專利名稱：一株腸桿菌fy-07及其靜態(tài)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，它涉及一株腸桿菌FY-07(Enterobacter sp. FY-07)菌株,及利用該菌株進(jìn)行靜態(tài)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose，簡稱BC)是細(xì)菌產(chǎn)生的一種胞外多糖，由葡 萄糖分子以β_1，4-糖苷鍵連接而成。與植物纖維素相比，細(xì)菌纖維素具有許多獨特的性質(zhì)①高化學(xué)純度和高結(jié)晶度，無伴生的木質(zhì)素和半纖維素；②超精細(xì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，纖維是由直徑3 4nm的亞纖維組合成4(T60nm粗的纖維束，并相互交織形成發(fā)達(dá)的超精細(xì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；③較高的彈性模量，其直徑在0.01、. I μ m之間，彈性模量為一般植物纖維的數(shù)倍至十倍以上，并且抗拉強(qiáng)度高；④很強(qiáng)的持水能力，能吸收6(Γ700倍于干重的水分； 較高的生物相容性和生物可降解性，不污染環(huán)境。由于細(xì)菌纖維素具有以上優(yōu)異的特性，在造紙、食品、醫(yī)藥、揚(yáng)聲器材、生物醫(yī)學(xué)工程、石油開采等行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生纖維素的細(xì)菌包括Acetobacter, Alcaligenes, Sarcina,Rhizobium, Pseudomounas, Azotobacter, Agrobacterium, Achromobacter, Aerobacter,Gluconacetobacter, Vibrio, Salmonella, Escherichia 等。其中只有 Gluconacetobacter和Acetobacter的某些種具有商業(yè)化生產(chǎn)前景。但這兩個屬的纖維素產(chǎn)生菌均為好氧菌株，只能在供氧充足的條件下大量產(chǎn)生細(xì)菌纖維素。氧的濃度對好氧菌的生長、纖維素的產(chǎn)量以及纖維素膜的物理特性均有很大影響。研究表明當(dāng)氧分壓小于10% 15%時，纖維素的產(chǎn)量和膜的韌性隨氧分壓的增大而增強(qiáng)。這就要求在生產(chǎn)中必須設(shè)法滿足氧的供應(yīng)。例如可以通過增加培養(yǎng)基與空氣的接觸面積(薄層靜態(tài)培養(yǎng))，這樣做無疑會增加占地面積及勞動強(qiáng)度，不適合規(guī)模化生產(chǎn)；還可以采用通氣、攪拌等方式增加溶氧(動態(tài)培養(yǎng))。但靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)生的纖維素雖然在化學(xué)成分上完全相同，但在形態(tài)和物理性能方面差異卻很大，例如，靜態(tài)培養(yǎng)比動態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)生的纖維素結(jié)晶度、楊氏模量和產(chǎn)量等更高；此外，較高的剪切力可能使纖維素產(chǎn)生菌突變?yōu)椴划a(chǎn)纖維素菌株。因此，提高溶氧、降低剪切力是細(xì)菌纖維素培養(yǎng)方式的發(fā)展方向。隨之出現(xiàn)了動態(tài)-靜態(tài)二步培養(yǎng)法及獨特的發(fā)酵反應(yīng)器設(shè)計(例如生物轉(zhuǎn)盤反應(yīng)器、球形鼓泡塔等)，但始終無法達(dá)到靜態(tài)培養(yǎng)的效果。因此，目前細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)主要是通過淺盤靜態(tài)培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠在好氧和厭氧條件下均能高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的腸桿菌；同時提供一種利用靜態(tài)液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的工藝，以及從發(fā)酵終產(chǎn)物中提取細(xì)菌纖維素的方法。