgacgaagatcgcattttttagcgcccaatttcgaagtgcggtgttcttttcctcttccagatactctttatagctggaattgggtcctggattgcagaggaagatagtgggtattccgcctttaatttgaactggtttcccgtatttggtgttactttgccagtccctttgggctcccatgaattccttaaagtgctttaggtagtgcggatctacgtcatcaatgacgttgaaccaagcatcattattgtacacctttggactcagatccaaatgaccacacaaataattatgtggtcctaatgacctggcccacatcgtcttcccc、gttctactatcaccctctatgactatacttatcggtcttaaaggccgcgcagcggcactgacaacattatccaccgcccaatcttcaagttcttctggaacttgatcaaaagaagaagaagcaaatggagaaatatatacctccaacggaggtgcaaaaatcctatctaaattagattttaaattatgatattgaaaaatataatctttcggcagtttctcccgaataacagccatagcggcttcagcggaacctgtgtttagggcctctgcagcagcatcattagctgtctgttgacctcctcgtgcagatcttccatcgatctgaaaactaccccagtcgatgtaatcaccgtccttcttgatgtaggacttgacgtccgagctggacttagctccctggaagtttgggtggtattgggtggaggtattagggtgtgtgatgtcgaaatgtctgggattacggaactgggctttacctttgaattggatgagcacatggagatgcagtgacccattacgatgtttttcttgtgctactcgtatgaataatttatcggatgggcatggtatttgttgaatgatttctagggcttgttcttttggaatggggcatttgggataagtgagaaatatgtttttggctttcacttggaatgaattaagacgaggcattttgacttagtcaattgggtgctctctaaagtcctatggaatggggggctttgggtgcccatttataccgagcacccaaatggcaatatcgtaattccccaaataaggtcaaaattcaaaagtcgaaattcaaaagcggccatccgtataatattSEQ ID NO:2.簡(jiǎn)并引物 I :5，-taatattacckgwkgvccsc-3，
SEQ ID NO:3.簡(jiǎn)并引物 2 :5，-tggacyttrcawggbccttcaca-3’
SEQ ID NO:4. Y194F :5’ - aatcatggccgctcctcaaagc-3’
SEQ ID NO:5. Y194R :5’ - gacatacgcgaatgcgggaac -3’
SEQ ID NO :6. Y194EF 5’ - gcggaattccttaaagtgctttag -3’
SEQ ID NO:7. Y194ER 5’ - taggaattcatgggagcccaaag -3’
SEQ ID NO :8. ToLCYnVF 5’ -gtcccgccgatatagtcatttcc-3’
SEQ ID NO :9. ToLCYnVR 5’ -gagaatcataaaaatagatacgg-3’
SEQ ID NO: 10. AC4F 5’ -atgggtcactgcatctccatg-3’
SEQ ID NO:11. AC4R (5，-ttagggcctctgcagcagcatc-3’
權(quán)利要求
1.一種雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組的分離鑒定方法，其特征在于包括如下步驟O從云南采集葉片卷曲、黃化、葉脈外突癥狀的番茄病葉，用CTAB方法提取番茄基因組總DNA ；2)以番茄基因組總DNA為模板，根據(jù)雙生病毒的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物I: 5’ -TAATATTACCKGWKGVCCSC-3’ 和簡(jiǎn)并引物 2 :5’ -TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3’，PCR 擴(kuò)增病毒的部分序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至T-Vector，對(duì)克隆產(chǎn)物進(jìn)行陽性克隆的篩選及序列測(cè)定；3)根據(jù)測(cè)得的部分序列設(shè)計(jì)特異全長引物Y194F:5’ - AATCATGGCCGCTCCTCAAAGC-3’ 和Y194R:5’ - GACATACGCGAATGCGGGAAC _3’，以番茄基因組總DNA為模板PCR擴(kuò)增病毒的全基因組DNA，病毒全長PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至T-Vector，篩選陽性克隆并進(jìn)行全序列測(cè)定；4)序列測(cè)定結(jié)果通過DNAStar分析軟件進(jìn)行組合、拼接，獲得雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組DNA序列。
2.—種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的新種云南番爺曲葉病毒侵染性克隆的構(gòu)建方法,其特征在于包括如下步驟1)根據(jù)雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組DNA序列，利用PCR、限制性酶切、連接的方法把I. 4個(gè)正向重復(fù)的基因組DNA構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBinPLUS上，獲得帶有I. 4 個(gè)正向重復(fù)基因組DNA的重組植物表達(dá)載體；2)通過電擊方法將上述重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105；3)帶有重組植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種YEP平板培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)24-48小時(shí)至形成菌落；4)選用4-6葉充分展開的云南番茄苗齡期植株，用牙簽挑取固體菌落對(duì)植株進(jìn)行傷口感染，接種的具體方法和部位在距離根部1-2 cm莖干處取三點(diǎn)進(jìn)行扎刺接種；5)接種植株置于25°C隔離溫室培養(yǎng)，一周后觀察接種植株的癥狀；6)對(duì)有癥狀表型和沒有癥狀表型的云南番茄苗齡期植株分別進(jìn)行ELISA、PCR和 Southern blot檢測(cè)以確定新種云南番爺曲葉病毒的侵染和積累量。
3.—種如權(quán)利要求I所述的方法獲得的雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組DNA 序列的應(yīng)用，其特征在于所述的雙生病毒的新種云南番茄曲葉病毒基因組總DNA序列用于田間云南番茄曲葉病毒的快速檢測(cè)。
4.一種如權(quán)利要求2所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的新種云南番爺曲葉病毒侵染性克隆的構(gòu)建方法的應(yīng)用，其特征在于所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的新種云南番茄曲葉病毒侵染性克隆用于云南番茄曲葉病毒的致病性測(cè)定、病毒基因功能研究及寄主植物、傳毒介體與病毒三者之間的互作研究。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種云南番茄曲葉病毒基因組的分離鑒定及其農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆構(gòu)建方法。提取感病番茄的基因組總DNA，PCR克隆病毒全基因組DNA，序列測(cè)定獲得云南番茄曲葉病毒的全基因組序列。通過PCR和酶切的方法獲得1.4個(gè)正向重復(fù)的基因組，并插入到具有高度復(fù)制能力的植物表達(dá)載體pBinPLUS，重組載體通過電擊法導(dǎo)入具有強(qiáng)感染力的農(nóng)桿菌菌株EHA105，從而獲得以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的對(duì)寄主植物具有高效感染能力的侵染性克隆。本發(fā)明為云南番茄曲葉病毒田間檢測(cè)、基因組結(jié)構(gòu)與功能研究、寄主植物、傳毒介體與病毒三者之間的互作研究提供了成熟的方法和體系。
文檔編號(hào)C12N15/34GK102703435SQ20121019364
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月13日
發(fā)明者吳建祥, 周雪平, 矯曉陽, 謝艷 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)