一種植物來源活性成分－納米級膜性囊泡的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種植物來源活性成分—納米級膜性囊泡的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：（1）植物原料原液的提??；（2）上清液或濃縮液的提??；（3）膜性囊泡的沉淀和重懸；（4）納米級均質(zhì)處理，獲得納米級顆粒，即植物來源活性成分納米級膜性囊泡。本發(fā)明還提供一種植物來源活性成分—不同密度納米粒子的制備方法。本發(fā)明采用植物原料制備納米級膜性囊泡，具有原料來源豐富，成本低，可大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，使規(guī)模化利用膜性囊泡成為現(xiàn)實(shí)。
【專利說明】一種植物來源活性成分一納米級膜性囊泡的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物性原料的制備，具體涉及一種植物來源活性成分膜性囊泡的制備。
【背景技術(shù)】
[0002]膜性囊泡(exosomes)是一種可由多種細(xì)胞分泌的直徑約為30_100nm雙層膜結(jié)構(gòu)的杯狀小囊泡。Exosomes能在細(xì)胞間傳遞蛋白、mRNA、microRNA等活性物質(zhì),參與許多重要的生理、病理過程，其獨(dú)特作用受到越來越多關(guān)注。
[0003]目前exosomes主要從細(xì)胞培養(yǎng)上清、腫瘤組織的滲出液等材料中獲取，分離方法主要有濾膜過濾法，超速離心法，蔗糖密度梯度離心法。從細(xì)胞培養(yǎng)上清等來源中獲取exosome,材料來源有限,材料成本較高，所獲得的exosomes含量很低,提純后的exosomes成本更高，這就制約了 exosomes的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。因此,探索從來源豐富的原料中提取exosomes,使其能夠?qū)崿F(xiàn)較低的生產(chǎn)成本及較高的產(chǎn)量,對于exosomes的大規(guī)模應(yīng)用具有重要意義。
[0004]多汁性植物中富含exosomes和納米級膜性囊泡(exosome_likenanoparticles),其攜帶的各種有效成分賦予植物來源exosomes和納米級膜性囊泡多種強(qiáng)大的生物學(xué)功能，使之能夠成為保健食品和治療性藥物的重要來源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種原料來源豐富、生產(chǎn)成本較低，可大量生產(chǎn)的植物來源活性成分納米級膜性囊泡(exosome-like nanoparticles)的制備方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種植物來源活性成分一納米級膜性囊泡的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:
(O植物原料原液的提取:將植物原料榨出汁液；
(2)上清液或濃縮液的提取:將榨出的液體離心后收集上清液，或超濾提取濃縮液；
(3)膜性囊泡的沉淀和重懸:將所述上清液或超濾濃縮液離心后收集沉淀，再將所得沉淀重新懸浮后獲得膜性囊泡重懸液；
(4)納米級均質(zhì)處理:膜性囊泡重懸液經(jīng)納米級均質(zhì)化，獲得納米級顆粒，即植物來源活性成分納米級膜性囊泡。
[0007]優(yōu)選的，所述上清液的提取步驟為:將榨出的液體以1000~4000轉(zhuǎn)/分鐘(RCF:9(Tl500Xg)離心5~40分鐘，棄沉淀，收集上清；上清液2000~8000轉(zhuǎn)/分鐘(RCF:30(T6000Xg)離心10~50分鐘，棄沉淀，收集上清；上清液6000~50000轉(zhuǎn)/分鐘(RCF:3000^240000 Xg)離心0.5~2小時，棄沉淀，收集上清。