本發(fā)明提供的腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株，于2012年5月11日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，其保藏號為CGMCC No. 6103，分類命名為腸桿菌Enterobacter sp.。本發(fā)明提供的腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株,可在普通牛肉汁、LB、營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，也可在含糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長并產(chǎn)生細(xì)菌纖維素。該菌株在15 40°C之間的任一溫度，且于好氧和厭氧條件下均能生長。本發(fā)明提供的腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株,是以含糖無機(jī)鹽培養(yǎng)基為基礎(chǔ)從油田采出液中分離，并以糖為唯一碳源在30° C反復(fù)馴化培養(yǎng)而獲得。本發(fā)明提供的腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌落特征在LB瓊脂(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC15g/L，瓊脂粉20g/L)平板上30° C培養(yǎng)24h即可長出白色、圓形菌落，菌落呈顆粒狀，邊緣規(guī)則，大小直徑I 2mm，與培養(yǎng)基接觸不緊密。
本發(fā)明提供的腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株的形態(tài)特征革蘭氏染色陰性，菌體呈短桿狀，大小0. 5^1. O μ m (寬)X I. (Γ2. 5 μ m (長)，不形成芽孢。本發(fā)明提供的腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株生理生化特征生長溫度15 40°C，生長pH范圍5 12，NaCl耐受性(Γ5% ;接觸酶，檸檬酸鹽利用，吲哚產(chǎn)生，硝酸鹽還原實驗均為陽性-X P.，淀粉水解，甲基紅，亞硝酸鹽還原實驗為陰性；葡萄糖發(fā)酵為氧化型；對氧的需求為兼性厭氧型。本發(fā)明提供的腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株的16S rRNA基因序列特征將FY-07菌株接種于LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L)，30°C搖床培養(yǎng)(180rpm) 24小時，離心收集菌體，重新懸浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因組DNA，并采用上游引物(5’ -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和下游引物(5’-AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3’)，用這對引物對其16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增引物送大連寶生物公司進(jìn)行測序，其16S rDNA的序列如SEQ ID No. I所示。PCR條件為94°C，5min ；94°C, 45s, 56. 2°C，45s，72°C 90s，30 個循環(huán)；72°C 9min，4°C保存。16S rDNA 基因序列長度為 I53Ibp,與 Enterobacter cloacae ATCC 13047 (99. 1%), Enterobacter aerogenesKCTC 2190(98. 7%)的同源性均大于98%。本發(fā)明同時還提供了使用上述腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp.FY-07)菌株生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，該方法以I 3g/L的NH4NO3,0. 5 I. 5g/L的KH2PO4,0. 3 O. 7g/L的K2HPO4 · 3Η20，0· 2 0. 5g/L 的 MgSO4 · 7Η20，0· Γθ. 3g/L 的 MnCl2 和 10 50g/L 的葡萄糖組成發(fā)酵培養(yǎng)基，使用靜態(tài)液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，并依次經(jīng)過預(yù)處理、堿處理、水洗和干燥，從發(fā)酵終產(chǎn)物中提取細(xì)菌纖維素。