無色桿菌蛋白酶Ⅰ變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，本發(fā)明公開了無色桿菌蛋白酶I變體。本發(fā)明公開的無色桿菌蛋白酶I變體具有活性顯著優(yōu)于野生型無色桿菌蛋白酶I的優(yōu)點。
【專利說明】無色桿菌蛋白酶I變體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，本發(fā)明公開了一種酶變體、其制備方法及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]無色桿菌蛋白酶I (Achromobacter protease I, API, EC 3.4.21.50)是從無色桿菌M497-1的培養(yǎng)液中分離出來的堿性蛋白酶，可裂解大多數(shù)革蘭氏陽性菌或陰性菌，屬哺乳動物型絲氨酸蛋白酶。它高度專一'丨生水解賴氨酰鍵，包括賴氨酰-脯氨酰鍵，這與胰蛋白酶和其他絲氨酸蛋白酶不同。該酶在蛋白質(zhì)的氨基酸測序、肽圖譜分析和肽合成中具有重要的作用。作為內(nèi)切酶，它還具有另外幾個顯著特點:1.比牛胰蛋白酶活力高一個數(shù)量級；2.具有廣泛的pH范圍(pH8.5-10.5) ；3.在含4mol/L尿素或0.1% SDS的溶液中保持全酶活性。該酶的基因已被克隆，并獲得其一級結(jié)構(gòu)，其為胰蛋白酶家族成員之一。His57、Aspll3和Serl94構(gòu)成其催化三聯(lián)體。在生物體內(nèi)，這個酶首先以酶原的形式被合成，它的成熟體是由268個氨基酸殘基組成，含三個二硫鍵，分別在Cys6-Cys216、Cysl2-Cys80和Cys36-Cys58之間。除成熟酶外，酶原在N端和C端還具有較長的肽段。N端肽段由先導肽和前肽組成，前肽的功能不詳。C端肽段含180個氨基酸殘基，無論其是否被切除均不影響該酶的折疊和活性。
[0003]利用這個酶，Morihara等把豬胰島素B鏈丙氨酸殘基換成蘇氨酸，成功的完成了人胰島素的半合成；Masaki等在水相向大豆蛋白質(zhì)中引入了蛋氨酸，使其含量從原來的
1.19%提高到5.93%，這預示出該酶在改善食品營養(yǎng)結(jié)構(gòu)方面的應用前景。
[0004]API (以下如無特別說明，API均指無色桿菌蛋白酶I)所具有的高酶活性、高度底物專一性和高穩(wěn)定性在絲氨酸蛋白酶家族中是罕見的，因此其在生物工程領(lǐng)域的獲得廣泛應用。
[0005]雖然API已經(jīng)在生物工程領(lǐng)域獲得了廣泛的應用，但進一步提高API與底物蛋白中賴氨酸的親和力從而改善酶切的效率一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員著力解決的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的 申請人:通過PCR的方法，獲得野生型API的全序列，并在5’端和3’端分別加上MscI和HindIII的酶切位點，通過雙酶切的方法，定向克隆入相同雙酶切的pET32載體，利用載體中Trx進行融合表達。構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，在LB培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)過夜，提取外周胞質(zhì)蛋白，純化獲得成熟的野生型API。然后在野生型API序列基礎(chǔ)上，參考已經(jīng)獲得的野生型API的X線衍射晶體結(jié)構(gòu)，對API活性中心附近的氨基酸通過overlap PCR的方法,進行定點突變,分別構(gòu)建八種突變體,按照同樣的方法裝入pET32表達載體，Trx融合表達，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，在LB培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)過夜，提取外周胞質(zhì)蛋白，純化分別獲得成熟的API各種突變體如下:
[0007]突變體1:K49R[0008]突變體2:K106R
[0009]突變體3:K49R, K106R
[0010]突變體4:K49R, K106R, H56A
[0011]突變體5:K49R，K106R，TlllG
[0012]突變體6:K49R, K106R, L209A
[0013]突變體7:K49R, K106R, D225E
[0014]突變體8:K49R, K106R, H56A, T111G, L209A, D225E
[0015]上述“K49R”、“K106R”、“H56A”、“T111G”、“L209A”、“D225E”中，兩字母之間數(shù)字代
