專利名稱：一種抗草甘膦EPSP合成酶GmEPSPS-2及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種抗草甘膦EPSP合成酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種人工改造合成的抗草甘膦EPSP合成酶及其編碼基因GmEPSPS-2，以及含有該基因的表達(dá)載體及其在抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物研制方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
草甘膦是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)非選擇性、廣譜滅生性除草劑，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、高效、低毒、低殘留、易被微生物分解，不破壞土壤環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，成為目前世界上生產(chǎn)量最大的農(nóng)藥品種。其相關(guān)作用機(jī)理是由于草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的類似物，因此草甘膦、莽草酸-3-磷酸、EPSP合成酶容易結(jié)合形成EPSP-S3P-草甘膦復(fù)合體(此復(fù)合體非常穩(wěn)定)，阻止PEP與EPSP合成酶的結(jié)合，這樣草甘膦就競(jìng)爭(zhēng)性抑制莽草酸途徑中5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性，干擾生物體內(nèi)芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，導(dǎo)致生物死亡。 植物可以通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入對(duì)草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而獲得抗草甘膦的能力。根癌農(nóng)桿菌CP4、熒光假單胞菌G2和沙門氏菌CT7的EPSPS已經(jīng)在植物中得到廣泛的驗(yàn)證和應(yīng)用。隨著抗除草劑基因克隆的發(fā)展，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物也相繼問(wèn)世并大面積推廣應(yīng)用，這些轉(zhuǎn)基因作物具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)所用除草劑品種廣譜、選擇性強(qiáng)、對(duì)環(huán)境友好、使用方便，特別適用于少耕與免耕體系，加強(qiáng)了水分保持，大大減少了土壤流失，并形成了有機(jī)物質(zhì)來(lái)鎖住土壤碳并減少二氧化碳排放；同時(shí)減少機(jī)械耕作，節(jié)約燃料能源；(2)減少除草劑總使用量，使防治雜草費(fèi)用下降，有效地降低農(nóng)業(yè)成本，增加農(nóng)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效益；解決了常規(guī)除草劑難以防治的特殊雜草問(wèn)題，如稻田的野生稻、赤稻、寬葉臂形草、圓葉牽牛；小麥田的雀麥、莎草；大豆田的鴨趾草、純?nèi)~決明以及寄生雜草；(4)解決土壤長(zhǎng)殘留性除草劑對(duì)后茬作物的傷害。轉(zhuǎn)基因作物所使用的草甘膦無(wú)土壤殘留，故對(duì)后茬作物十分安全。從1996年轉(zhuǎn)基因作物首次商業(yè)化至今，耐除草劑性狀始終是轉(zhuǎn)基因作物的主要性狀。在2011年，轉(zhuǎn)基因作物耐除草劑性狀被運(yùn)用在了大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜以及苜蓿中，種植面積為9390萬(wàn)公頃，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的59%，比占全球轉(zhuǎn)基因作物面積15%的抗蟲(chóng)品種(2390萬(wàn)公頃)高出很多，這其中大部分為抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物品種。因此近年來(lái)包括美國(guó)和中國(guó)在內(nèi)的國(guó)家草甘膦產(chǎn)量急劇增加還與系列轉(zhuǎn)基因抗草甘膦品種的選育和大面積推廣有直接的關(guān)系。我國(guó)在轉(zhuǎn)基因草甘膦作物方面的研究已取得一定進(jìn)展，但目前尚無(wú)轉(zhuǎn)抗草甘膦基因作物進(jìn)入商品化階段的報(bào)道。中國(guó)發(fā)明專利03826892. 2公開(kāi)的一種來(lái)源于熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)的抗草甘膦基因(EPSPS基因),但由于其來(lái)源于細(xì)菌,細(xì)菌密碼子偏好性與植物有較大差異，將來(lái)自細(xì)菌的EPSPS基因直接轉(zhuǎn)化植物，其表達(dá)效率較低，因此，本領(lǐng)域有必要對(duì)來(lái)自微生物的抗草甘膦基因進(jìn)行人工改造，以保證抗草甘膦基因能夠在植物體內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供抗草甘膦蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，名稱是GmEPSPS-2，是如下(a)或(b)或(C)(a)由序列表中序列I的第56-532位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將(a)或(b)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有草甘膦抗性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。其中，(a)所限定的蛋白為GmEPSPS-2的成體蛋白，不含轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列；(b)所限定 的蛋白為5'端帶有擬南芥CTP2葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的GmEPSPS-2的中間體蛋白。上述(C)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變。序列表中序列I由532個(gè)氨基酸殘基組成。為了便于GmEPSPS-2蛋白的純化，可在由序列表中序列I的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。表標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)或(c): Ca)由序列表中序列I的第56-532位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (c)將(a)或(b)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有草甘膦抗性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子是編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的基因；所述基因是如下I)至5)中任一所述的DNA分子 1)編碼序列為序列表中序列2的第637-2070位核苷酸所示的DNA分子； 2)編碼序列為序列表中序列2的第472-2070位核苷酸所示的DNA分子； 3)序列表中序列2的第7-2070位核苷酸所示的DNA分子； 4)序列表中序列2所示的DNA分子； 5)在嚴(yán)格條件下與I)-4)中任一限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為重組表達(dá)載體或重組克隆載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子或玉米Ubi-I啟動(dòng)子。
7.權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求2或3所述的核酸分子，或權(quán)利要求4或5或6所述的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌在如下al)或a2)中的應(yīng)用 al)調(diào)控植物或微生物抗草甘膦功能； a2)選育抗草甘膦植物或微生物品種。
8.一種培育抗草甘膦功能提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的基因?qū)肽康闹参镏械牟襟E；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述目的植物相比，抗草甘膦功能提聞。
9.一種培育抗草甘膦功能提高的轉(zhuǎn)基因微生物的方法，包括將編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的基因?qū)肽康奈⑸镏械牟襟E；所述轉(zhuǎn)基因微生物與所述目的微生物相比，抗草甘勝功能提聞。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，或權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述微生物為大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗草甘膦蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)或(c)(a)由序列表中序列1的第56-532位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將(a)或(b)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有草甘膦抗性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的GmEPSPS-2蛋白及其編碼基因?qū)Σ莞熟⒊輨┚哂酗@著的抗性效果，實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)GmEPSPS-2基因煙草和轉(zhuǎn)GmEPSPS-2基因玉米在0.15%草甘膦作用下仍能正常生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)基因的煙草或玉米生長(zhǎng)明顯受抑制，葉片出現(xiàn)發(fā)黃、枯萎。這表明GmEPSPS-2能夠在植物中穩(wěn)定高效表達(dá)，進(jìn)而用于生產(chǎn)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N15/54GK102776158SQ201210196678
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者李新海, 楊小艷, 林清, 翁建峰, 謝樹(shù)章, 雷開(kāi)榮 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院