具體工藝步驟是第一、以無菌水將原始菌種從一個或多個斜面上洗下，直接接入含有萬分之一纖維素酶的LB培養(yǎng)基中，好氧發(fā)酵培養(yǎng)制成一級種子液；所述的LB培養(yǎng)基的組成包括蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L, NaCl 5g/L,以蒸懼水配制；第二、將上步培養(yǎng)的一級種子液以5%的接種量接入二級種子培養(yǎng)基中進(jìn)行好氧發(fā)酵培養(yǎng)，制成二級種子液；其中二級種子培養(yǎng)基的組成包括l 3g/L的NH4NO3,0. 5^1. 5g/L 的 KH2PO4,0. 3 0. 7g/L 的 K2HPO4 · 3Η20，0· 2 0. 5g/L 的 MgSO4 · 7Η20，0· Γθ. 3g/L 的 MnCl2和5 20g/L的葡萄糖，以蒸餾水配制；
第三、將第二步制成的二級種子液以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行靜態(tài)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素；其中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成包括3g/L的NH4NO3,0. 5^1. 5g/L的 KH2PO4,0. 3 O. 7g/L 的 K2HPO4 · 3H20,0. 2 O. 5g/L 的 MgSO4 · 7H20,0. Γθ. 3g/L 的 MnCl2 和l(T50g/L的葡萄糖，以蒸餾水配制；第四、將第三步中獲得的發(fā)酵產(chǎn)物，依次經(jīng)過預(yù)處理、堿處理、水洗、干燥的后提取處理工藝得到細(xì)菌纖維素。后提取處理工藝的具體操作過程是(I)預(yù)處理用水洗方法去除細(xì)菌纖維素水合物中大部分未與纖維素結(jié)合的菌體及其碎片等雜質(zhì)；(2)堿處理再用O. lmol/L的NaOH溶液于80°C條件下浸泡2h，除去纖維素水合、物中的菌體和殘留培養(yǎng)基；(3)水洗再用蒸餾水多次沖洗，直至纖維素水合物的pH值近7. O ；(4)干燥最后將纖維素水合物風(fēng)干或真空干燥，即制得細(xì)菌纖維素。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果細(xì)菌纖維素以其獨特的性能及廣闊的應(yīng)用前景成為近二十年來研究的熱點。但目前有潛力作為纖維素工業(yè)化生產(chǎn)的菌株比較單一，均為醋酸桿菌屬和葡糖醋桿菌屬的菌株，且它們都是好氧菌。與目前細(xì)菌纖維素工業(yè)生產(chǎn)中用到的菌種均為好氧細(xì)菌不同，本發(fā)明提供的腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株為兼性厭氧細(xì)菌，不僅可以在好氧、厭氧等不同氧化還原電位下生長，并在好氧和厭氧條件下均可以大量產(chǎn)生細(xì)菌纖維素，且其產(chǎn)量可以達(dá)到10g/L，達(dá)到甚至超過纖維素工業(yè)主流菌種的產(chǎn)量。腸桿菌FY-07在好氧和厭氧條件下均能大量細(xì)菌纖維素的特點使利用靜態(tài)液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)細(xì)菌纖維素成為可能，給細(xì)菌纖維素生產(chǎn)工藝帶來重大變革，大幅降低細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)成本，改善細(xì)菌纖維素的產(chǎn)品質(zhì)量。


圖I是腸桿菌FY-07在LB固體培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)24h后的菌落照片；圖2是腸桿菌FY-07在發(fā)酵培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)24h后的菌體電鏡照片；圖3是不同氧化還原電位下腸桿菌FY-07的纖維素產(chǎn)量；圖4是腸桿菌FY-07合成細(xì)菌纖維素的發(fā)酵動態(tài)曲線；圖5是限氧條件下腸桿菌FY-07培養(yǎng)體系氧化還原電位的變化；圖6是靜態(tài)培養(yǎng)時獲得的細(xì)菌纖維素水合物狀態(tài)圖。