表突變位點，左邊字母代表野生型API氨基酸序列(SEQ.1DN0.1)中突變位點突變前的單字符氨基酸，右邊字母代表突變位點突變后的單字符氨基酸。例如“K49R”表示:野生型API氨基酸序列(SEQ.1D N0.1)的第49位氨基酸由賴氨酸(賴氨酸的單字符號為K)突變?yōu)榫彼?精氨酸的單字符號為R)。
[0016]后通過活性實驗和酶切效率實驗，結(jié)果表明，本發(fā)明公開的API突變體其活性均高于野生型API，且可成功地將胰島素C肽切除，達到了本發(fā)明的目的。
[0017]具體地，本發(fā)明中，將野生型API序列中關(guān)鍵位置的賴氨酸突變?yōu)榫彼幔行У臏p少了 API的不當自身酶解，大大提高了酶的得率。將活性中心附近的天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?，可以使API更有效的與底物蛋白中的賴氨酸結(jié)合，顯著改善酶切效果?；钚灾行母浇慕M氨酸、蘇氨酸與亮氨酸經(jīng)過`突變，也可提高API與底物中賴氨酸的親和力，進一步提高酶切的效果。API成熟蛋白具有三對鏈內(nèi)二硫鍵，結(jié)構(gòu)復雜，如果采用包涵體表達的方式，雖然可以獲得更高的表達量，然而蛋白復性的難度很大，反而不利于獲得高活性的成熟酶蛋白。因此采用大腸桿菌胞質(zhì)腔表達，直接純化胞質(zhì)腔中的API，可獲得高活性的API成熟蛋白。
[0018]利用本發(fā)明獲得的野生型的API (其氨基酸和核苷酸序列分別如SEQ.1DN0.1和SEQ.1D N0.2所示)和各種不同的突變體進行酶活性實驗，結(jié)果顯示，本發(fā)明構(gòu)建的突變體，活性顯著優(yōu)于野生型API，可在大腸桿菌胞質(zhì)腔獲得高表達，有利于該酶的工業(yè)化應用。利用本發(fā)明的API突變體，可以成功將胰島素C肽切除，獲得B鏈(-T)與A鏈的正確結(jié)構(gòu)，并實現(xiàn)生產(chǎn)規(guī)模的使用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1:API突變體活性測定結(jié)果；其中wild type:野生型；mutantl:K49R ；mutant2:K106R ；mutant 3:K49R，K106R ；mutant 4:K49R，K106R，H56A ；mutant 5:K49R，K106R，TlllG ；mutant 6:K49R，K106R，L209A ；mutant 7:K49R，K106R，D225E ；mutant 8:K49R，K106R，H56A，T111G，L209A，D225E ；
[0020]圖2:突變體8酶切效率，其中保留時間為14.670分鐘的主峰為胰島素原完全酶切后的正確結(jié)構(gòu)；
[0021]圖3:突變體6酶切效率，其中保留時間為15.126分鐘的主峰為胰島素原完全酶切后的正確結(jié)構(gòu)；
[0022]圖4:突變體5酶切效率，其中保留時間為15.137分鐘的主峰為胰島素原完全酶切后的正確結(jié)構(gòu)；[0023]圖5:突變體4酶切效率，其中保留時間為13.903分鐘的主峰為胰島素原完全酶切后的正確結(jié)構(gòu)；保留時間為10.663分鐘的峰為未酶切的胰島素原；前二者間為胰島素原不完全酶切的產(chǎn)物；
[0024]圖6:突變體7酶切效率，其中保留時間為15.037分鐘的主峰為胰島素原完全酶切后的正確結(jié)構(gòu)；保留時間為12.041分鐘的峰為未酶切的胰島素原；前二者間為胰島素原不完全酶切的產(chǎn)物；
[0025]圖7:突變體3酶切效率，其中保留時間為14.976分鐘的主峰為胰島素原完全酶切后的正確結(jié)構(gòu)；保留時間為11.972分鐘的峰為未酶切的胰島素原；前二者間為胰島素原不完全酶切的產(chǎn)物；
[0026]圖8:突變體2酶切效率；其中保留時間為15.539分鐘的主峰為胰島素原完全酶切后的正確結(jié)構(gòu)；保留時間為12.101分鐘的峰為未酶切的胰島素原；前二者間為胰島素原不完全酶切的產(chǎn)物；
[0027]圖9:突變體I酶切效率；其中保留時間為14.849分鐘的主峰為胰島素原完全酶切后的正確結(jié)構(gòu)；保留時間為11.805分鐘的峰為未酶切的胰島素原；前二者間為胰島素原不完全酶切的產(chǎn)物；
[0028]圖10:野生型酶切效率；其中保留時間為14.827分鐘的主峰為胰島素原完全酶切后的正確結(jié)構(gòu)；保留時間為11.826分鐘的峰為未酶切的胰島素原；前二者間為胰島素原不完全酶切的產(chǎn)物。
【具體實施方式】
