專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)雌激素受體α基因上游TA重復(fù)序列的試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的試劑盒及檢測(cè)方法，采用Sanger測(cè)序法技術(shù)，能對(duì)人類(lèi)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，特異性好，準(zhǔn)確度高。
背景技術(shù)：
年輕女性月經(jīng)過(guò)少，是婦科常見(jiàn)癥狀。其危害是影響孕卵在子宮內(nèi)膜種植，導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)、不孕等，是閉經(jīng)的前驅(qū)癥狀。雌激素是調(diào)節(jié)月經(jīng)的主要激素，但臨床上發(fā)現(xiàn)一類(lèi)病人其雌激素水平正常，無(wú)內(nèi)外科及先天性疾病，稱(chēng)為原因不明月經(jīng)過(guò)少。同時(shí)，對(duì)大量原因不明月經(jīng)過(guò)少患者進(jìn)行宮腔鏡檢查發(fā)現(xiàn)，月經(jīng)過(guò)少患者中有許多病人的子宮內(nèi)膜光滑菲薄，表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育不良。與傳統(tǒng)的子宮內(nèi)膜損傷、疤痕學(xué)說(shuō)并不吻合。此類(lèi)患者雌激素 水平正常，由此我們自然想到是否雌激素受體環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙我們的前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了原因不明月經(jīng)過(guò)少患者雌激素受體(ER)表達(dá)減弱。使我們想到ER a基因改變可能導(dǎo)致雌激素受體(ER)的減少。N ilsson等認(rèn)為ER基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleo t idepoIymo rph ism, SN P)可能導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平失調(diào)，導(dǎo)致ERa表達(dá)、功能異常。在ERa基因上游有多種多態(tài)性位點(diǎn)存在，其中2個(gè)限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性的確切酶切位點(diǎn)已被確定，在內(nèi)含子I存在PvuII或X bal多態(tài)性。而且ER a基因上游Ikb存在T (thymine), A(aden ine)重復(fù)序列，它屬于基因的調(diào)控區(qū)，對(duì)基因表達(dá)起調(diào)控作用。所以我們?cè)噲D從ERa基因多態(tài)性探討原因不明月經(jīng)過(guò)少的發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究和治療提供理論依據(jù)。1999年，一位希臘學(xué)者研究了雌激素受體基因TA重復(fù)序列的變異性與子宮內(nèi)膜異位癥之間的關(guān)系，提出其變異性與子宮內(nèi)膜異位癥的病理發(fā)生機(jī)制有關(guān)。2003年，有臺(tái)灣學(xué)者同樣做了雌激素受體基因TA重復(fù)序列的變異性與子宮肌瘤易患性的研究，提出結(jié)論，雌激素受體基因多態(tài)性與子宮肌瘤的病理發(fā)生機(jī)制有關(guān)，且TA重復(fù)序列的長(zhǎng)度多態(tài)性與子宮肌瘤的易患性相關(guān)，TA重復(fù)的12次與13次變異狀態(tài)為子宮肌瘤的高發(fā)狀態(tài)，而16次TA重復(fù)則為相對(duì)低的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)。縱觀近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者們的研究不難發(fā)現(xiàn)，雌激素受體基因的結(jié)構(gòu)功能與疾病相關(guān)性逐漸受到關(guān)注，尤其是與激素依賴(lài)性疾病的關(guān)系，及與雌激素受體分布較多的靶器官相關(guān)的疾病關(guān)系也甚為密切。在臨床實(shí)驗(yàn)室中，目前檢測(cè)雌激素受體a基因TA重復(fù)序列的常用方法有測(cè)序法。Sanger測(cè)序法。其以自動(dòng)化、方法簡(jiǎn)便、分辨率高、測(cè)序片段長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，成為分子生物學(xué)和分子診斷的重要技術(shù)平臺(tái)，并廣泛應(yīng)用于遺傳病和腫瘤等方面的檢測(cè)和診斷。成為技術(shù)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是現(xiàn)有檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的引物特異性較差，擴(kuò)增條帶有非特異條帶干擾，影響測(cè)序結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種引物特異性較好，檢測(cè)效果好的檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的試劑盒。檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的試劑盒，包括紅細(xì)胞裂解液(本公司特有配置試劑，5ml)、核酸提取液(本公司特有配置試劑，2. 5ml)、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液(650 yl )，酶純化液，其特征在于所述PCR 擴(kuò)增反應(yīng)液包括PCR 緩沖液、(IOu I) dNTPs (I )、Taq 酶(0. 4 )、上游引物TAF0. 4 u I和下游引物TARO. 4 U I ;其中，上下游引物TAF/TAR的序列為T(mén)AF AACTCGATTTTGGCTTCA
TAR :GATCTTCTCGGTTCACTTG。