具體實施例方式實施例I本發(fā)明提供的腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株的篩選和育種。取IOmL吉林油田的油田采出液于90mL含葡萄糖無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成ΚΗ2Ρ043· 48g/L，Na2HPO4 · 12H20 I. 5g/L，(NH4) 2S042g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，酵母提取物
0.05g/L,葡萄糖 lOg/L,蒸懼水 1000mL,pH7. 2,105°C滅菌 30min),置于 200r/min 低溫?fù)u床30°C富集培養(yǎng)5天。由于細(xì)菌纖維素具有精細(xì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，致使其菌落與固體培養(yǎng)基表面接觸不緊密，挑取菌落時容易在固體培養(yǎng)基表面滑動。因此將上述富集培養(yǎng)物在固體平板上劃線培養(yǎng)后選取與培養(yǎng)基表面接觸不緊密的菌落進(jìn)行復(fù)篩；復(fù)篩時將挑選的菌落接種至新鮮的IOOmL葡萄糖無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代馴化，培養(yǎng)條件同上；經(jīng)過5 7個周期富集后最終得到FY-07 ;在LB瓊脂(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂粉20g/L)平板上反復(fù)劃線，挑取單菌落劃斜面保存；將FY-07菌落分別取一環(huán)接入裝有5mL LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L)的試管內(nèi)，30°C震蕩培養(yǎng)48h，作為種子液；分別取ImL種子液接入裝有IOOmL葡萄糖無機(jī)鹽培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30°C培養(yǎng)3d，檢測多糖聚合物的產(chǎn)量和種類(具體方法詳見實施例4和實施例5)，選取纖維素產(chǎn)量最高的菌株作為選育目的菌株。
實施例2腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株的形態(tài)特征和生理生化特征。參照《Bergey，sMannual of Systematic Bacteriology)) (Vol. VDD 的實驗方法進(jìn)行，檢測其革蘭氏染色，菌體大小和形態(tài)，有無芽孢，生長溫度，生長pH范圍，NaCl耐受性。接觸酶，M.R.實驗，V.P.實驗，吲哚產(chǎn)生，硝酸鹽還原，淀粉水解，檸檬酸鹽利用，葡萄糖發(fā)酵等實驗。腸桿菌FY-07在LB瓊脂(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂粉20g/L)平板上30° C培養(yǎng)24h即可長出白色、圓形菌落，菌落呈顆粒狀，邊緣規(guī)則，大小直徑I 2mm，與培養(yǎng)基接觸不緊密；革蘭氏染色陰性，菌體呈短桿狀，大小0. 5^1. O μ m(寬)X I. (Γ2. 5 μ m(長)，不形成芽孢；生長溫度15 40°C，生長pH范圍5 12，NaCl耐受性(Γ5% ;接觸酶，檸檬酸鹽利用，吲哚產(chǎn)生，硝酸鹽還原實驗均為陽性-X P.，淀粉水解，Μ. R.，亞硝酸鹽還原實驗為陰性；葡萄糖發(fā)酵為氧化型；對氧的需求為兼性厭氧型。實施例3腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株的 16S rRNA 基因的 PCR 擴(kuò)增和序列測定。本發(fā)明提供的腸桿菌FY_07(Enterobacter sp. FY-07)菌株的16S rRNA基因序列特征將FY-07菌株接種于LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L)，30°C搖床培養(yǎng)(180rpm)24h，離心收集菌體，重新懸浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因組DNA，并采用上游引物(5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和下游引物(5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)，用這對引物對其16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增引物送大連寶生物公司進(jìn)行測序，其16S rDNA的序列如SEQ ID No. I所示。PCR條件為94°C，5min ;94°C，45s，56. 2°C，45s，72°C 90s，30 個循環(huán)；72°C 9min，4°C保存。