專利名稱：與冠心病易感性關(guān)聯(lián)的易感區(qū)域chr4q32的單核苷酸多態(tài)性位點及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與疾病易感性相關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點，特別涉及一種與冠心病易感性關(guān)聯(lián)的易感區(qū)域Chr4q32的單核苷酸多態(tài)性位點及其在評估冠心病易感性中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
動脈粥樣硬化性心腦血管病已成為世界范圍關(guān)注的主要健康問題。2004年的世界衛(wèi)生組織(WHO)報告顯示，全世界每年心血管疾病以冠心病和腦卒中為主導(dǎo)致的死亡人數(shù)達高達1720萬，占所有死亡人數(shù)的三分之一。預(yù)計2020年這一數(shù)字將進一步增加50%， 高達2500萬，心血管疾病是全球人類的“頭號殺手”。在中國進行的一項大規(guī)模前瞻性研究也顯示，心臟疾病已經(jīng)成為中國人群的主要死亡原因，分列男、女性死亡原因的第2位和第I位。我國每年新發(fā)心肌梗死50萬人，隨著生活方式的改變以及動脈粥樣硬化相關(guān)的危險因素持續(xù)增加，冠心病與心肌梗死發(fā)病也還將呈持續(xù)上升趨勢。大量的研究資料表明，冠心病是一種復(fù)雜疾病，是由多個微效基因與環(huán)境因素長期相互作用所致。因此鑒定出與冠心病相關(guān)的易感基因或致病基因，在人群中進一步篩選增加疾病風(fēng)險的易感基因確定易感個體，將有助于冠心病的發(fā)病風(fēng)險預(yù)測、新藥開發(fā)、診斷和個體化治療。從基礎(chǔ)到臨床，人們對此進行了大量的研究，并在冠心病的危險因素和冠心病發(fā)生的病理生理學(xué)方面積累了大量的知識，但是關(guān)于冠心病與心肌梗死發(fā)生的確切遺傳分子機制卻知之甚少，對于怎樣鑒定遺傳易感基因以及鑒定受試者的冠心病遺傳易感性，一直缺乏全面系統(tǒng)有效的識別方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實施例的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一系列與冠心病易感性顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(SNP, single nucleotide polymorphism)),并找出其中與冠心病易感性關(guān)聯(lián)最顯著的代表性位點，繼而提供將所述單核苷酸多態(tài)性位點用于評估冠心病易感性的用途。為了實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是第一方面，提供一系列與冠心病易感性顯著相關(guān)的易感區(qū)域chr4q32的單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)。在中國漢族人群中選取1515例冠心病患者和5019例正常人為研究對象，使用全基因組芯片(Affymetrix Axiom Genome-Wide CHB I Array Plate)芯片對全基因組范圍內(nèi)SNP進行基因分型。利用芯片得到的數(shù)據(jù)，評價基因型和表型的關(guān)聯(lián)關(guān)系，從而得到可能與冠心病之間存在潛在關(guān)聯(lián)的區(qū)域是在染色體4q32上的⑶CY1A3-GUCY1B3基因區(qū)域的下游，與冠心病易感性顯著關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點是位于該區(qū)域的一系列單核苷酸多態(tài)性位點，為rs2625269，等位基因為A/G ;rsl976041，等位基因為A/G ；rsl905261,等位基因為A/C ；rsl905262,等位基因為A/T ；rs2705455,等位基因為G/A ;rsl483041，等位基因為A/G ;rs2200168，等位基因為C/T ;rs716428，等位基因為C/T ;rs990619，等位基因為G/C ；rsl842896,等位基因為G/T ；rs2625245,等位基因為A/G ；rsll23037,等位基因為 A/T。第二方面,使用logistic回歸分析評估每個SNP位點與冠心病的關(guān)系,計算危險等位基因的相對危險度(Odds ratio, OR)和95%的可信區(qū)間，得到這一系列SNP位點的危險等位基因分別是rs2625269多態(tài)性位點為A，rsl976041多態(tài)性位點為G，rsl905261多態(tài)性位點為A，rsl905262多態(tài)性位點為A，rs2705455多態(tài)性位點為G，rsl483041多態(tài)性位點為A，rs2200168多態(tài)性位點為C，rs716428多態(tài)性位點為C，rs990619多態(tài)性位點為G，rsl842896多態(tài)性位點為T，rs2625245多態(tài)性位點為G，rsl 123037多態(tài)性位點為T。第三方面，選擇chr4q32區(qū)域代表位點rsl842896,在數(shù)據(jù)分析中使用Haploview軟件計算染色體區(qū)域位點間的連鎖不平衡(Linkage disequilibrium, LD)情況。