[0029]以下實施例、實驗例僅僅對本發(fā)明進行進一步說明，不應構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
[0030]下述實施例、實驗例中的原材料如果沒有特別說明，均為市售。
[0031]實施例1:野生型API的構(gòu)建
[0032]引物 1:5，-tggccaatgaaacgcatctgcggtt
[0033]弓L 2:5， —aagcttctaatgatgatgatgatggtgcggagtaccg
[0034]以無色桿菌M497-1基因組DNA (采用Qiagen細菌基因組DNA純化試劑盒純化獲得)為底物，使用引物I和引物2，采用PCR方法擴增獲得API基因，并在其5’端和3’端分別加入MscI和HindIII的酶切位點，在3’端加上His標簽。擴增獲得的序列連接入Teasy載體(Promega)，經(jīng)基因序列測定確認無誤后，采用MscI和HindIII雙酶切，回收酶切片段，與相同雙酶切的pET32a(Novagen)連接，獲得API的pET32a表達載體。表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取陽性轉(zhuǎn)化克隆，LB培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)過夜進行培養(yǎng)擴增。采用滲壓震擾法(Norioka S，et al.J Biol Chem，1994，269:1_5)提取外周胞質(zhì)蛋白，通過His標簽親和層析純化獲得API蛋白(其氨基酸和核苷酸序列分別如SEQ.1D N0.1和 SEQ.1D N0.2 所示)。
[0035]實施例2:突變體I的構(gòu)建(K49R)
[0036]引物 3:5，-acaccgctaacgaccgcagaatgta
[0037]引物 4:5，-gcggtcaggaagtacattctgcggt
[0038]以野生型API基因為模板，分別用引物I與引物4、引物3與引物2進行PCR，擴增產(chǎn)物為模板，引物I與引物2擴增，獲得突變體I基因序列。轉(zhuǎn)化、表達及純化方法與野生型API相同。
[0039]實施例3:突變體2的構(gòu)建(K106R)
[0040]引物 5:5，-agtccggttccactgttagggcgac
[0041]引物6:5’ -gaggtagcgtaagtcgccctaacag
[0042]以野生型API基因為模板，分別用引物I與引物6、引物5與引物2進行PCR，擴增產(chǎn)物為模板，引物I與引物2擴增，獲得突變體2基因序列。轉(zhuǎn)化、表達及純化方法與野生型API相同。
[0043]實施例4:突變體3的構(gòu)建(K49R，K106R)
[0044]以API突變體I基因為模板，分別用引物I與引物6、引物5與引物2進行PCR，#增產(chǎn)物為模板，引物I與引物2擴增，獲得突變體3基因序列。轉(zhuǎn)化、表達及純化方法與野生型API相同。
[0045]實施例5:突變體4的構(gòu)建(K49R，K106R, H56A)
[0046]引物 7:5，-tgtacttcctgaccgcggcacactg
[0047]引物 8:5，-gtgcccataccgcagtgtgccgcgg
[0048]以API突變體3基因為模板，分別用引物I與引物8、引物7與引物2進行PCR，擴增產(chǎn)物為模板，引物I與引物2擴增，獲得突變體4基因序列。轉(zhuǎn)化、表達及純化方法與野生型API相同。`
[0049]實施例6:突變體5的構(gòu)建(K49R，K106R, T111G)
[0050]引物 9:5，-ttagggcgacttacgctggctccga
[0051]引物10:5’ -agcagggtaaagtcggagccagcgt
[0052]以API突變體3基因為模板，分別用引物I與引物10、引物9與引物2進行PCR，擴增產(chǎn)物為模板，引物I與引物2擴增，獲得突變體5基因序列。轉(zhuǎn)化、表達及純化方法與野生型API相同。
[0053]實施例7:突變體6的構(gòu)建(K49R，K106R, L209A)
[0054]引物 11:5’ -aacgcgtgctcggtcaggcgcacgg
[0055]引物 12:5，-ctagacggaccgccgtgcgcctgac
[0056]以API突變體3基因為模板，分別用引物I與引物12、引物11與引物2進行PCR，擴增產(chǎn)物為模板，引物I與引物2擴增，獲得突變體6基因序列。轉(zhuǎn)化、表達及純化方法與野生型API相同。
[0057]實施例8:突變體7的構(gòu)建(K49R，K106R, D225E)
[0058]引物 I3:5，-ccggcaccaaccgcagcgaacagta