16S rDNA 基因序列長度為 1531p，與Enterobacter cloacaeATCC 13047 (99. 1%), Enterobacter aerogenes KCTC 2190(98. 7%)的同源性均大于98%。實施例4腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株的多糖聚合物定性分析。腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株產(chǎn)生的聚合物不溶于水、醇、酮等有機(jī)溶劑。聚合物的雙縮脲反應(yīng)、斐林試劑反應(yīng)均為陰性，說明樣品中不含游離的氨基酸和單糖類物質(zhì)。采用不同的特異性顯色方法對聚合物樣品和酸水解后的樣品進(jìn)行薄層定性分析。酸水解前后的聚合物樣品用硫酸-蒽酮顯色后都呈明顯的藍(lán)綠色斑點，說明樣品中含有糖類成分；聚合物樣品的丁酮抽提物用鑰酸銨-高氯酸顯色無明顯斑點，說明聚合物中不含有脂類物質(zhì)；用茚三酮顯色水解聚合物樣品無明顯斑點，說明聚合物樣品中不含有多肽組分。聚合物樣品經(jīng)過三氟乙酸水解后，氣相色譜法測定單糖組成，結(jié)果表明樣品中只含有一種單糖，其相對保留時間為14. 542，與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的相對保留時間一致。進(jìn)一步采用酶解法確定聚合物中葡萄糖苷鍵的鏈接方式，結(jié)果表明腸桿菌FY-07產(chǎn)生的多糖只能被纖維素酶水解而不能被淀粉酶、半纖維素酶、果膠酶等糖苷酶水解。說明腸桿菌FY-07產(chǎn)生的多糖為葡萄糖分子以β -I, 4-糖苷鍵連接而成的纖維素。實施例5本發(fā)明提供的腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法I。 將腸桿菌FY-07 在以 lg/L 的 NH4NO3,0. 5g/L 的 KH2PO4,0. 3g/L 的 K2HPO4 · 3H20，O. 2g/L的MgSO4 ·7Η20，0. lg/L的MnCl2和10g/L的葡萄糖組成的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程是在20°C，pH 6. O的條件下進(jìn)行靜態(tài)液體深層發(fā)酵，對發(fā)酵終產(chǎn)物采用預(yù)處理、堿處理、水洗和干燥技術(shù)，從發(fā)酵終產(chǎn)物中提取細(xì)菌纖維素。具體工藝步驟是I、以無菌水將原始菌種從一個或多個斜面上洗下，直接接入含有萬分之一纖維素酶的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L)中，好氧發(fā)酵24 36h制成一級種子液；2、將一級種子液以5%的接種量接入二級種子培養(yǎng)基(lg/L的NH4NO3,0. 5g/L的KH2PO4,0. 3g/L 的 K2HPO4 · 3H20，0. 2g/L 的 MgSO4 · 7Η20，0· lg/L 的 MnCl2 和 5g/L 的葡萄糖，以蒸餾水配制)中20°C好氧發(fā)酵24 36h制成二級種子液；3、將二級種子液以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(lg/L的NH4N03，0. 5g/L的KH2PO4,0. 3g/L 的 K2HPO4 · 3H20，O. 2g/L 的 MgSO4 · 7H20，O. lg/L 的 MnCl2 和 10g/L 的葡萄糖，以蒸餾水配制)中，于20°C條件下進(jìn)行靜態(tài)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。4、將發(fā)酵終產(chǎn)物進(jìn)行后提取處理工藝得到纖維素，包括如下步驟(I)預(yù)處理用水洗方法去除細(xì)菌纖維素水合物中大部分未與纖維素結(jié)合的菌體及其碎片等雜質(zhì)；(2)堿處理再用O. lmol/L的NaOH溶液于80°C條件下浸泡2h，除去纖維素水合物中的菌體和殘留培養(yǎng)基；(3)水洗再用蒸餾水多次沖洗，直至纖維素水合物的pH值近7. O ；(4)干燥最后將纖維素水合物風(fēng)干或真空干燥，即制得細(xì)菌纖維素。統(tǒng)計稱重纖維素產(chǎn)量約為5. 17g/L。實施例6本發(fā)明提供的腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法2。將腸桿菌FY-07 在以 2g/L 的 NH4NO3, lg/L 的 KH2PO4,0. 5g/L 的 K2HPO4 ·3Η20，0. 