胰島素-Fc融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，本發(fā)明公開了一種胰島素-Fc融合蛋白、其制備方法和用途。本發(fā)明公開的胰島素-Fc融合蛋白具有半衰期長(zhǎng)，可減少胰島素使用的間隔時(shí)間，減少病人的用藥痛苦等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】胰島素-Fe融合蛋白
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，本發(fā)明公開了一種融合蛋白、其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是一種日漸普遍的流行病，據(jù)估計(jì)，到2025年，糖尿病將影響3億以上的人口，因此急需一種有效的藥物治療方法。2型糖尿病占所有病例的90-95 %。因血糖水平持續(xù)升高引起的并發(fā)癥包括心血管疾病、腎病、神經(jīng)病和視網(wǎng)膜病。此外，在2型糖尿病晚期時(shí)，胰腺的β細(xì)胞死亡，從而停止分泌胰島素。目前對(duì)糖尿病的治療會(huì)產(chǎn)生多種有害的副作用，其中包括低血糖和體重增加。此外，目前對(duì)2型糖尿病的治療并不能治愈這種疾病，而只是延緩時(shí)間，直至患者需要接受胰島素治療。
[0003]胰島素這樣的天然或者重組蛋白在水溶液狀態(tài)下半保存期通常比較短，由于這些分子制劑的不穩(wěn)定性使之必須凍干保存，給運(yùn)輸和保存帶來不便。[0004]胰島素類的重組治療蛋白的體內(nèi)半衰期也很短，為了使用藥間隔延長(zhǎng)，必須生產(chǎn)體內(nèi)半衰期長(zhǎng)的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開了一種胰島素-Fe融合蛋白，其通式為
[0006]B-C-A-Fc，其中A為胰島素A鏈，B為胰島素的B鏈，C為4-50個(gè)氨基酸的C肽連接序列，優(yōu)選為6-30個(gè)氨基酸，F(xiàn)e為免疫球蛋白Fe段或其突變體。
[0007]優(yōu)選地，C為 GGGPGKR、GGGPQT, GGGPGAG, AAGGGPSVR 之一 ；C 可以是天然或者人工序列，序列長(zhǎng)度在4-50之間，主要為6-30個(gè)氨基酸。天然序列可以通過替代，增減修飾形成人工序列。為了減少免疫反應(yīng)，C優(yōu)選包含人血液中的天然人蛋白序列，例如天然胰島素C 肽序列(RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR)、IGF-1 C 肽連接(GYGSSRRAPQT)，抗體重鏈鉸鏈區(qū)序列(EPKS⑶KTHTCPPCPAP)等。在有些結(jié)構(gòu)中連接序列也可以只包含部分的上述序列，或者替代、增減修飾上述序列中一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸。連接序列可以被增減某個(gè)特定氨基酸。但是在一些結(jié)構(gòu)中，連接序列不能包含兩個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，例如KK，RR,RK。選擇沒有賴氨酸或者精氨酸的序列，或者選擇沒有酪氨酸的序列作為連接序列。
[0008]融合蛋白序列還包含一個(gè)N端的引導(dǎo)序列或者信號(hào)肽。例如抗體的信號(hào)肽，胰島素的引導(dǎo)序列，酵母a因子信號(hào)序列，白蛋白信號(hào)肽序列，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白4信號(hào)肽序列，酸性磷酸酶信號(hào)肽序列等等。
[0009]在本發(fā)明中，該構(gòu)造的抗體Fe部分保留了結(jié)合蛋白質(zhì)A的能力并且可以利用蛋白質(zhì)A親和色譜法進(jìn)行純化。通過重組方法合成，并且可以代表任何人類或動(dòng)物抗體的任一亞型。公眾可從某些出版物(例如Kabat, et al.Sequences of Proteins ofImmunological Interest, U.S.Dept.Health (1983) (Kabat 等人,免疫學(xué)相關(guān)蛋白質(zhì)序列，美國(guó)衛(wèi)生部，1983年))或在線獲得人和動(dòng)物免疫球蛋白的序列。抗體的Fe區(qū)域通過對(duì)其Fe受體結(jié)合區(qū)域(H235-H236)進(jìn)行突變例如從亮氨酸突變?yōu)楸彼幔山档脱a(bǔ)體結(jié)合、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)以及通過將該二聚體結(jié)構(gòu)的亞區(qū)與免疫細(xì)胞表面受體(Fcy受體)結(jié)合來介導(dǎo)的其他功能。