[0008]優(yōu)選的，所述濃縮液的提取步驟為:將所述植物榨出汁液用10-12500目過濾材料過濾除去殘渣，收集濾過的液體；濾過液體采用0.1-0.5 μ m微濾膜過濾，收集微濾過的液體；再將微濾過的液體采用0.01~0.05 μ m超濾膜超濾，棄濾過液，收集富含膜性囊泡的濃縮液。
[0009]優(yōu)選的，所述濃縮液提取中的過濾步驟為采用至少一種網(wǎng)孔直徑的過濾材料，按照網(wǎng)孔直徑由大到小依次過濾。
[0010]優(yōu)選的，所述過濾材料為10~12500目濾網(wǎng)、0.1~0.5 μ m微濾膜和0.01~0.05 μ m
超濾膜中的一種或數(shù)種。
[0011]優(yōu)選的，所述膜性囊泡的沉淀和重新懸浮步驟為:將所述上清液或濃縮液以20000~200000轉(zhuǎn)/分鐘(RCF:150000~4000000Xg)離心0.1~3小時收集沉淀，再以生理鹽水或者磷酸緩沖液(PBS)重新懸浮膜性囊泡沉淀。
[0012]優(yōu)選的，所述納米級均質(zhì)化步驟為:將經(jīng)重懸處理后的膜性囊泡采用超高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)化或者振蕩機(jī)振蕩均質(zhì)化處理獲得納米級顆粒，即植物來源活性成分納米級膜性囊泡。
[0013]優(yōu)選的，所述植物原料原液的提取、上清液或濃縮液的提取都在0-37攝氏度環(huán)境中進(jìn)行。
[0014]優(yōu)選的，所述植物原料為多汁性植物。
[0015]優(yōu)選的，所述植物原料包括:葡萄、黃瓜、西瓜、西紅柿、草莓、藍(lán)莓、櫻桃、苦瓜、馬齒莧、人參、黨參、太子參、西洋參、丹參、白芷、前胡、牛膝、射干、虎杖、商陸、葛根、土伏苓、玄參、紅率、山藥、黃精、黃苗、大蒜、桑椹子、枸杞子、生姜、蒸枝、龍眼、仙靈脾、薄荷、柴胡、蒲公英、蘆根、金銀花、連翹、穿心蓮、魚腥草、大黃、蘆薈、番瀉葉、五味子、天麻、石斛或更多多汁性植物。
[0016]本發(fā)明還提供一種植物來源活性成分一不同密度納米粒子的制備方法，將所述均質(zhì)處理后的植物來源活性成分納米級膜性囊泡采用密度梯度離心，得到不同密度的樣品條帶，然后收集這些條帶用生理鹽水或磷酸緩沖液稀釋，再以6000-200000轉(zhuǎn)/分鐘(RCF:3000^4000000 X g)離心，收集沉淀，生理鹽水或磷酸緩沖液重懸沉淀,超高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)化或者振蕩機(jī)振蕩均質(zhì)化，就可得到不同密度的納米粒子。
[0017]優(yōu)選的，所述密度梯度離心是以蔗糖、氯化銫、氯化銣或溴化銫為梯度材料，所述密度梯度為8%、30%、45%、60%或更多不同濃度的所述梯度材料溶液。
[0018]優(yōu)選的，所述密度梯度的離心轉(zhuǎn)速是6000-50000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為0.1~3小時。
[0019]本發(fā)明采用植物原料制備納米級膜性囊泡，具有原料來源豐富，成本低，可大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，使規(guī)?；眉{米膜性囊泡成為現(xiàn)實(shí)。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
[0021]實(shí)施例1
(I)清水洗凈的黃瓜在20攝氏度環(huán)境中通過采用擠壓式壓榨機(jī)榨出汁液。
[0022](2)榨出的汁液經(jīng)10目、100目、600目濾網(wǎng)按網(wǎng)眼直徑從大到小依次過濾(在37攝氏度環(huán)境中操作)，收集過濾的液體。