該區(qū)域 rsl842896 多態(tài)性位點與 rs2625269，rsl976041, rsl905261, rsl905262, rs2705455,rsl483041,rs2200168, rs716428, rs990619, rs2625245, rsll23037,具有強的連鎖不平衡。同時使用 FludigmOEPl 基因分析系統(tǒng)(FludigmOEPl tmGENETIC ANALYSIS system), Taqman、MGB探針法進行基因分型，進一步在15460例冠心病患者和11472例對照樣本中驗證，合并所有16975例病例和16491對照樣本分析顯示rsl842896與冠心病的關(guān)聯(lián)更加顯著，這一結(jié)果進一步證實了 chr4q32區(qū)域多態(tài)位點與冠心病密切相關(guān)。第四方面，根據(jù)上述與冠心病易感性顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點，構(gòu)建單體型(haplotype)比較其在患者和正常對照之間的頻率差異，用以評估冠心病易感性。本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是根據(jù)本發(fā)明染色體4q32由一段鄰近⑶CY1A3-GUCY1B3基因區(qū)域下游的SNP位點以及由一系列SNP位點組成的單體型的變異特性判斷冠心病易感人群的方法，可以對未出現(xiàn)冠心病早期臨床癥狀的人群，尤其具有傳統(tǒng)危險因素的冠心病高危人群，進行無創(chuàng)快速簡便的篩查，早期發(fā)現(xiàn)冠心病易感對象，并采取相應(yīng)的保健措施，降低冠心病與心肌梗死的發(fā)病率。根據(jù)本發(fā)明也可以為研發(fā)針對性的冠心病基因治療提供了科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明為進一步檢測基因表達調(diào)控、蛋白功能，深入研究冠心病的致病機制，開發(fā)新型治療藥物和基因治療，實現(xiàn)基于遺傳學(xué)背景的個體化診療奠定了重要基礎(chǔ)，并帶來重要的醫(yī)學(xué)健康效益和經(jīng)濟效益。


圖I為實施例I中所確定的chr4q32區(qū)域SNP位點與冠心病的關(guān)聯(lián)圖。圖2為在實施例2的重復(fù)驗證階段的檢測中，其中96個樣本(94個待測樣本及2個陰性對照)的代表位點rsl842896基因分型結(jié)果聚類圖；圖3 為應(yīng)用 SNP Genotyping Analysis softgware version 3.0 軟件對圖 2 所述的96個樣本(94個待測樣本及2個陰性對照)的代表位點rsl842896進行基因分型的截圖；圖4為圖2所述的96個樣本(94個待測樣本及2個陰性對照)代表位點rsl842896基因分型結(jié)果導(dǎo)出數(shù)據(jù)的截圖。
圖I中橫坐標(biāo)“Position on chr”為染色體上的位置(單位Mb);縱坐標(biāo)為單核苷酸多態(tài)性位點與冠心病的關(guān)聯(lián)顯著性P值(-IoglO (p-value)),右側(cè)Recombination rate為重組率，單位(CM/Mb);代表位點rsl842896以 表示。圖2中X軸代表VIC熒光強度，Y軸代表FAM熒光；基因型結(jié)果紅色I為G/G純合子，綠色2為T/T純合子，藍色3為G/T雜合子，黑色4為陰性對照(NTC)。其中橫坐標(biāo)X :Allele為等位基因，VIC-MGB代表VIC熒光標(biāo)記MGB探針；縱坐標(biāo)
Y=Allele為等位基因，F(xiàn)AM-MGB為FAM熒光標(biāo)記MGB探針；上方表示SNP位點、call rate為這張芯片上該位點檢出率、Auto Confidence為軟件給出的自動判別基因型的可信度；下方Chip Run Name為實驗中采用的EPl芯片名稱。
具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述。實施例I確定與冠心病易感性顯著關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點、等位基因及其危險等位基因一、方法首先在中國漢族人群中選取1515例冠心病患者和5019例正常人為研究對象。使用 Affymetrix 公司的全基因組芯片(Affymetrix Axiom Genome-ffide CHB I ArrayPlate)由上海交通大學(xué)BIO-X中心檢測。獲得1515例冠心病患者和5019例正常人全基因組芯片SNP的基因型數(shù)據(jù)。通過全基因組關(guān)聯(lián)(GWAS)分析計算獲得SNP芯片中每個位點與冠心病關(guān)聯(lián)顯著性水平(P值)，按照顯著性水平(P值小于0. 001)找出與冠心病之間存在潛在關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域，并得到冠心病易感性顯著關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點及其等位基因。統(tǒng)計分析時采用plink軟件進行l(wèi)ogistic回歸分析評估每個SNP位點與冠心病關(guān)聯(lián)的顯著性，計算危險等位基因的相對危險度(Odds ratio, OR)和95%的可信區(qū)間，分析中直接獲得OR值、可信區(qū)間和P值，從而得到所述位點的危險等位基因。