35g/L的MgSO4 ·7Η20，0. 2g/L的MnCl2和30g/L的葡萄糖組成的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程是在30°C，pH 7. O的條件下進(jìn)行靜態(tài)液體深層發(fā)酵，對發(fā)酵終產(chǎn)物采用預(yù)處理、堿處理、水洗和干燥技術(shù)，從發(fā)酵終產(chǎn)物中提取細(xì)菌纖維素。具體工藝步驟是I、以無菌水將原始菌種從一個或多個斜面上洗下，直接接入含有萬分之一纖維素酶的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L)中，好氧發(fā)酵24 36h制成一級種子液；2、將一級種子液以5%的接種量接入二級種子培養(yǎng)基(2g/L的NH4NO3, lg/L的KH2PO4,0. 5g/L 的 K2HPO4 · 3H20，0. 35g/L 的 MgSO4 · 7Η20，0· 2g/L 的 MnCl2 和 10g/L 的葡萄糖，以蒸餾水配制)中30°C好氧發(fā)酵24 36h制成二級種子液；3、將二級種子液以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(2g/L的NH4NO3, lg/L的KH2PO4,
O.5g/L 的 K2HPO4 · 3Η20，0· 35g/L 的 MgSO4 · 7Η20，0· 2g/L 的 MnCl2 和 30g/L 的葡萄糖，以蒸餾水配制)中，于30°C條件下進(jìn)行靜態(tài)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。
4、將發(fā)酵終產(chǎn)物進(jìn)行后提取處理工藝得到纖維素，包括如下步驟(I)預(yù)處理用水洗方法去除細(xì)菌纖維素水合物中大部分未與纖維素結(jié)合的菌體及其碎片等雜質(zhì)；(2)堿處理再用O. lmol/L的NaOH溶液于80°C條件下浸泡2h，除去纖維素水合物中的菌體和殘留培養(yǎng)基；(3)水洗再用蒸餾水多次沖洗，直至纖維素水合物的pH值近7. O ；(4)干燥最后將纖維素水合物風(fēng)干或真空干燥，即制得細(xì)菌纖維素。統(tǒng)計稱重纖維素產(chǎn)量約為10. 32g/L。實施例7本發(fā)明提供的腸桿菌FY-07 (Enterobacter sp. FY-07)菌株生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法3。將腸桿菌FY-07 在以 3g/L 的 NH4NO3,1. 5g/L 的 KH2PO4,0. 7g/L 的 K2HPO4 · 3H20，
O.5g/L的MgSO4 ·7Η20，0. 3g/L的MnCl2和50g/L的葡萄糖組成的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程是在35°C，pH 8. O的條件下進(jìn)行靜態(tài)液體深層發(fā)酵，對發(fā)酵終產(chǎn)物采用預(yù)處理、堿處理、水洗和干燥技術(shù)，從發(fā)酵終產(chǎn)物中提取細(xì)菌纖維素。具體工藝步驟是I、以無菌水將原始菌種從一個或多個斜面上洗下，直接接入含有萬分之一纖維素酶的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L)中，好氧發(fā)酵24 36h制成一級種子液；2、將一級種子液以5%的接種量接入二級種子培養(yǎng)基(3g/L的NH4NO3,1. 5g/L的KH2PO4,0. 7g/L 的 K2HPO4 · 3H20，0. 5g/L 的 MgSO4 · 7H20，0. 3g/L 的 MnCl2 和 20g/L 的葡萄糖，以蒸餾水配制)中35°C好氧發(fā)酵24 36h制成二級種子液；3、將二級種子液以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(3g/L的NH4N03，1.5g/L的KH2PO4,0. 7g/L 的 K2HPO4 · 3H20，0. 5g/L 的 MgSO4 · 7H20，0. 3g/L 的 MnCl2 和 50g/L 的葡萄糖，以蒸餾水配制)中，于35°C條件下進(jìn)行靜態(tài)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。4、將發(fā)酵終產(chǎn)物進(jìn)行后提取處理工藝得到纖維素，包括如下步驟(I)預(yù)處理用水洗方法去除細(xì)菌纖維素水合物中大部分未與纖維素結(jié)合的菌體及其碎片等雜質(zhì)；(2)堿處理再用0. lmol/L的NaOH溶液于80°C條件下浸泡2h，除去纖維素水合物中的菌體和殘留培養(yǎng)基；