[0023](3)將收集的液體以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心40分鐘，棄沉淀，收集上清；上清液2000轉(zhuǎn)/分鐘離心50分鐘，棄沉淀，收集上清；上清液6000轉(zhuǎn)/分鐘離心2小時棄沉淀，收集上清。上清液20000轉(zhuǎn)/分鐘離心3小時收集沉淀，用磷酸緩沖液重懸沉淀得到膜性囊泡重懸液。
[0024](4)膜性囊泡重懸液用納米級超高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)化處理獲得納米級顆粒，即納米膜性囊泡。
[0025](5)分裝樣品，納米膜性囊泡可在_80°C低溫冰箱長期保存 實(shí)施例2
(I)清水洗凈的丹參在8攝氏度環(huán)境中通過采用擠壓式壓榨機(jī)榨出汁液。
[0026](2)榨出的汁液經(jīng)800目、1200目濾網(wǎng)依次過濾(在20攝氏度環(huán)境中操作)，收集過濾的液體。
[0027](3)將收集的液體以2000轉(zhuǎn)/分鐘20分鐘，棄沉淀，收集上清；上清液4000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，棄沉淀，收集上清；上清液10000轉(zhuǎn)/分鐘離心I小時棄沉淀，收集上清。上清液30000轉(zhuǎn)/分鐘離心I小時收集沉淀，用生理鹽水重懸沉淀得到膜性囊泡重懸液。
[0028](4)膜性囊泡重懸液用納米級超高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)化處理獲得納米級顆粒。
[0029](5)分裝樣品，納米膜性囊泡可在_80°C低溫冰箱長期保存。
[0030]實(shí)施例3
(I)清水洗凈的大蒜在4攝氏度環(huán)境中榨出汁液。
[0031](2)榨出的汁液經(jīng)12500目濾網(wǎng)過濾(在10攝氏度環(huán)境中操作)，收集過濾的液體。
[0032](3)將收集的液體以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，棄沉淀，收集上清；上清液6000轉(zhuǎn)/分鐘離心40分鐘，棄沉淀，收集上清；上清液30000轉(zhuǎn)/分鐘離心I小時棄沉淀，收集上清。上清液40000轉(zhuǎn)/分鐘離心I小時收集沉淀，用生理鹽水重懸沉淀得到膜性囊泡重懸液。
[0033](4)膜性囊泡重懸液用振蕩機(jī)振蕩均質(zhì)化處理獲得納米膜性囊泡。
[0034](5)分裝樣品，納米膜性囊泡可在_80°C低溫冰箱長期保存。
[0035]實(shí)施例4
I)清水洗凈的蘆薈在10攝氏度環(huán)境中通過采用擠壓式壓榨機(jī)榨出汁液。
[0036](2)榨出的汁液經(jīng)6000目、10000目濾網(wǎng)依次過濾(在25攝氏度環(huán)境中操作)，收集過濾的液體。
[0037](3)將收集的液體以4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄沉淀，收集上清；上清液8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄沉淀，收集上清；上清液50000轉(zhuǎn)/分鐘離心0.5小時棄沉淀，收集上清。上清液100000轉(zhuǎn)/分鐘離心0.1小時收集沉淀，磷酸緩沖液重懸沉淀得到膜性囊泡重懸液。
[0038](4)膜性囊泡重懸液經(jīng)納米級超高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)化處理獲得納米級顆粒，即納米膜性囊泡。
[0039](5)分裝樣品，納米膜性囊泡可在_80°C低溫冰箱長期保存。