[0010]融合蛋白的基因可以連入真核表達(dá)載體pcdna3.1, pngfpN, PEE144等真核載體，轉(zhuǎn)染CHO，NSO，SP2/0等細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，或者連入pet22，pet32，Pgex等質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BL21 (DE3)，ROSETTA, AD494等菌株進(jìn)行表達(dá)，或者連入pPICZ等載體轉(zhuǎn)染畢赤酵母進(jìn)行酵母表達(dá)。
[0011]融合蛋白可以通過proteinA親和層析柱，proteinG親和層析柱以及其它層析柱純化獲得高純度的蛋白分子。
[0012]本發(fā)明所述的胰島素-Fe融合蛋白具有胰島素活性，能夠結(jié)合胰島素受體，刺激表達(dá)胰島素受體的細(xì)胞攝取葡萄糖。胰島素-Fe融合蛋白包含通過連接序列連接的A鏈和B鏈,例如胰島素-Fe融合蛋白包括抗體的Fe段或其突變體通過N端或者C端與胰島素類似物連接，其胰島素類似物公式為-B-C-A-，其中C為C肽連接序列。在一些實(shí)例中，連接序列為6-30個(gè)氨基酸，一般情況下，連接序列可以使A鏈和B鏈形成具有胰島素活性的分子。
[0013]本發(fā)明公開的胰島素-Fe融合蛋白為治療性蛋白，可為具有胰島素-Fe融合蛋白活性的胰島素、胰島素類似物以及胰島素片段和突變體與免疫球蛋白及其片段連接形成的融合蛋白，通過與Fe蛋白連接形成的融合蛋白，可以極大的改善胰島素的藥代動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)，提高胰島素的體內(nèi)半衰期，減少胰島素使用的間隔時(shí)間，減少病人的用藥痛苦。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1 pDRl表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖，hCMV表示人巨細(xì)胞病毒Major Immediate早期啟動(dòng)子；BGH pA表不Bovine growth hormone多腺苷化信號(hào)；SV40 ori表不SV40病毒早期復(fù)制起點(diǎn)；DHFR表示二氫葉酸還原酶基因；pUC origin為質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；AMP為氨芐青霉素抗性基因。
[0015]圖2.胰島素-Fe融合蛋白基因結(jié)構(gòu)示意圖；信號(hào)肽是指胰島素的信號(hào)肽或其他蛋白的信號(hào)肽基因，A鏈B鏈分別是指胰島素的A鏈基因和B鏈基因，F(xiàn)e是指突變后抗體的Fe段基因，C連接序列是指專利中提到的各種連接序列基因。
[0016]圖3.胰島素-Fe融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖，A鏈B鏈分別是指胰島素的A和B鏈，F(xiàn)e是指突變后抗體的Fe段。
【權(quán)利要求】
1.一種膜島素-Fe融合蛋白，其通式為B-C-A-Fc,其中A為膜島素A鏈,B為膜島素的B鏈，C為4-50個(gè)氨基酸的C肽連接序列，F(xiàn)e為免疫球蛋白Fe段或其突變體。
2.權(quán)利要求1所述的胰島素-Fe融合蛋白，其中C為6-30個(gè)氨基酸的C肽連接序列。
3.權(quán)利要求2所述的胰島素-Fe融合蛋白，其中C為GGGPGKR、GGGPQT,GGGPGAG、AAGGGPSVR 之一。
4.權(quán)利要求1所述的胰島素-Fe融合蛋白，其中Fe為免疫球蛋白Fe段H235、H236位從亮氨酸突變?yōu)楸彼帷?br> 5.權(quán)利要求1-4任一所述的胰島素-Fe融合蛋白，其氨基酸序列為SEQIDNO:2、SEQID NO:4, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:10 之一。
6.一種核酸分子，編碼權(quán)利要求1-4任一所述的胰島素-Fe融合蛋白。
7.權(quán)利要求6所述的核酸分子，其核苷酸序列為SEQID NO:U SEQ ID NO:3、SEQ IDN0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:9 之一。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK103509118SQ201210198941
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月15日
【發(fā)明者】顧娜娜, 郭懷祖 申請(qǐng)人:郭懷祖