(3)水洗再用蒸餾水多次沖洗，直至纖維素水合物的pH值近7. O ；(4)干燥最后將纖維素水合物風(fēng)干或真空干燥，即制得細(xì)菌纖維素。統(tǒng)計稱重纖維素產(chǎn)量約為8. 52g/L。實施例8本發(fā)明提供的腸桿菌(Enterobacter sp. FY-07)菌株發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素時對氧的需求。將腸桿菌FY-07分別在有氧、限氧和無氧條件下進(jìn)行靜態(tài)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，測定其在不同氧化還原電位下菌體生長和細(xì)菌纖維素的產(chǎn)生狀況。以無菌水將原始菌種從一個或多個斜面上洗下制成菌懸液(f2X107cellS/mL)，然后將此菌懸液直接接入發(fā)酵培養(yǎng) 基(2g/L 的 NH4NO3, lg/L 的 KH2PO4,0. 5g/L 的 K2HPO4 · 3H20，0. 35g/L 的 MgSO4 · 7Η20，0· 2g/L的MnCl2和30g/L的葡萄糖，以蒸餾水配制)中，30°C條件下進(jìn)行靜態(tài)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。好氧培養(yǎng)在250mL三角瓶中進(jìn)行，裝液量為230mL，三角瓶用可以通氣的乳膠塞封口。厭氧培養(yǎng)時，應(yīng)先將培養(yǎng)基煮沸，加入終濃度為lmg/L的刃天青，密封、滅菌。然后，在經(jīng)紫外照射滅菌的厭氧培養(yǎng)箱中加入O. 5g/L的半胱氨酸鹽酸鹽，調(diào)節(jié)pH至7. 0，接種后通無菌N2 (2. 0m3/h)直至培養(yǎng)基變?yōu)闊o色，最后分裝到厭氧瓶中。限氧培養(yǎng)在厭氧培養(yǎng)瓶中進(jìn)行，與厭氧培養(yǎng)不同的是培養(yǎng)體系不除氧，不加半胱氨酸鹽酸鹽。纖維素的提取和定量參照實施例5中的第4步進(jìn)行。在不同氧化還原電位條件下腸桿菌FY-07均能大量產(chǎn)生細(xì)菌纖維素，其產(chǎn)量可以達(dá)到5. 17^10. 32g/L，且不同氧化還原電位下細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量并沒有較大變化，說明在利用腸桿菌FY-07發(fā)酵生產(chǎn)纖維素時氧的有無不影響其生長和纖維素產(chǎn)量。限氧條件下，培養(yǎng)體系的氧化還原電位隨著菌體的生長和纖維素的產(chǎn)生逐漸降低。腸桿菌FY-07不是只在培養(yǎng)基表面產(chǎn)生細(xì)菌纖維素，并逐漸形成纖維素膜的；而是在整個培養(yǎng)體系中產(chǎn)生細(xì)菌纖維素，形成果凍狀細(xì)菌纖維素水合物，之后隨著纖維素中氣體含量的增加改變了它的比重，逐漸漂浮到液面形成了纖維素膜。這使得利用靜態(tài)液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)細(xì)菌纖維素成為可倉泛。
權(quán)利要求
1.一種腸桿菌(Enterobacter sp. ) FY-07菌株,保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，分類命名為腸桿菌Enterobacter sp.,保藏號為CGMCC No. 6103。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的菌株，其特征在于 所述的腸桿菌FY-07菌落特征在LB瓊脂(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂粉20g/L)平板上30° C培養(yǎng)24h即可長出白色、圓形菌落，菌落呈顆粒狀，邊緣規(guī)則，大小直徑I 2mm，與培養(yǎng)基接觸不緊密； 腸桿菌FY-07菌株的形態(tài)特征革蘭氏染色陰性，菌體呈短桿狀，大小0.5 I.O μ mX I. 0^2. 5 μ m,不形成芽孢； 腸桿菌FY-07菌株生理生化特征生長溫度15 40°C，生長pH范圍5 12，NaCl耐受性0^5% ;接觸酶，檸檬酸鹽利用，吲哚產(chǎn)生，硝酸鹽還原實驗均為陽性；V.P.，淀粉水解，甲基紅，亞硝酸鹽還原實驗為陰性；葡萄糖發(fā)酵為氧化型；對氧的需求為兼性厭氧型。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的菌株，其特征在于所述的腸桿菌FY-07的16SrDNA序列如SEQ ID No. I 所示。