[0040]以上實(shí)施例中所述植物原料可以是葡萄、黃瓜、西瓜、西紅柿、草莓、藍(lán)莓、櫻桃、苦瓜、馬齒覓、人參、黨參、太子參、西洋參、丹參、白]E、前胡、牛膝、射干、虎杖、商陸、葛根、土伏苓、玄參、紅棗、山藥、黃精、黃芪、大蒜、桑椹子、枸杞子、生姜、荔枝、龍眼、仙靈脾、薄荷、柴胡、蒲公英、蘆根、金銀花、連翹、穿心蓮、魚腥草、大黃、蘆薈、番瀉葉、五味子、天麻、石斛或更多多汁性植物實(shí)施例5
用按照本發(fā)明方法所制備的植物來源活性成分納米級膜性囊泡提純不同密度的納米囊泡(即納米粒子)，在離心管中依次加入不同濃度的蔗糖溶液，采用密度梯度為8%、30%、45%,60%的蔗糖溶液，樣品置于蔗糖密度梯度溶液表面，然后以20000轉(zhuǎn)/分鐘超速密度梯度離心3小時，離心后在不同濃度蔗糖溶液之間有不同密度的樣品條帶，收集這些條帶，用生理鹽水稀釋后120000轉(zhuǎn)/分鐘離心，收集沉淀，用生理鹽水重懸，再經(jīng)超高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)化，即得到不同密度的納米囊泡(納米粒子)。
[0041]實(shí)施例6
用按照本發(fā)明方法所制備的植物來源活性成分納米級膜性囊泡提純不同密度的納米囊泡(即納米粒子)，在離心管中依次加入不同濃度的蔗糖溶液，采用密度梯度為8%、30%、45%,60%的蔗糖溶液，樣品置于蔗糖密度梯度溶液表面，然后以30000轉(zhuǎn)/分鐘超速密度梯度離心2小時，離心后在不同濃度蔗糖溶液之間有不同密度的樣品條帶，收集這些條帶，用磷酸緩沖液稀釋后6000轉(zhuǎn)/分鐘離心，收集沉淀，磷酸緩沖液重懸沉淀，經(jīng)振蕩機(jī)振蕩均質(zhì)化，即得到不同密度的納米囊泡(納米粒子)。
[0042]實(shí)施例7
用按照本發(fā)明方法所制備的植物來源活性成分納米級膜性囊泡提純不同密度的納米囊泡(即納米粒子)，在離心管中依次加入不同濃度的氯化銫溶液，采用密度梯度為10%、20%、30%、40%的氯化銫溶液，樣品置于氯化銫密度梯度溶液表面，然后以40000轉(zhuǎn)/分鐘超速密度梯度離心I小時，離心后在不同濃度氯化銫溶液之間有不同密度的樣品條帶，收集這些條帶，生理鹽水或磷酸緩沖液稀釋后40000轉(zhuǎn)/分鐘離心，收集沉淀，生理鹽水重懸，超高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)化，即得到不同密度的納米囊泡(納米粒子)。
[0043]實(shí)施例8
用按照本發(fā)明方法所制備的植物來源活性成分納米級膜性囊泡提純不同密度的納米囊泡(即納米粒子)，在離心管中依次加入不同濃度的氯化銣溶液，采用密度梯度為10%、20%、40%、60%的氯化銣溶液，樣品置于氯化銣密度梯度溶液表面，然后以50000轉(zhuǎn)/分鐘超速密度梯度離心0.1小時，離心后在不同濃度氯化銣溶液之間有不同密度的樣品條帶，收集這些條帶，磷酸緩沖液稀釋后50000轉(zhuǎn)/分鐘離心，收集沉淀，磷酸緩沖液重懸，振蕩機(jī)振蕩均質(zhì)化，即得到不同密度的納米囊泡(納米粒子)。
[0044]實(shí)施例5~8中的密度梯度可以是蔗糖、氯化銫、氯化銣或溴化銫為梯度材料。
[0045] 離心轉(zhuǎn)速不限于實(shí)施例中的所提到的具體數(shù)值，可以在權(quán)利要求和
【發(fā)明內(nèi)容】
中所指出的相應(yīng)轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)任意變化。
[0046]本發(fā)明采用植物原料制備納米級膜性囊泡，具有原料來源豐富，成本低，可大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，使規(guī)?；媚ば阅遗莩蔀楝F(xiàn)實(shí)。