[0059]引物 I4:5，-aatacgcgaccgtactgttcgctgc
[0060]以API突變體3基因為模板，分別用引物I與引物14、引物13與引物2進行PCR，擴增產(chǎn)物為模板，引物I與引物2擴增，獲得突變體6基因序列。轉(zhuǎn)化、表達及純化方法與野生型API相同。
[0061]實施例9:突變體 8 的構(gòu)建(K49R, K106R, H56A, T111G, L209A, D225E)
[0062]以API突變體4基因為模板，分別用引物I與引物10、引物9與引物2進行PCR，擴增產(chǎn)物為模板，引物I與引物2擴增，獲得中間突變體A基因序列(K49R，K106R, H56A，T111G)。[0063]以中間突變體A基因為模板，分別用引物I與引物12、引物11與引物2進行PCR，擴增產(chǎn)物為模板，引物I與引物2擴增，獲得中間突變體B基因序列(K49R，K106R, H56A，Tl HG，L209A)。
[0064]以中間突變體B基因為模板，分別用引物I與引物14、引物13與引物2進行PCR，擴增產(chǎn)物為模板，引物I與引物2擴增，獲得突變體8基因序列(K49R，K106R，H56A，T111G，L209A，D225E)。轉(zhuǎn)化、表達及純化方法與野生型API相同。
[0065]實驗例1:API突變體活性測定
[0066]試劑:
[0067]A:0.2M 2_ 氛基 _2_ 甲基 _1，3_ 丙二醇(AMP，2_Amino_2_methyl-1，3-propanediol)pH9.5
[0068]底物溶液(N-Benzoyl-DL-lysine-p-nitroanilide Hydrobromide)
[0069]C:2mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) ρΗ8.0
[0070]D:ΑΡΙ 陽性對照(Wako)
[0071]E:終止液45%乙酸
[0072]反應方法:
[0073]2.6mlA液加入0.3mlB液30°C孵育5min，然后陽性對照加入D液0.1ml，空白對照加入C液0.1ml，測試樣品(野生型API及各種不同的突變體)加入同樣的量，混勻后30°C孵育25分鐘,然后加入ImlE液進`行終止反應。
[0074]通過測量0D405的吸光度來判定酶的活性:
[0075]AU/ml = (a_b)*C/6
[0076]其中a為測試樣品的405nm吸光度b為空白對照的吸光度，c為樣品的稀釋倍數(shù)。
[0077]以野生型API的活性為100%，計算各種突變體的相對活性(％ )。
[0078]結(jié)果如表1和圖1所示:
野生型突變體I突變體2突變體3突變體4突變體5突變體6突變體7突變
[0079]_________體 8
100 140160 200 230 290 270 210 380
[0080]實驗例2 =API突變體切割胰島素原
[0081]按照專利US4916212描述的方法獲得胰島素原，按照下述方法利用API (野生型及各種突變體)酶切胰島素原，反相HPLC(C4柱)檢測酶切效果。
[0082]酶切條件:
[0083]酶切緩沖液:100mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液，pH9_10 ；
[0084]酶切溫度:4_25°C
[0085]酶切時間:12-24小時
[0086]酶與底物質(zhì)量比:I: 2000~1: 3000
[0087]酶切效率檢測:
[0088]檢測方法:反相HPLC，C4柱檢測
[0089]流動相:A.pH3.0磷酸鈉緩沖液；B.乙腈
[0090]溫度:室溫
[0091]梯度:25分鐘，B相20%~40%[0092]結(jié)果見附圖2~10，結(jié)果表明:突變體8的酶切效率最高，其次為突變體5和突變體6，均優(yōu)于其他專利或文獻中報道 的結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種無色桿菌蛋白酶I變體，其特征在于SEQ.1.D.N0.1氨基酸序列K49R，K106R,TlllG 或 K49R, K106R, L209A 或 K49R, K106R, D225E。
2.一種無色桿菌蛋白酶I變體，其特征在于SEQ.1.D.N0.1氨基酸序列K49R，K106R,H56A, Tl HG, L209A, D225E。
【文檔編號】C12R1/025GK103509775SQ201210198899
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月15日
【發(fā)明者】郭亞軍, 侯盛, 郭懷祖, 張大鵬, 談珉 申請人:上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司