進(jìn)一步地，所述酶純化液包括EXOI 0.5 iil，CIP 0. I iil，水I. 4 ill。本發(fā)明還提供了用上述試劑盒檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的方法，其特征在于包括以下步驟(I)取全血樣本，加入紅細(xì)胞裂解液，裂解紅細(xì)胞；(2)加入核酸提取液，提取核酸；(3)加入PCR擴(kuò)增反應(yīng)液進(jìn)行DNA擴(kuò)增；(4)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測(cè)是否擴(kuò)增成功，選取目的條帶清晰較亮的進(jìn)行酶純化反應(yīng)；(5)采用Sanger測(cè)序法對(duì)酶純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)出被檢樣本中雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)。進(jìn)一步地，步驟3的擴(kuò)增反應(yīng)條件為95度5分鐘；98度10秒、56度20秒、68度30秒、40個(gè)循環(huán);68度2分鐘。步驟4的酶純化反應(yīng)為取擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物加入酶純化液中，反應(yīng)條件為37度50分鐘，95度5分鐘。步驟5測(cè)序反應(yīng)條件為95度4分鐘；95度15秒、50度20秒、60度2分鐘、25個(gè)循環(huán)。本發(fā)明將測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的檢測(cè)，開(kāi)發(fā)了一種新型的Er a基因上游TA重復(fù)序列檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明設(shè)計(jì)了將Er a基因上游TA重復(fù)序列包含在內(nèi)的擴(kuò)增引物，
序列(5，-3，)堿基數(shù)
TAFAACTCGATTTTGGCTTCA18
TARG A TCTTCTCGCfTTC ACTTG19對(duì)待檢樣本中的Er a基因進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物擴(kuò)增長(zhǎng)度為471bp，然后采用Sanger測(cè)序法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，最后檢測(cè)出被檢樣本中雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)。本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明的試劑盒對(duì)待檢樣本中的Era基因進(jìn)行擴(kuò)增，并結(jié)合Sanger測(cè)序技術(shù)，能對(duì)人類(lèi)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，特異性好，擴(kuò)增條帶單一，無(wú)非特異性條帶擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果好，準(zhǔn)確度高。


圖I為已有方法的舊引物電泳鑒定圖。圖2為本發(fā)明方法的新引物電泳鑒定圖。圖3為本發(fā)明測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的試劑盒，包括
(I)紅細(xì)胞裂解液 IOX (NH4CL 82mg/ml、NAHCO3 8. 4mg/ml、EDTA-NA2 3. 72mg/ml、DEPC_ddH20定容至配制體積)(2)核酸提取液(Tris I. 2114mg/ml、ChelexlOO 50mg/ml、10%SDS 0. 01%),(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括PCR緩沖液10 U I, dNTPsl U I, TaqO. 4 U I酶、上下游引物TAF/TAR各0. 4 ill ;其中，上下游引物TAF/TAR的序列為T(mén)AF AACTCGATTTTGGCTTCATAR GATCTTCTCGGTTCACTTG(4)酶純化液包括EXOI (核酸外切酶)0. 5 iil，CIP (堿性磷酸酶)0. I yl，水
I.4u I。實(shí)施例2本發(fā)明試劑盒的使用方法(I)核酸提取取500ul全血，放入到I. 5ml的離心管中，加入Iml紅細(xì)胞裂解液。上下翻轉(zhuǎn)，使完全混勻，旋轉(zhuǎn)脈動(dòng)15秒后放入離心機(jī)中離心,離心速率為5000rpm, IOmin.。倒掉上層液，可見(jiàn)離心管底部有血色沉淀。加入500ul紅細(xì)胞裂解液，重復(fù)此裂解步驟一次。離心5000rpm，5min，最后用移液管吸凈所有上層液棄去，以使離心管底部的血色沉淀不再殘留有裂解液，在沉淀里加入60ul核酸提取液(取之前反復(fù)吹打)，用槍頭混勻，金屬浴100度10分鐘，12000rpm, 5min,取上清-20度保存待用。(2) PCR 擴(kuò)增PCR 擴(kuò)增體系:2 氺 Buffer IOu 1，dNTPs I U 1，Taq 酶 0. 4 ii 1，上游引物0. 4iil，下游引物0. 4iil，純水5. 8iil，加2iil步驟一提取的DNA到18yl擴(kuò)增體系中，總體積為20 ill。反應(yīng)條件為95度5分鐘；98度10秒、56度20秒、68度30秒、40個(gè)循環(huán)；68度2分鐘。(3)電泳取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3微升進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測(cè)是否擴(kuò)增成功，選取目的條帶清晰較亮的進(jìn)行酶純化反應(yīng)。(4)酶純化試劑EX0I (核酸外切酶)，CIP (堿性磷酸酶)，酶純化體系為EX0I0. 5u 1,CIP 0. liil，水1.4iil。取I擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物加入到2 ill反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件37度50分鐘，95度5分鐘。(5)測(cè)序反應(yīng)試劑BigdyeTerminator V3. I (美國(guó) Applied Biosystems 公司)每個(gè)樣本取0. 2ml PCR反應(yīng)管2個(gè)，分別標(biāo)記上下游(雙向測(cè)序)，每管分別加入Iul Bigdye Terminator V3. 