[0047]以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種植物來源活性成分一納米級膜性囊泡的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: (1)植物原料原液的提取:將植物原料榨出汁液； (2)上清液或濃縮液的提取:將榨出的液體離心后收集上清液，或超濾提取濃縮液； (3)膜性囊泡的沉淀和重懸:將所述上清液或超濾濃縮液離心后收集沉淀，再將所得沉淀重懸后獲得膜性囊泡重懸液； (4)納米級均質(zhì)處理:膜性囊泡重懸液經(jīng)納米級均質(zhì)化，獲得納米級顆粒，即植物來源活性成分納米級膜性囊泡。
2.如權(quán)利要求1所述的植物來源活性成分一納米級膜性囊泡的制備方法，其特征在于，所述上清液的提取步驟為:將所述植物原料榨出汁液以1000~4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5~40分鐘，棄沉淀，收集上清；上清液2000~8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10~50分鐘，棄沉淀，收集上清；上清液6000~50000轉(zhuǎn)/分鐘離心0.5~2小時，棄沉淀，收集上清。
3.如權(quán)利要求1所述的植物來源活性成分一納米級膜性囊泡的制備方法，其特征在于，所述濃縮液的提取步驟為:將所述植物原料榨出汁液用10-12500目過濾材料過濾除去殘渣,收集濾過的液體；濾過液體采用0.1-0.5 μ m微濾膜過濾，收集微濾過的液體；再將微濾過的液體采用0.01~0.05 μ m超濾膜超濾，棄濾過液，收集富含膜性囊泡的濃縮液。
4.如權(quán)利要求1所述的植物來源活性成分一納米級膜性囊泡的制備方法，其特征在于，所述膜性囊泡的沉淀和重懸步驟為:
將所述上清液或濃縮液以20000~200000轉(zhuǎn)/分鐘離心0.1~3小時收集沉淀，再以生理鹽水或者磷酸緩沖液重懸膜性囊泡沉淀。
5.如權(quán)利要求1至5任一所述的植物來源活性成分一納米級膜性囊泡的制備方法，其特征在于，所述植物原料原液的提取、上清液或濃縮液的提取都在0-37攝氏度環(huán)境中進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求1至5任一所述的植物來源活性成分一納米級膜性囊泡的制備方法，其特征在于，所述植物原料為多汁性植物。
7.如權(quán)利要求1至5任一所述的植物來源活性成分一納米級膜性囊泡的制備方法，其特征在于，所述植物原料為葡萄、黃瓜、西瓜、西紅柿、草莓、藍(lán)莓、櫻桃、苦瓜、馬齒莧、人參、黨參、太子參、西洋參、丹參、白芷、前胡、牛膝、射干、虎杖、商陸、葛根、土伏苓、玄參、紅棗、山藥、黃精、黃苗、大蒜、桑椹子、枸杞子、生姜、蒸枝、龍眼、仙靈脾、薄荷、柴胡、蒲公英、蘆根、金銀花、連翹、穿心蓮、魚腥草、大黃、蘆薈、番瀉葉、五味子、天麻、石斛或更多多汁性植物。
8.一種植物來源活性成分一不同密度納米粒子的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求1所述均質(zhì)處理后的植物來源活性成分納米級膜性囊泡采用密度梯度離心，分離得到不同密度的納米粒子。
9.如權(quán)利要求9所述的植物來源活性成分一不同密度納米粒子的制備方法，其特征在于，所述密度梯度離心是以蔗糖、氯化銫、氯化銣或溴化銫為梯度材料，所述密度梯度為8%、30%、45%、60%或更多不同濃度的所述梯度材料溶液。
10.如權(quán)利要求9所述的植物來源活性成分一不同密度納米粒子的制備方法，其特征在于，所述密度梯度的離心轉(zhuǎn)速是6000轉(zhuǎn)/分鐘飛0000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為0.1~3小時。
【文檔編號】A23L1/29GK103479682SQ201210196112
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月14日
【發(fā)明者】居頌光, 居頌文, 錢鳴宇 申請人:蘇州恒宇生物科技有限公司