4.一種使用權(quán)利要求I所述菌株生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，其特征在于該方法在以 I 3g/L 的 NH4NO3,0. 5 I. 5g/L 的 KH2PO4,0. 3 O. 7g/L 的 K2HPO4 · 3Η20，0· 2 O. 5g/L 的MgSO4 ·7Η20，0. Γ0. 3g/L的MnCl2和l(T50g/L葡萄糖組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行靜態(tài)液體深層發(fā)酵，并采用預(yù)處理、堿處理、水洗和干燥，從發(fā)酵終產(chǎn)物中提取制得細(xì)菌纖維素，具體工藝步驟是 第一、以無菌水將原始菌種從一個或多個斜面上洗下，直接接入含有萬分之一纖維素酶的LB培養(yǎng)基中，好氧發(fā)酵培養(yǎng)制成一級種子液；所述的LB培養(yǎng)基的組成包括蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L, NaCl 5g/L,以蒸懼水配制； 第二、將上步培養(yǎng)的一級種子液以5%的接種量接入二級種子培養(yǎng)基中進(jìn)行好氧發(fā)酵培養(yǎng)，制成二級種子液；其中二級種子培養(yǎng)基的組成包括l 3g/L的NH4NO3,0. 5 I. 5g/L的 KH2PO4,0. 3 O. 7g/L 的 K2HPO4 · 3H20,0. 2 O. 5g/L 的 MgSO4 · 7H20,0. Γθ. 3g/L 的 MnCl2 和5^20g/L的葡萄糖，以蒸餾水配制； 第三、將第二步制成的二級種子液以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行靜態(tài)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素；其中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成包括3g/L的NH4NO3,0. 5 I. 5g/L的KH2PO4,0. 3 0. 7g/L 的 K2HPO4 · 3Η20，0· 2 0. 5g/L 的 MgSO4 · 7Η20，0· Γθ. 3g/L 的 MnCl2 和l(T50g/L的葡萄糖，以蒸餾水配制； 第四、將第三步中獲得的發(fā)酵產(chǎn)物，依次經(jīng)過預(yù)處理、堿處理、水洗和干燥的后提取處理工藝得到細(xì)菌纖維素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，第四步所述的后提取處理工藝的具體操作過程是 預(yù)處理用水洗方法去除細(xì)菌纖維素水合物中大部分未與纖維素結(jié)合的菌體及其碎片等雜質(zhì)； 堿處理用0. lmol/L的NaOH溶液于80°C條件下浸泡2h，除去纖維素水合物中的菌體和殘留培養(yǎng)基； 水洗用蒸餾水多次沖洗，直至纖維素水合物的PH值近7. O ； 干燥最后將纖維素水合物風(fēng)干或真空干燥，即制得細(xì)菌纖維素。
全文摘要
一株腸桿菌FY-07及靜態(tài)液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。本發(fā)明菌株是從油田采出液中分離馴化得到，其分類命名為腸桿菌Enterobacter sp.，其保藏號為CGMCC No.6103。該菌可在普通牛肉汁、LB、營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，也可在含糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長并產(chǎn)生細(xì)菌纖維素。本發(fā)明提供的FY-07菌株在20~35℃溫度條件下，能夠在含糖或不含糖的無機(jī)鹽和水的無菌培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生細(xì)菌纖維素，其纖維素產(chǎn)量可以達(dá)到5.17~10.32g/L，且其纖維素產(chǎn)量不受培養(yǎng)體系的裝液量和氧化還原電位影響。利用本發(fā)明提供的FY-07菌株可以實現(xiàn)靜態(tài)液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。
文檔編號C12P19/04GK102690773SQ201210201168
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者李國強(qiáng), 王晶紅, 紀(jì)凱華, 趙倩倩, 馬挺 申請人:南開大學(xué)