1，I yl水，酶純化產(chǎn)物2 yl，及上游或下游引物I yl，共5 yl體系。反應(yīng)條件為95度4分鐘；95度15秒、50度20秒、60度2分鐘，25個(gè)循環(huán)。(6)酒精純化試劑無(wú)水乙醇，75%乙醇EDTA.測(cè)序反應(yīng)結(jié)束，打開(kāi)管蓋，每管先加入2 U I EDTA，靜置5分鐘，終止測(cè)序反應(yīng)，隨后加入15 ii I無(wú)水乙醇，13500rpm離心30分鐘，離心結(jié)束倒去液體，并甩干，加入50 U I75%乙醇，13500rpm離心15分鐘，離心結(jié)束倒去液體，甩干，為了避免剩余酒精對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，需烘干。(7)上機(jī)測(cè)序儀ABI3100 Genetic Analyzer在烘干的離心管中加入IOiil HiDi，振蕩混勻，短暫離心收集，將液體全部轉(zhuǎn)移至96空板上上機(jī)測(cè)序。測(cè)序圖示例如圖1、2所示。圖I中已有方法舊引物有非特異條帶，圖2中本發(fā)明的新引物無(wú)非特異條帶。實(shí)施例3采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)臨床標(biāo)本取全血標(biāo)本186份，按實(shí)施例2所述方法檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)。結(jié)果如下表
權(quán)利要求
1.檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的試劑盒，其特征在于它包括紅細(xì)胞裂解液、核酸提取液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，酶純化液， 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括PCR緩沖液IOu Ud見(jiàn)？81111、1&9酶0.4111、上下游引物TAFO. 4iU/TAR0. 4iil，用純水補(bǔ)足至18 U I ;其中，上下游引物TAF/TAR的序列為T(mén)AF AACTCGATTTTGGCTTCATAR :GATCTTCTCGGTTCACTTG。
2.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的試劑盒，其特征在于，所述酶純化液包括EXOI 0.5 iil，CIP 0. I iil，水I. 4 ill。
3.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的試劑盒，其特征在于，所述的紅細(xì)胞裂解液 IOX =NH4CL 82mg/ml、NAHCO3 8. 4mg/ml、EDTA-NA2 3. 72mg/ml、DEPC-ddH20定容至配制體積。
4.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的試劑盒，其特征在于，所述的核酸提取液Tris I. 2114mg/ml、ChelexlOO 50mg/ml、10%SDS 0.01%。
5.用權(quán)利要求I所述試劑盒檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)取全血樣本，加入紅細(xì)胞裂解液，裂解紅細(xì)胞； (2)加入核酸提取液，提取核酸； (3)加入PCR擴(kuò)增反應(yīng)液進(jìn)行DNA擴(kuò)增； (4)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測(cè)是否擴(kuò)增成功，選取目的條帶清晰較亮的進(jìn)行酶純化反應(yīng)； (5)采用Sanger測(cè)序法對(duì)酶鈍化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)出被檢樣本中雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)。
6.如權(quán)利要求5所述的用試劑盒檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的方法，其特征在于，步驟3的擴(kuò)增反應(yīng)條件為95度5分鐘；98度10秒、56度20秒、68度30秒、40個(gè)循環(huán)；68度2分鐘。
7.如權(quán)利要求5所述的用試劑盒檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的方法，其特征在于，步驟4的酶純化反應(yīng)為取擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物加入酶純化液中，反應(yīng)條件為37度50分鐘，95度5分鐘。
8.如權(quán)利要求5所述的用試劑盒檢測(cè)雌激素受體a基因上游TA重復(fù)序列的方法，其特征在于，步驟5測(cè)序反應(yīng)條件為95度4分鐘；95度15秒、50度20秒、60度2分鐘、25個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)雌激素受體α基因上游TA重復(fù)序列的試劑盒及檢測(cè)方法，它包括紅細(xì)胞裂解液、核酸提取液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，酶純化液，其特征在于所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括PCR緩沖液、d NTP、Taq酶、上下游引物TAF/TAR；其中，上下游引物TAF/TAR的序列為T(mén)AFAACTCGATTTTGGCTTCA；TARGATCTTCTCGGTTCACTTG。采用本發(fā)明的試劑盒對(duì)待檢樣本中的Erα基因進(jìn)行擴(kuò)增，并結(jié)合Sanger測(cè)序技術(shù)，能對(duì)人類(lèi)雌激素受體α基因上游TA重復(fù)序列多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，特異性好，準(zhǔn)確度高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102747151SQ201210193709
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者方國(guó)偉, 王淑一, 葛嬋 申請(qǐng)人:福州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司