二、病例和對照樣本入選標(biāo)準(zhǔn)冠心病病例包括心肌梗死患者和心絞痛患者，心肌梗死病例的入選診斷標(biāo)準(zhǔn)為急性心肌梗塞診斷標(biāo)準(zhǔn)(根據(jù)WHO 1979年的診斷標(biāo)準(zhǔn)):即典型胸痛癥狀持續(xù)30分鐘以上；心電圖連續(xù)2個導(dǎo)聯(lián)ST段抬高(肢體導(dǎo)聯(lián)0. Imv,胸導(dǎo)聯(lián)0. 2mv)并有系列動態(tài)變化；心肌壞死的血清標(biāo)記物濃度升高，如肌鈣蛋白(TNT/TNI)升高，心肌同工酶(CK-MB)升高大于正常值高限的2倍。心絞痛病例的入選診斷標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)冠脈造影發(fā)現(xiàn)冠狀動脈至少一個主要分支狹窄超過70%。經(jīng)各項檢查除外心臟瓣膜疾病、先天性心臟病、心力衰竭、嚴(yán)重的腎臟及肝臟疾病、繼發(fā)性高血壓、心肌病、家族性高膽固醇血癥及可疑冠心病患者。對照組入選標(biāo)準(zhǔn)既往無冠心病或其他動脈粥樣硬化病史，無胸痛、胸悶等心臟病癥狀，心電圖無明顯缺血性改變。病例組和對照組均為中國漢族人，且無血緣關(guān)系。三、測試人群的基本特征測試人群為芯片檢測樣本其基本特征如表I所示表I :
權(quán)利要求
1.與冠心病易感性關(guān)聯(lián)的易感區(qū)域chr4q32的單核苷酸多態(tài)性位點,所述單核苷酸多態(tài)性位點是位于染色體4q32上的GUCY1A3-GUCY1B3基因區(qū)域下游的一系列單核苷酸多態(tài)性位點，為rs2625269，等位基因為A/G ;rsl976041，等位基因為A/G ;rsl905261，等位基因為A/C ；rsl905262,等位基因為A/T ；rs2705455,等位基因為G/A ;rsl483041，等位基因為A/G ；rs2200168,等位基因為C/T ；rs716428,等位基因為C/T ；rs990619,等位基因為G/C ；rsl842896，等位基因為G/T ;rs2625245，等位基因為A/G ;rsll23037，等位基因為A/T。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單核苷酸多態(tài)性位點，其中所述的一系列SNP位點的危險等位基因分別是rs2625269多態(tài)性位點為A，rsl976041多態(tài)性位點為G，rsl905261多態(tài)性位點為A，rsl905262多態(tài)性位點為A，rs2705455多態(tài)性位點為G，rsl483041多態(tài)性位點為A，rs2200168多態(tài)性位點為C，rs716428多態(tài)性位點為C，rs990619多態(tài)性位點為G，rsl842896多態(tài)性位點為T，rs2625245多態(tài)性位點為G，rsl 123037多態(tài)性位點為T。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的單核苷酸多態(tài)性位點，其中與冠心病易感性關(guān)聯(lián)最顯著 的代表性單核苷酸多態(tài)性位點是rsl842896。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的單核苷酸多態(tài)性位點用于評估冠心病易感性的用途，其特征在于，所述冠心病包括心肌梗死和心絞痛。
全文摘要
本發(fā)明公開了與疾病易感性相關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點，特別涉及一種與冠心病易感性關(guān)聯(lián)的易感區(qū)域chr4q32的單核苷酸多態(tài)性位點及其在評估冠心病易感性中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述單核苷酸多態(tài)性位點是位于染色體4q32上的GUCY1A3-GUCY1B3基因區(qū)域下游的一系列單核苷酸多態(tài)性位點，為rs2625269，rs1976041，rs1905261，rs1905262，rs2705455，rs1483041，rs2200168，rs716428，rs990619，rs1842896，rs2625245，rs1123037。根據(jù)本發(fā)明染色體4q32由一段鄰近GUCY1A3-GUCY1B3基因區(qū)域下游的SNP位點以及由一系列SNP位點組成的單體型的變異特性判斷冠心病易感人群的方法，可以對未出現(xiàn)冠心病早期臨床癥狀的人群，尤其具有傳統(tǒng)危險因素的冠心病高危人群，進行無創(chuàng)快速簡便的篩查，早期發(fā)現(xiàn)冠心病易感對象，并采取相應(yīng)的保健措施，降低冠心病與心肌梗死的發(fā)病率。
文檔編號C12Q1/68GK102747076SQ20121020146
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者李宏帆, 李建新, 王來元, 顧東風(fēng), 魯向鋒, 黃建鳳 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院